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肝脏神经内分泌区室的研究进展
肝脏的祖细胞和肝脏星状细胞都具有神经内分泌的特征.祖细胞表达嗜铬粒蛋白-A、神经细胞黏附分子、甲状旁腺素相关肽、S-100蛋白、神经营养因子和其受体,肝脏星状细胞表达突触素、胶质纤维酸性蛋白、神经细胞黏附分子、nestin、神经营养因子和其受体.这种表型提示,这些细胞类型形成了可能受控于中枢神经系统的肝脏神经内分泌区室.我们证明了副交感神经系统促进了肝脏损伤后的祖细胞伸展,而去神经的移植肝脏和肝炎肝脏,其祖细胞数量都较原本的完全神经支配的肝脏为少,解释再生和瘢痕形成的神经控制机制是非常重要的.而且,对于再生机制的深入认识可能具有治疗学上的意义,甚至可能避免原位肝脏移植的必要.
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外源性前列腺素E1对血吸虫病家兔肝脏血小板衍生生长因子B及其受体表达的影响
目的探讨外源性前列腺素E 1(PGE 1)对血吸虫病家兔肝脏血小板衍生生长因子B(PDGF-B)及其受体表达的影响.方法 14只血吸虫病纤维化家兔模型,其中7只家兔在感染后60 d开始给予PGE 1(2.5 μg/kg·d-1)至120 d.RT-PCR、Western blot和免疫组化分别检测肝组织PDGF-B mRNA、PDGFR-β蛋白和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达.原位杂交观察内源性干扰素(IFN)γ水平.结果纤维化形成过程中HSCs活化,PDGF-B mRNA以及PDGFR-β蛋白水平增高.外源性PGE 1治疗后PDGF mRNA和受体β蛋白表达的增高趋势都受到明显抑制(与模型组比较分别为29.42±5.05和41.37±7.23, P <0.01;0.21±0.11和0.46±0.07, P <0.01).α-SMA表达强阳性视野从68下降到 10个;而内源性IFN-γ积分光密度从0.105±0.024升高到0.438±0.076( P <0.01).结论 PGE 1可以降低血吸虫病家兔肝脏PDGF-B基因及其受体表达水平,内源性IFN-γ水平上调可能是这种作用的机制之一.
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肝脏星状细胞对同种异体胰岛移植的保护作用
胰岛移植的终目标是在不需要免疫抑制剂治疗的情况下完全恢复糖代谢并阻止长期糖尿病并发症的发生.当前,胰岛移植后需要持续给予免疫抑制剂预防移植排斥反应,而长期应用免疫抑制剂所引起的严重不良反应限制了胰岛移植在糖尿病患者中的广泛应用[1].如何诱导胰岛移植免疫耐受成为临床胰岛移植研究的方向.通过对肝星状细胞(hepatic stelate cell,HSC)的基础研究发现,活化的HSC可抑制免疫反应,诱导移植免疫耐受,从而对同种异体胰岛移植起保护作用.现就HSC对同种异体胰岛移植的保护作用作一综述.
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肝脏星状细胞与细胞外基质、金属蛋白酶的研究进展
80年代初,用胶原酶、链酶蛋白酶原位循环灌注法首先成功地分离了大鼠肝星状细胞(旧称储脂细胞、Ito细胞),从此人们开始了肝脏星状细胞(HSC)的体外研究.HSC是肝纤维化细胞外基质的主要来源细胞.而肝细胞的正常功能和HSC能保持静止状态,均有赖于Disse腔内正常的细胞外基质成分.本文就HSC与细胞外基质及金属蛋白酶之间的相互关系、相互作用机制作一综述.
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LPS-TLR4信号通路在慢性酒精摄入大鼠模型肝纤维化发生中的作用及其机制
目的:通过检测慢性酒精摄入大鼠门静脉血中内毒素脂多糖(LPS)水平,探讨LPS-Toll样受体4(TLR4)通路在慢性酒精摄入大鼠模型肝纤维化发生中的作用及意义.方法:24只雄性SD大鼠随机分为酒精组和对照组,分别喂养等热量的Lieber-Decarli酒精饲料和对照饲料,10周后采集大鼠门静脉血,留取肝组织标本.采用HE染色和Masson染色评估肝脏的组织学特点,分光光度法检测大鼠门静脉血浆内LPS水平,免疫组织化学法检测肝组织纤维母细胞特异蛋白1 (FSP-1)和波形蛋白(vimentin)以识别肝星状细胞(HSCs),原位杂交方法检测肝组织中TLR4 mRNA表达水平.应用计算机图像分析系统检测FSP-1阳性HSCs和TLR4mRNA阳性细胞的积分光密度值(IA).采用RT-PCR法检测肝组织中白细胞介素1(IL-1)、白细胞介素6 (IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和转化生长因子β1 (TGF-β1) mRNA表达水平.结果:与对照组比较,酒精摄入10周末酒精组大鼠肝脏出现中央静脉周围及肝血窦周边纤维化,肝脏TLR4 mRNA表达水平及FSP-1阳性激活HSC均有明显增加(P＜0.01),大鼠门静脉血浆LPS水平明显升高(P＜0.01).与对照组比较,酒精组大鼠肝脏致炎症因子IL-1、IL-6、TNF-α及TGF-β1 mRNA表达水平明显升高(P＜0.01).Bivariate相关分析,10周末酒精组大鼠肝脏TLR4 mRNA表达水平与门静脉血浆LPS水平呈正相关关系(r=0.856,P＜0.05).结论:慢性酒精摄入可引起大鼠肝脏TLR4信号通路活化,通过释放致炎因子和纤维源性因子在肝纤维化发病过程发挥重要的作用.
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实验性大鼠肝脏星状细胞的培养
目的 完善大鼠肝星形细胞(HSC)的体外分离及培养方法,为肝纤维化的基础实验研究提供技术支持.方法 选用Wistar大鼠经消化酶灌注肝脏后,用分离液分离HSC,通过观察其自发荧光及其显著特征性结构的脂肪染色、细胞免疫化学染色等方法鉴定.结果 分离得到HSC,细胞得率为2×107/只,存活率为96%.结论 通过本法成功分离及培养HSC,且方法经济、简便、稳定,有利于原代大鼠肝星状细胞的生物学研究.
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弹性成像技术在肝纤维化诊断中的应用
肝脏纤维化改变是肝脏对遭受的各种损伤的一种修复应变.肝脏星状细胞的胶原生成是肝脏纤维化的重要环节.肝脏损伤程度越重,修复的发生范围越大,持续时间越长,纤维化的影响越大.随之而来的是肝硬化和肝细胞癌发生几率的增加.早期明确肝脏纤维化并分期对治疗具有重要作用.
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维生素E对肝脏星状细胞Ⅰ型胶原、TGFβ1和TIMP2表达的影响
目的探讨维生素E对肝脏星状细胞(HSC)Ⅰ型胶原、转化生长因子β1(TGFβ1)和基质金属蛋白酶组织抑制剂-2(TIMP2)表达的影响.方法体外培养的HSC,经1mg/L维生素E作用后,用免疫组织化学法检测Ⅰ型胶原表达;原位杂交技术检测TGFβ1和TIMP2mRNA表达.结果实验组中维生素E能使HSCⅠ型胶原表达明显少于对照组(P<0.01),但对TGFβ1及TIMP2mRNA表达无影响.结论维生素E抗肝纤维化作用可以通过抑制Ⅰ型胶原表达实现.
关键词： 维生素E 肝脏星状细胞 Ⅰ型胶原 基质金属蛋白酶组织抑制剂 转化生长因子β1 -
AngⅡ对大鼠肝脏星状细胞内 [Ca2+]i及其增殖的影响
目的观察不同浓度血管紧张奏Ⅱ(Ang Ⅱ)对大鼠肝脏星状细胞(HSC) [Ca2+]i及其增殖的影响,以探讨HSC和细胞内 [Ca2+]i的相关性. 方法HSC分离培养后,采有MTT法和Fura-2/AM荧光指示剂负载分别测定HSC增殖情况及细胞内 [Ca2+]i. 结果10-9 ～10-5mol/L Ang Ⅱ能显著增加HSC内游离 [Ca2+]i(P＜ 0.01),且呈剂量依赖关系;10-9 ～10-6mol/L Ang Ⅱ均能促进HSC增殖(P＜0.05),但10-5mol/L Ang Ⅱ却对HSC增殖无显著影响(P＞0.05). 结论在一定剂量范围内Ang Ⅱ能够剂量依赖性地促进HSC增殖和增加HSC内游离 [Ca2+]i,二者存在一定相关性.
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AngⅡ对大鼠HSC表达ATR及Ⅰ型前胶原mRNA的影响
目的观察血管紧张素Ⅱ (AngⅡ)对大鼠肝脏星状细胞(HSC)表达AngⅡ受体(ATR)及Ⅰ型前胶原mRNA的影响,探讨AngⅡ调控HSC分泌胶原的作用途径.方法 HSC分离培养后,采用细胞免疫技术、原位杂交技术及RT-PCR方法分别测定ATR和Ⅰ型前胶原mRNA表达水平.结果培养激活的HSC表达少量的AT1R蛋白和mRNA,10-6 mol/L AngⅡ刺激后AT1R 蛋白表达水平及mRNA转录水平显著升高,同时亦能促进Ⅰ型前胶原mRNA表达;而体外培养激活的HSC不表达AT2R,AngⅡ作用后亦不能刺激其表达.结论 AngⅡ能够促进激活的大鼠HSC表达AT1R,同时增强Ⅰ型前胶原mRNA表达,由此推测HSC表面AT1R的表达水平可能与胶原分泌有关.
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肝脏纤维化的形成与诊断
肝纤维化是多种病因所致慢性肝病的共同病理过程,其基本病理改变是大量细胞外基质(ECM)在Disse间隙沉积且成分发生改变,致Disse间隙狭窄并"毛细血管化".肝脏星状细胞(贮脂细胞Ito)是肝纤维化ECM的主要来源细胞,其活化标志着肝纤维化的起动,其中25%～40%终发展为肝硬化.因此,早期诊断肝纤维化已成为慢性肝病治疗中的一个关键性问题.现结合文献对肝纤维化的形成与诊断综述如下.
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青蒿琥酯对肝纤维化小鼠肝脏星状细胞凋亡和增生的影响
目的:探讨青蒿琥酯抗肝纤维化的可能机制.方法:采用四氯化碳致小鼠肝纤维化模型,利用免疫组化和脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法对肝星状细胞的增生和凋亡基因进行检测.结果:青篙琥酯高剂量组能明显降低PcNA的表达(P<0.01),确能促进凋亡基因的表达(P<0.01).结论:青蒿琥酯对实验性肝纤维化具有明显的抑制作用.其机制可能是一方面通过抑制活化的肝星状细胞的增殖,另一方面通过调节凋亡基因的表达,进而减轻活化的肝星状细胞的增殖,恢复了凋亡和增殖的平衡态,从而起到抗肝纤维化的作用.
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前列腺素E1抑制血吸虫病家兔肝脏星状细胞活化研究
目的探讨血吸虫病家兔肝纤维化形成过程中,静脉应用前列腺素(PG)E1对肝脏星状细胞(HSCs)活化和胶原含量的影响.方法血吸虫尾蚴皮肤敷贴法感染家兔,构建肝脏纤维化模型,其中7只家兔在感染后60 d开始给予PGE1(2.5 μg/kg.d-1).至120 d透射电镜比较HSCs超微结构变化,免疫组织化学检测肝窦周围平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达,苦味酸天狼星红染色测定Ⅰ、Ⅲ型胶原纤维含量.结果血吸虫病家兔肝脏纤维化形成过程中HSCs活化增加,收缩特性相关的α-SMA表达增强,胶原纤维含量增高.外源性PGE1可以抑制HSCs活化;显著降低肝窦周围α-SMA表达(P<0.01);肝窦周围胶原纤维含量显著降低,模型组和干预组Ⅰ、Ⅲ型胶原显色面积与单个偏振光显微镜视野面积比例(%)分别为37.25±9.71和13.38±4.24(P<0.01);9.66±3.52和6.23±1.81(P<0.05).结论 HSCs活化是血吸虫病家兔肝纤维化形成的重要环节.PGE1可以有效地抑制血吸虫家兔肝纤维化形成,这种作用至少部分地是通过抑制HSCs活化实现的.
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肝脏星状细胞在肝细胞癌上皮间质转化中的作用及临床意义
目的 探讨肝星型细胞(Hepatic stellate cell,HSC)的表达与上皮-间质转化(epithelial-mesenchymaltransition,EMT)的关系,并结合临床资料分析HSCs对原发性肝癌(primary hepatocelluar carcinoma,HCC)生物学行为的影响.方法 通过免疫组织化学方法检测30例肝细胞癌癌组织及23例癌旁组织中的活化HSCs的特异性标记蛋白α-SMA及Twist,同时结合临床资料进行分析.结果 肝细胞癌癌组织及癌旁组织中,α-SMA阳性表达率分别为60.0％和30.4％,组间差异有统计学意义(P＜0.05);Twist阳性表达率分别为66.7％和39.1％,组间差异有统计学意义(P＜0.05).肝癌组中α-SMA和twist阳性表达组和阴性表达组之间的肿瘤分化程度和分期差异有统计学意义(P＜0.05).30例肝癌病理标本中,α-SMA与twist蛋白表达呈正相关(r=0.433,P＜0.05).结论 HSCs在HCC中高表达,对评估肝癌EMT及预后具有重要意义.
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血管紧张素Ⅱ对HSC组织金属蛋白酶及其抑制因子表达的影响及其机制
目的:研究血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对肝星状细胞组织基质金属蛋白酶MMP-2及TIMP-1表达的影响及其机制. 方法:HSC分离培养后,加入10-6 mol/L AngⅡ作用48 h后收集细胞,通过RT-PCR及免疫细胞化学的方法检测各组TGF-β、CTGF的表达, RT-PCR方法检测MMP-2、TIMP-1 mRNA的表达水平.结果:10-6 mol/L的AngⅡ能够显著促进TGF-βⅠ型受体表达,对Ⅱ型受体表达无明显影响;AngⅡ可显著增强CTGF的表达;体外培养激活 HSC时,可表达少量 TIMP-1 和MMP-2 mRNA ,但当与 10-6 mol/L浓度的AngⅡ孵育后,TIMP-1表达量显著增高,差异具有显著性(P < 0.01),MMP-2表达量未见明显差异(P > 0.05).结论:AngⅡ可能通过促进TGF-βⅠ型受体、CTGF的表达,上调TIMP-1表达,继而促进肝纤维化的形成.
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转录因子LAP反式激活α1(I)胶原基因在肝脏星状细胞中的表达
目的了解激活的肝脏星状细胞(hepatic stellate cell, HSC)中一种肝脏组织特异的转录因子肝脏激活蛋白(liver activator protein, LAP)在α1(I)基因表达调控中的作用.方法采用链霉蛋白酶、胶原酶原位灌注、Nycodenz密度梯度离心分离大鼠HSC,并进行体外培养使之活化.构建含人α1(I)胶原基因启动子片段(-804～+1 452或-804～+222碱基)的荧光素酶报告基因质粒.用构建的报告基因质粒与LAP表达质粒一起,用阳离子脂质体介导的方法,瞬时共转染激活的HSC细胞.α1(I)基因启动子的活性通过测定荧光素酶活性来确定.结果构建的含α1(I)基因第一内含子片段的荧光素酶报告基因(PGL3-col)比不含α1(I)基因第一内含子的报告基因[PGL3-col(△intron)]在HSC中有较强的表达(荧光素酶活性为315±45 U/mg蛋白与220±70 U/mg蛋白,P＜0.05).瞬时共转染LAP表达质粒可明显增强PGL3-col及PGL3-col(△intron)报告基因在HSC中的表达(荧光素酶活性分别为587±62 U/mg蛋白与315±45 U/mg蛋白及326±52 U/mg蛋白与220±70 U/mg蛋白,两者比较,P＜0.05).结论 LAP可以反式激活(诱导)α1(I)基因在活化的HSC中表达,在其转录调控中起重要作用.
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槲皮素对活化大鼠肝星状细胞TGF-β1信号的影响
目的了解槲皮素对肝脏星状细胞(HSCs)通过转化生长因子(TGF)β1诱导的结缔组织生长因子(CTGF)及纤维连接素(FN)表达的影响.方法通过胶原酶与链霉蛋白酶原位灌注、Nycondenz一步法梯度离心分离雄性Wistar大鼠HSCs.培养活化的HSCs无血清饥饿后与10-9～10-5mol/L浓度的槲皮素孵育24,48或72 h.以流式细胞术测定TGFβ1的表达与分泌.逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测CTGF基因表达,免疫组化检测FN表达.结果流式细胞术检测免疫荧光强度显示10-8～10-5 mol/L 浓度槲皮素可抑制HSCs TGFβ1表达;10-7 mol/L 浓度槲皮素孵育48 h可显著抑制HSCs TGFβ1表达(特异性平均荧光强度分别为13.33±2.44和18.08±2.54,t=16.52, P<0.01).TGFβ1可明显促进活化HSCs CTGF mRNA表达,但10-7 mol/L 浓度槲皮素在72 h内几乎可完全拮抗此效应.与对照相比,10-7 mol/L 浓度槲皮素孵育48 h可显著抑制HSCs FN表达.结论槲皮素可抑制TGFβ1信号通路,包括抑制TGFβ1、FN表达及CTGF的基因表达,具有潜在的抗肝纤维化治疗作用.
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Genistein对大鼠肝脏星状细胞激活的抑制作用
目的探索酪氨酸蛋白激酶抑制剂Genistein对肝脏星状细胞(HSC)激活的抑制作用.方法采用链霉蛋白酶、胶原酶原位灌注及Nycodenz一步密度梯度离心法分离大鼠HSC,并进行体外培养使之激活.用四唑盐比色法(MTT法)检测Genistein作用24、48和72小时对HSC增殖的抑制作用;用激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)观察Genistein作用后HSC的α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA,HSC激活的标志之一)表达的变化.结果 MTT检测显示,10-5～10-9 mol/L 浓度的Genistein作用24、48和72小时对HSC增殖有抑制作用,并以10-7 mol/L的Genistein作用48小时的抑制作用明显.LSCM观察显示,10-6和10-7 mol/L的 Genistein作用48小时可使α-SMA表达明显减弱.结论一定浓度的Genistein能明显抑制HSC的活化和增殖,有可能成为抑制肝纤维化的潜在药物.
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阳离子脂质体介导的TGFβ1反义寡核苷酸对大鼠肝脏星状细胞激活的抑制作用
为探讨阳离子脂质体介导的TGFβ1反义寡核苷酸(antisense oligonucleotides, ASON)对大鼠肝脏星状细胞激活及其胶原生成的作用,作者合成了特异性的针对TGFβ1 mRNA转译起始区的硫代磷酸ASON及其对照(正义、错义寡核苷酸),并和阳离子脂质体形成复合物.通过测定细胞内32P标记的ASON的放射量来观察ASON的细胞摄入率,用细胞免疫化学分析α-SMA的表达来观察星状细胞的激活 .结果显示:阳离子脂质体可以明显增加TGFβ1 ASON的细胞摄入率(P＜0.05);阳离子脂质体-TGFβ1 ASON复合物和单独使用TGFβ1 ASON相比,在相同浓度下(ASON浓度为1μmol/L)可以明显增高ASON对星状细胞激活的抑制作用,而单独使用阳离子脂质体或阳离子脂质体-正义或错义TGFβ1寡核苷酸复合物在相同浓度下未见抑制效应.ASON或阳离子脂质体-ASON复合物均无细胞毒性作用.由此提示,阳离子脂质体-ASON复合物可能发展成一种治疗肝纤维化的药物.
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TGFβ1反义寡核苷酸对大鼠肝脏星状细胞激活及其胶原生成的抑制作用
为探讨TGFβ1反义寡核苷酸(antisense oligonucleotides, ASON)对大鼠肝脏星状细胞活化及其胶原生成的作用,作者合成了特异性的TGFβ1硫代磷酸ASON及其对照(正义,错义寡核苷酸),并将其加入至培养的肝脏星状细胞中.通过细胞免疫化学方法分析α-SMA的表达来观察肝脏星状细胞的活化,肝脏星状细胞产生TGFβ的水平用生物学方法测定,以3H-脯氨酸掺入抑制率的测定观察胶原生成的变化.结果:针对TGFβ1 mRNA转译起始区的ASON在终浓度为10μmol/L时,能明显地抑制体外培养的肝脏星状细胞的激活、TGFβ1的产生及其胶原的生成能力,而对照组寡核苷酸在相同浓度下未见抑制效应.上述结果表明,ASON对肝脏星状细胞无损伤作用.TGFβ1 ASON可能成为一种潜在的抗肝纤维化治疗的药物.
