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应用siRNA抑制神经胶质瘤C6细胞受体表达的探讨
目的构建编码大鼠血管紧张素Ⅱ受体基因mRNA的短发夹RNA真核表达载体质粒,研究体外培养的哺乳细胞中siRNA抑制靶基因表达的有效性,为利用基因沉默技术从转录后水平进行高血压治疗的研究做准备.方法根据大鼠AT1受体mRNA序列设计并合成siRNA寡核苷酸片段,退火形成双链并克隆进入载体pGenesil-1.用构建完成的pGenesil-1-siRNA质粒和重新洗牌的对照质粒转染大鼠胶质瘤细胞,并在不同时相收集转染的细胞,进行RT-PCR和Western blot检测.结果 AT1R基因短发夹RNA抑制大鼠血管紧张素Ⅱ受体mRNA基因及其蛋白的结果类似.与对照组比较(100%),在转染后48 h血管紧张素Ⅱ受体mRNA基因水平下降到35.5%±3.0%,72 h后达到低点(20.7%±4.0%).而与对照组相比,血管紧张素Ⅱ受体蛋白在24 h和48 h分别减少至46.9%±4.2% 和37.0%±3.7%,大减少在转染后72 h(28.1%±4.0%).结论成功地构建了编码大鼠血管紧张素Ⅱ受体mRNA的短发夹RNA真核表达载体后,在体外转染哺乳细胞中表达siRNA可有效地抑制靶基因的表达,并导致其蛋白的翻译受到抑制,达到基因干扰的目的.为利用RNAi从转录后水平对心血管疾病进行治疗做有益的探索,为进一步研究基因沉默在自发性高血压大鼠的降压治疗研究奠定了基础.
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长链非编码RNA MALAT1在大鼠急性缺血缺氧-再灌注肾损伤过程中的表达和作用
目的 研究急性缺血-再灌注肾损伤(acute ischemia reperfusion kidney injury ,AIKI)大鼠肾组织中长链非编码RNA(lncRNA)MALAT1的表达情况及其对急性肾衰的影响.方法 清洁级SD大鼠128只,采用数字表法随机分为对照组、模型组和实验组,模型组和实验组按国际标准建立大鼠AIKI模型,实验组每天注射MALAT1 siRNA(剂量为5 mg/kg) .分别于2 h 、24 h 、48 h 、72 h 、7 d和14 d处死( n＝6) ,采集肾组织样本,实时定量PCR法检测MALAT1的表达水平和分布;分别于48 h和72 h采集静脉血、尿液和肾组织,检测血清生化指标、尿量和尿液生化指标.结果 MALAT1在正常肾组织内主要表达于皮质区,急性肾损伤后表达显著增加,在第48 h达到峰值后逐渐下降.尾静脉注射MALAT1 siRNA后,MALAT1水平显著降低,血清尿素氮、肌酐、尿蛋白和尿酮体水平显著降低.结论 MALAT1在AIKI大鼠的肾脏组织中表达显著增加,活体水平MALAT1表达的下调对急性肾损伤有缓解作用.
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干扰Livin基因对人胆管癌QBC939细胞增殖影响的研究
目的 研究转染Livin反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide,ASODN)对人胆管癌细胞株QBC939细胞Livin mRNA及Livin蛋白表达以及细胞增殖的影响.方法 设计合成全硫代磷酸化修饰并5'端FITC荧光标记的Livin ASODN.用脂质体介导Livin ASODN转染QBC939细胞,荧光显微镜观察24 h Livin ASODN转染人细胞的情况,并计算转染率.MTT法检测Livin反义寡核苷酸对QBC939细胞增殖的抑制作用.RT-PCR和细胞免疫荧光化学分别检测转染后48 h Livin mRNA表达及Livin蛋白的变化.结果 500 mol/L ASODN转染后24 h可达到佳的转染效果;转染后60 h,能明显抑制胆管癌细胞的增殖.转染60 h后,RT-PCR及细胞免疫荧光化学检测分别显示Livin mRNA及Livin蛋白表达水平明显低于对照组(P<0.05).结论 脂质体介导转染Livin ASODN能特异性地抑制QBC939细胞中的Livin基因及Livin蛋白表达,抑制胆管癌QBC939细胞的增殖,降低癌细胞活力.
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幽门螺杆菌毒素相关蛋白A基因干扰细胞信息传导的机制
幽门螺杆菌(Hp)感染是慢性胃炎、消化性溃疡的主要诱因,Hp感染促进胃上皮的肠腺化生.但Hp感染与胃癌的关系尚未获得统一的认识.Hp感染与胃癌、胃黏膜相关性淋巴样组织淋巴瘤(MALT淋巴瘤)发生发展的相关机制是近年来研究的重点之一.尽管国内和日本及欧洲的多数流行病学研究均发现胃癌高发区人群中的Hp 抗体和毒素相关蛋白A (cagA)抗体均显著高于胃癌低发区；胃癌患者感染Hp的比例大约是无Hp感染的2倍.Watanabe等在蒙古沙土鼠用阈下剂量的亚硝胺和Hp组合能诱导发生胃腺癌.Newman 等在APC等位基因突变的小鼠(min/+)中感染Hp明显促进了大肠癌的发生率.在动物实验中仅用Hp感染除了能引起较严重的炎症反应外尚难建立胃腺癌的动物模型,表明仅Hp感染可能并不具有致癌性,提示Hp感染可能是多因素、多步骤参与胃癌发生过程中的重要促进因素之一.
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干预AQP4表达预防脑水肿及其DWI诊断的研究进展
脑水肿是缺血与出血性脑病、脑肿瘤和感染等疾病的严重并发症之一,近年来研究发现水通道蛋白4(AQP4)在脑水肿的形成过程及脑细胞内外水的平衡机制中起重要作用,AQP4表达上调与脑水肿的发生密切相关,干预AQP4的表达并用DWI检测可为脑水肿的临床诊断和治疗提供新的途径.
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AT1R shRNA重组腺病毒载体对SHR主动脉AT1R蛋白分布的影响
目的 利用靶向大鼠血管紧张素Ⅱ1型受体(AT1R)基因mRNA的短发夹RNA(shRNA)腺病毒载体,研究对在体自发性高血压大鼠(SHR)主动脉AT1R蛋白分布的影响.方法 重组腺病毒载体通过尾静脉注射法转染SHR,免疫组织化学法测定SHR主动脉AT1R表达.结果 AT1R的shRNA的重组腺病毒载体转染SHR,通过免疫组织化学法证实,大鼠主动脉的AT1R表达明显降低.结论 利用靶向大鼠AT1R 基因mRNA腺病毒载体,在体内环境下可以高效特异性抑制主动脉AT1R表达.
关键词： 基因干扰 自发性高血压大鼠 血管紧张素Ⅱ1型受体 重组腺病毒载体 短发夹RNA -
下调大鼠血管内皮细胞血管紧张素转换酶的实验研究
目的 构建腺病毒载体使其携带血管紧张素转换酶(ACE)基因短发夹RNA(shRNA),通过RNA干扰技术选择性地下调大鼠血管内皮细胞(ECs)ACE表达.方法 采用RT-PCR法从之前构建的真核表达载体p ACE-shRNA中扩增ACE-shRNA片段,扩增之后将ACE-shRNA片段克隆进pDC316穿梭质粒,再将293细胞被构建好的pDC316-ACE-shRNA穿梭质粒载体和pBH-Glox-E1,3Cre骨架病毒转染,进行病毒颗粒包装重组并进行滴度测定和纯化.随后进行原代培养大鼠血管ECs转染,通过实时荧光定量PCR法分别在转染前及转染后24 h、48 h、72 h通过实时荧光定量PCR法来检测ACE mRNA的表达.结果 高滴度的重组病毒被制备完成,携带ACE-shRNA的重组腺病毒载体经PCR检测、限制性内切酶和GFP表达证实构建成功,被转染24 h时大鼠血管ECsACE mRNA表达无统计学意义变化;但被转染48h时,ECsACE mRNA表达差异有统计学意义(P＜0.05);被转染后72h时表达更低.结论 实验成功构建重组腺病毒栽体并携带ACE-shRNA片段,同时证实shRNA可选择性下调原代培养大鼠血管ECs上ACE表达,可能为心血管病基因治疗和应用提供新思路.
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大鼠蛋白精氨酸甲基转移酶1短发夹RNA质粒体外RNA干扰及对Hcy、ADMA的影响
目的 探讨蛋白精氨酸甲基转移酶1短发夹RNA质粒(pPRMT1-shRNA)在体外对大鼠主动脉内皮细胞PRMT1基因mRNA表达水平及同型半胱氨酸(Hcy)、非对称性二甲基精氨酸(ADMA)水平的影响.方法 用pPRMT1-shRNA1、pPRMT1-shRNA2阳性质粒、阴性对照pHK质粒转染大鼠主动脉内皮细胞,同时设立空白对照组.转染12 h、24 h后分别收集各组细胞及细胞培养液,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分析各组PRMT1基因的mRNA表达情况,ELISA法检测各组细胞培养液中Hcy及ADMA含量.结果 空白对照组与阴性对照质粒组的PRMT1基因mRNA表达、Hcy、ADMA水平差异无统计学意义;PRMT1-shRNA两组与空白对照组、阴性对照质粒组比较PRMT1基因mRNA表达明显降低(P＜0.01),且Hcy、ADMA水平明显下降(P＜0.01);pPRMT1-shRNA1组比pPRMT1-shRNA2转染组、两组24 h比12 hPRMT1基因mRNA表达受抑更显著(P＜0.05),Hcy、ADMA水平下降更明显(P＜0.05).结论 随着PRMT1基因表达水平下降,Hcy、ADMA水平也随之降低.
关键词： 冠心病 蛋白精氨酸甲基转移酶1 基因干扰 同型半胱氨酸 非对称性二甲基精氨酸 -
编码大鼠PRMT1基因shRNA质粒的构建和鉴定
目的 研究蛋白精氨酸甲基转移酶1(PRMT1)基因表达的改变与血管内皮功能及动脉粥样硬化的关系.方法 构建PRMT1短发夹RNA(shRNA)质粒.在GenBank中查到大鼠PRMT1基因mRNA序列并输入siRNA网上设计软件OptiRNA中,选取两条靶序列,设计并合成编码shRNA序列的DNA单链,经退火连接后,与双酶切线性化处理回收的pGenesil-1质粒载体连接,用含卡那霉素抗性的LB平板筛选阳性克隆,小提质粒后行酶切鉴定并测序.结果 构建的大鼠PRMT1-shRNA质粒经酶切鉴定及测序与预期相符.结论 本研究结果为进一步研究基因干扰PRMT1基因对血浆同型半胱氨酸(Hcy)、非对称性二甲基精氨酸(ADMA)水平及血管内皮功能的影响奠定了基础.
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编码大鼠血管紧张素转换酶短发夹环RNA质粒的构建与鉴定
目的 构建编码大鼠ACEmRNA的shRNA真核表达载体质粒,为利用基因沉默技术从转录后水平进行高血压治疗的研究做准备.方法 根据大鼠ACE mRNA序列设计并合成shRNA寡核苷酸片段,退火形成双链并克隆进入载体pGenesil-1,并进行酶切鉴定和测序.结果 酶切证明构建的shRNA已插入载体,经测序证明与设计的相同,获得大鼠ACE的shRNA表达载体质粒.结论 构建的编码大鼠ACE mRNA的shRNA真核表达载体可进入哺乳动物细胞内表达短发夹RNA,经Dicer酶裂解成siRNA并降解靶基因mRNA,而达到基因干扰的作用.为利用其进行自发性高血压大鼠的降压治疗研究奠定了基础.
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RNA干扰技术下调大鼠血管紧张素Ⅱ1型受体
目的:研究RNA干扰技术对体内外大鼠血管紧张素Ⅱ1型受体(AT1R)基因的沉默作用.方法:人胚肾293细胞扩增Ad5-AT1R-shRNA-EGFP并感染体外培养的C6细胞株,进行RT-PCR和Western-blot检测AT1R mRNA和蛋白的表达.Ad5-AT1R-shRNA-EGFP尾静脉注射法转染SHR,免疫组织化学法测定SHR主要器官:心脏、肝脏、肾脏、肾上腺和主动脉AT1R表达. 结果:Ad5-AT1R-shRNA-EGFP显著抑制C6细胞AT1R mRNA及蛋白表达,并显著抑制SHR心脏、肝脏、肾脏、肾上腺、主动脉的AT1R表达.结论:靶向大鼠AT1R基因mRNA的短发夹RNA腺病毒载体,在体外和体内环境下高效特异性抑制靶基因的表达,能达到基因干扰目的.
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编码大鼠AT1-R mRNA的shRNA真核表达载体的构建
目的构建编码大鼠AT1-R mRNA的shRNA真核表达载体质粒,为利用基因沉默技术从转录后水平进行高血压治疗的研究做准备.方法根据大鼠AT1-R mRNA序列设计并合成shRNA寡核苷酸片段,退火形成双链并克隆进入载体pGenesil-1,并进行酶切鉴定和测序.结果酶切证明构建的shRNA已插入载体,经测序证明与设计的相同,获得大鼠AT1受体的shRNA表达载体质粒.结论构建的编码大鼠AT1-R mRNA的shRNA真核表达载体可进入哺乳细胞内表达短发夹RNA,经Dicer酶裂解成siRNA并降解靶基因mRNA,而达到基因干扰的作用.为利用其进行自发性高血压大鼠的降压治疗研究奠定了基础.
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基于慢病毒介导的SOCS1、PIAS1、PTPN22干扰对艾灸调控实验性RA家兔关节滑膜液EGF、FGF水平的影响
目的:基于慢病毒载体介导的RNAi在体阻断SOCS1、PIAS1、PTPN22在RA动物模型的表达,研究艾灸对实验性RA家兔关节滑膜液EGF、FGF含量的影响及其SOCS1、PIAS1、PTPN22调控机制.方法:日本大耳白兔36只,随机分为空白对照组、RA模型组、艾灸治疗组、艾灸+SOCS1基因干扰组、艾灸+PTPN22基因干扰组、艾灸+ PIAS1基因干扰组,6只动物/组.按0.5 mL/kg体质量剂量,将福氏完全佐剂平均注入模型组、艾灸各组动物的双后膝关节腔内(对照组动物同法注入无菌生理盐水作为对照),运用慢病毒介导的SOCS1、PTPN22、PIAS1RNAi作为干预手段,麦粒灸“肾俞”、“足三里”穴治疗实验性RA(5壮/(穴·天),6 d1个疗程,共治疗3个疗程,疗程之间休息1d).ELISA法测定艾灸对关节滑膜液EGF、FGF含量的影响.结果:与对照组比较,模型组EGF、FGF含量显著升高(P＜0.01);与模型组比较,艾灸组EGF、FGF含量显著降低(P＜0.01);SOCS1干扰组、PTPN22干扰组、PIAS1干扰组与艾灸组比较,下调EGF、FGF含量效果不及艾灸组(P＜0.05).结论:艾灸“肾俞”、“足三里”穴可显著降低实验性RA家兔滑膜液相关细胞因子EGF、FGF的含量,但在SOCS1、PTPN22、PIAS1被干扰的情况下其作用显著降低,提示SOCS1、PTPN22、PIAS1对JAK-STAT信号通路的负反馈调控可能与艾灸抑制实验性RA滑膜细胞的异常分泌功能密切关联.
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基因干扰机制及其在细胞信号转导中的应用
基因干扰是一种新兴的基因阻断技术,是外源和内源性双链RNA在细胞内使特异性序列的基因表达受抑.基因干扰技术能高效特异的阻断基因的表达,可以确定复杂的信号传导途径中不同基因的上下游关系,是研究信号转导通路的有力工具.基因干扰技术可有效抑制目的基因表达mRNA以及蛋白质产物,其可以简便、特异、高效、稳定地下调目的基因的表达,亦可在不影响其他物质的情况下,剔除目的基因.基凼下扰技术比以前用于基因功能研究和应用的各种方法更优秀,但基因十扰技术对于哺乳动物细胞株的转染效率低;哺乳动物细胞中对双链RNA或小干扰RNA的导入会产生拮抗作用等方面亦有待改进.将有效且具高度安伞性的小干扰RNA用于医疗,前景令人期待.
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干扰foxM1基因表达可增强骨髓间充质干细胞的成骨分化能力
背景:foxM1基因被认为参与了干细胞分化命运的调控,但其对间充质干细胞成骨分化的影响尚未见报道,关于foxM1基因的研究也主要集中于肿瘤领域.目的:探索干扰foxM1基因表达水平对骨髓间充质干细胞成骨分化能力的影响.方法:全骨髓贴壁法培养SD大鼠(中山大学实验动物中心提供)骨髓间充质干细胞,构建含嘌呤霉素抗性基因的foxM1 shRNA重组慢病毒载体并转染大鼠骨髓间充质干细胞,经嘌呤霉素筛选建立foxM1稳定敲低细胞株,另设置空病毒载体组以及未转染组.使用骨髓间充质干细胞成骨诱导分化培养基诱导培养并行茜素红染色检测其成骨分化能力,使用定量RT-PCR检测成骨相关基因的表达水平,同时提取胞核蛋白,Western blot检测β-catenin蛋白表达水平.结果与结论:①与空病毒载体组以及未转染组比较,foxM1敲低的大鼠骨髓间充质干细胞经成骨诱导分化后形成的骨结节数量明显增多,成骨相关基因col1a1和runx2表达水平均显著升高,但胞核β-catenin蛋白水平无明显改变;②干扰foxM1基因表达可增强骨髓间充质干细胞的成骨能力.
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RNAi特异性抑制A20基因对H2O2诱导人脐动脉血管平滑肌细胞增殖的影响
背景:锌指蛋白A20是近年来细胞内源性保护机制研究的新靶点,目前研究表明锌指蛋白A20抑制肿瘤坏死因子,脂多糖等多种炎性细胞因子诱导核因子κB信号通路激活所引起的血管平滑肌细胞增殖,但有关A20抗细胞氧化损伤方面的影响报道甚少.目的:观察锌指蛋白A20基因干扰对H2O2诱导的人脐动脉血管平滑肌细胞增殖和细胞核中核因子κB表达的影响及可能的分子生物学机制.设计、时间及地点:随机对照实验,于2007-03/2008-06在大连医科大学附属第二医院中心实验室完成.材料:体外培养人脐动脉血管平滑肌细胞,构建针对Genbank中人A20的基因序列,采用脂质体LipofectamineTM2000介导80pmol siRNA,6 μL转染.方法:将培养的第4代人脐动脉血管平滑肌细胞随机分6组,①空白组:培养基培养,未给与任何干预.②A20siRNA组:转染A20siRNA24 h.③scramble siRNA组:转染阴性对照scramble siRNA 24 h.④H2O2组:H2O2持续刺激6 h.⑤H2O2 +A20siRNA组:转染A20siRNA24h后H2O2持续刺激6h.⑥H2O2+scramble siRNA组:转染阴性对照scramble siRNA 24 h后H2O2持续刺激6 h.主要观察指标:以RT-PCR,Western-blotting检测A20基因表达变化,以四甲基偶氮唑蓝方法测定细胞增殖活性,以流式细胞技术观察血管平滑肌细胞细胞周期的变化,以Western-blotting检测细胞核中核因子κB p65的蛋白含量表达.结果:H2O2组细胞增殖率明显高于空白组,但低于H2O2+A20siRNA组(P＜0.05).H2O2组S期、G2/M期构成百分比,增殖指数均较空白组明显升高,然而较H2O2+A20siRNA组明显降低(P＜0.05),空白组A20mRNA与蛋白有微弱表达,A20siRNA组较空白组表达减少(P＜0.05);H2O2组A20mRNA与蛋白表达明显高于空白组但显著低于H2O2+A20siRNA组(P＜0.05)干扰效率大约55%.细胞核中核因子κB p65有少量表达:A20siRNA干扰后核因子κ B p65含量明显增加;H2O2刺激后核因子κ B p65表达含量显著增加但明显低于H2O2+A20siRNA组(P＜0.05).结论:A20基因可抑制H2O2损伤诱导的血管平滑肌细胞的增殖,其分子机制可能通过其负反馈抑制了核因子κ B介导的信号转导途径.
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Cx43基因干扰对鼠胎肝干细胞培养的优化效应
背景：胎肝干细胞具有分化成肝细胞、胆管细胞的潜能，参与肝脏的修复与重建，是肝细胞的重要来源，但是人体的胎肝干细胞含量极少，如何获取一定数量和较高纯度的胎肝干细胞是目前研究的热点。目的：构建能有效抑制大鼠胎肝干细胞Cx43基因表达的siRNA载体，探讨抑制 Cx43表达对体外培养的鼠胎肝干细胞增殖及细胞周期的影响。方法：体外培养鼠胎肝干细胞，设计及合成靶向 Cx43的 siRNA 序列(Cx43-siRNA)以及阴性对照序列(NC-siRNA)，采用电转法转染大鼠胎肝干细胞，即为实验组和对照组，未转染的胎肝干细胞为空白组。应用real-time PCR和Western blot法检测转染前后鼠胎肝干细胞Cx43基因和蛋白的表达；细胞生长曲线、CCK-8法观察细胞生长增殖情况；流式细胞术测定细胞周期分布的变化。结果与结论：转染Cx43-siRNA后，实验组与对照组、空白组相比Cx43基因和蛋白水平表达均明显降低，细胞的生长速度明显增快，G 0/G 1期细胞减少，S期细胞数增多，差异有显著性意义(P <0.05)，结果表明通过电转法转染靶向Cx43的siRNA能促进体外培养的鼠胎肝干细胞增殖，对其培养有优化作用。
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长链非编码RNA linc00152在急性肾衰大鼠肾组织中表达及影响
目的 探讨急性肾衰大鼠肾组织中长链非编码RNA linc00152的表达情况及其对急性肾衰的影响.方法 选取雄性SD大鼠72只,采用随机数字表法分为对照组(n=6)与模型组(n=66).模型组建立庆大霉素诱导的急性肾衰大鼠模型,对照组注射同体积生理盐水.采用实时定量聚合酶链式反应(PCR)法检测对照组及分别于第1、3、7、14、21天自模型组选取的6只大鼠肾组织中血清尿素氮、肌酐、尿N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶含量以及linc00152的表达、分布情况.将剩余36只模型组大鼠分为生理盐水组(n=12)、1 mg/kg siRNA组(n=12)及2 mg/kg siRNA组(n=12).1 mg/kg siRNA组与2 mg/kg siR-NA组分别尾静脉注射1 mg/kg、2 mg/kg linc00152-siRNA以达到活体水平阻断linc00152表达的目的,生理盐水组注射等体积生理盐水,分别于阻断后24、72 h检测linc00152表达水平、血清生化指标及尿液成分.结果 模型组第1天血清尿素氮、肌酐、尿N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶含量显著上升,第3天继续上升,第7天达到峰值,第21天基本恢复至正常水平.正常大鼠肾组织中linc00152主要表达于皮质;模型组linc00152表达在皮质和髓质中均为第1天显著上升,第3天继续上升,第7天达到峰值,第21天基本恢复至正常水平,其中,皮质中linc00152水平变化幅度更明显.1 mg/kg、2 mg/kg linc00152-siRNA干预后24 h,急性肾衰大鼠肾皮质中linc00152表达水平分别下降约40%、70%;1 mg/kg、2 mg/kg linc00152-siRNA干预后72 h,急性肾衰大鼠肾皮质中linc00152表达水平分别下降约50%、80%.1 mg/kg、2 mg/kg linc00152-siRNA干预后24、72 h,急性肾衰大鼠血清总蛋白、白蛋白、尿素氮、肌酐、K+、尿蛋白及尿酮体水平均较生理盐水组显著降低,Na+水平均较生理盐水组显著升高,组间比较,差异均有统计学意义(P<0.05);2 mg/kg linc00152-siRNA干预后24、72 h,急性肾衰大鼠血清总蛋白、白蛋白、尿素氮、肌酐、K+、尿蛋白及尿酮体水平较1 mg/kg siRNA组显著降低,Na+水平较1 mg/kg siRNA组显著升高,组间比较,差异均有统计学意义(P<0.05).结论 linc00152在庆大霉素诱导的急性肾衰大鼠的肾组织中表达显著增加,活体水平阻断linc00152的表达对急性肾损伤有防治作用.
关键词： 长链非编码RNA linc00152 急性肾衰 基因干扰 -
长链非编码RNA肺腺癌转移相关转录本1在大鼠急性缺血缺氧再灌注肾损伤过程中表达与作用
目的 探讨急性缺血再灌注肾损伤(AIKI)大鼠肾组织中长链非编码RNA肺腺癌转移相关转录本1(MALAT1)的表达情况及其对急性肾衰竭的影响.方法 选取清洁级雄性SD大鼠128只为研究对象,随机分为对照组(n=40)、模型组(n=44)与实验组(n=44).其中,模型组与实验组均按照国际标准建立大鼠AIKI模型,实验组每天注射MALAT1 siRNA.分别于2、24、48、72 h及7、14 d各处死6只大鼠,采集肾组织样本,实时定量PCR法检测MALAT1的表达水平;分别于48、72 h检测血清生化指标.结果 急性肾损伤后,MALAT1表达显著增加,达到峰值后逐渐下降.尾静脉注射MALAT1 siRNA后,MALAT1、血清尿素氮、肌酐水平显著降低.结论 MALAT1在AIKI大鼠的肾组织中表达显著增加,活体水平MALAT1表达的下调对急性肾损伤有缓解作用.
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IRF3基因干扰对LPS刺激原代枯否细胞早期细胞因子分泌动态变化的影响
目的：探讨干扰素调节因子3（Interferon regulator factor 3，IRF3）shRNA腺病毒对脂多糖（Lipopolysaccharide， LPS）刺激枯否细胞（Kupffer cell，KC）早期细胞因子分泌动态变化的影响。方法：采用在体灌注分离培养大鼠原代KC，以IRF3 shRNA腺病毒体外感染KC，48 h后采用LPS刺激细胞，于0、2、4和6 h收集细胞培养上清液，并收集6 h细胞。上清液细胞因子的分泌采用ELISA分析；细胞IRF3基因表达采用RT-PCR和Western blot方法检测。结果：LPS刺激诱导了KC内IRF3 mRNA和蛋白质表达升高，IRF3 shRNA腺病毒的应用抑制了LPS刺激诱导和非刺激组成性IRF3 mRNA和蛋白质的表达；KC受LPS刺激活化后极早期（2 h）IFN-β分泌即上升，4 h达峰值，6 h分泌水平开始下降，但仍维持于高水平。干扰腺病毒的应用抑制了LPS刺激后各时间点IFN-β的分泌，抑制分泌高峰的出现，并使6 h分泌水平趋于正常；KC活化后极早期即分泌大量TNF-α，并于2 h内达到峰值，随后分泌逐渐下降，但6 h仍维持于高水平。干扰腺病毒的应用抑制了LPS刺激各时间点TNF-α的分泌，并抑制了分泌高峰的出现；IL-1β分泌增高出现于LPS刺激4 h后，6 h分泌水平达更高值。干扰腺病毒的应用抑制了LPS刺激早期KC对IL-1β的分泌；KC受LPS刺激活化后极早期IL-10分泌即上升，且随着LPS刺激时间延长，其分泌水平逐渐增加。 IRF3 shRNA腺病毒的应用促进了LPS刺激后早期各时间点IL-10的分泌。结论：IRF3 shRNA腺病毒可使原代枯否细胞IRF3基因表达沉默；在LPS刺激原代KC，IRF3可促进其下游信号分子IFN-β、前炎细胞因子TNF-α和IL-1β的分泌，并抑制抑炎细胞因子IL-10分泌。因此，IRF3可能在肝组织免疫炎症性损伤的发生中起中心作用。
