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NLRC4在儿童败血症中的作用研究
目的 检测NLRC4在败血症儿童血液中的表达,并研究NLRC4在细胞因子产生中的重要性,以及脂多糖(LPS)诱导巨噬细胞中NLRC4表达的信号传导通路,并研究LPS对巨噬细胞中NLRC4表达的影响.方法 1.采用逆转录-定量聚合酶链反应和Western blot分析法,测定败血症组(n=42)和对照组(n=40)儿童NLRC4的mRNA和蛋白质表达水平;2.在体外使用LPS刺激RAW264.7巨噬细胞,并测定NLRC4及细胞因子表达水平,以研究LPS对NLRC4表达的调节作用;3.在LPS诱导下使用NLRC4 siRNA转染RAW264.7细胞,并再次测定NLRC4及细胞因子表达水平,研究NLRC4对产生炎症细胞因子的影响;4.阻断MAPK信号传导通路,测定NLRC4的表达水平.结果 1.与对照组相比,败血症组NLRC4的mRNA及蛋白质表达水平显著增加;2.NLRC4表达水平随着细胞使用含LPS的培养基培养时间的延长及浓度的增高而显著增加;3.在LPS诱导下经NLRC4 siRNA转染后的RAW264.7细胞中,IL-1β和IL-18的产生明显增加;4.阻断MAPK信号传导通路后,NLRC4的表达水平显著降低.结论 NLRC4在败血症儿童血清中的表达增加;Western blot的结果表明在RAW264.7细胞中LPS以时间和剂量依赖性方式诱导NLRC4表达;ELISA结果显示,通过NLRC4 siRNA转染RAW264.7细胞增强了LPS对IL-1β和IL-18产生的作用;LPS诱导NLRC4的表达水平与MAPK信号传导通路有关.
关键词： 败血症 NLRC4 脂多糖(LPS) MAPK信号传导通路 -
cAMP在LPS及BCG+LPS诱导的免疫性肝损伤中的作用比较
目的比较LPS、BCG+LPS诱导的免疫性肝损伤模型的特点及肝中cAMP的变化,以建立合适的动物模型,并为药物作用及肝损伤机制探讨提供参考.方法昆明种小鼠,分为5组:①对照组;②BCG组(ip 1 mg*kg-1 BCG,7 d后处理动物);③LPS 0.2 mg;④LPS 0.4 mg组(分别ip 0.2, 0.4 mg*kg-1,6 h后处理动物);⑤BCG+LPS组 (ip 1 mg*kg-1 BCG 7 d后ip 0.2 mg*kg-1 LPS 6 h后处理动物).取血清,测定ALT、GST活性;HE染色,光镜观察组织损伤情况;制备肝匀浆,放射免疫法测定cAMP含量.结果组织学检查表明,给予BCG或LPS均能引起中性粒细胞浸润.单独给予BCG 或0.2 mg*kg-1 LPS未见明显的肝组织损害,但经BCG预处理后,0.2 mg*kg-1 LPS可使血清ALT、GST水平显著增高.单独给予0.4 mg*kg-1 LPS也能引起明显的肝组织损伤.经BCG预处理后的小鼠肝组织内cAMP含量明显下降,而单独LPS刺激,则使肝内cAMP含量呈剂量依赖性增高.结论 LPS、BCG+LPS均能引起典型的免疫性肝损伤,经BCG预处理,能增强内毒素刺激诱导的肝脏毒性.不同的免疫性肝损伤模型所致肝内cAMP含量的变化不同,在进行机制研究及药物药理作用研究时应予以考虑.
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加味茵陈五苓散对免疫性肝损伤保护作用及其机理研究
目的 观察加味茵陈五苓散对免疫性肝损伤的保护作用以阐明其药效和药物作用机理.方法 采用卡介苗(BCG)+脂多糖(LPS)诱导小鼠免疫性肝损伤模型,观察本方对肝损伤小鼠血清谷丙转氨酶(ALT)及谷草转氨酶(AST)活性,脾、肝脏器系数,肝脏病理组织学损伤程度的影响,并检测小鼠肝组织匀浆丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)的含量,血清一氧化氮(NO)含量及肿瘤坏死因子(TNF-α)的含量.结果 加味茵陈五苓散和阳性对照药物五酯片均能显著降低BCG/LPS免疫性肝损伤小鼠血清中升高的ALT、AST水平;且加味茵陈五苓散中剂量降酶作用优于阳性对照组;对肝脾重量的增大有显著的抑制作用;组织病理检查结果显示本品中、高剂量可减轻肝组织坏死范围及程度,减少炎细胞浸润,有明显的保肝作用.同时发现中剂量药物可显著降低肝匀浆中升高的MDA水平,提高肝匀浆 SOD水平,显著降低血清中升高的NO含量和TNF-α含量.结论 加味茵陈五苓散对免疫性肝损伤具有保护作用,其机制可能与其直接清除自由基、降低脂质过氧化物水平、提高SOD活性、减少炎性细胞因子的产生和调节机体免疫功能等有关.
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LPS对人牙髓干细胞增殖及骨向分化能力的影响
目的:探讨脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)对人牙髓干细胞(human Dental pulp Stem cells,hDPSCs)增殖及骨向分化的作用关系.方法:将第3代hDPSCs体外常规培养后,采用MTT法分别检测不同浓度LPS(0、1、10、100、1000 ng/mL)作用hDPSCs 72 h后细胞增殖情况,筛选出促进hDPSCs增殖的LPS佳浓度.通过Western Blot法检测该浓度作用下hDPSCs中各矿化相关蛋白:碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(OCN)、骨唾液酸蛋白(BSP)及牙本质涎磷蛋白(DSPP)的表达水平.结果:与对照组比较,1 ng/mL及10 ng/mL LPS干预组能明显促进hDPSCs的增殖(P<0.05),其中以10 ng/mL LPS作用更显著.Western Blot检测结果表明,10 ng/mL LPS可明显上调hDPSCs中各矿化相关蛋白的表达水平.结论:低浓度LPS可促进hDPSCs的增殖和骨向分化.
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板蓝根中苯甲酸的抗内毒素作用
目的 研究板蓝根中苯甲酸的抗内毒素作用.方法 将苯甲酸配成0.25%水溶液,鲎试验法进行抗内毒素定量测定;内毒素致家免发热实验检测苯甲酸体内抗内毒素作用;脂多糖致小鼠死亡实验测定苯甲酸保护作用及苯甲酸对脂多糖致小鼠过度释放肿瘤坏死因子(TNF-α)和一氧化氮(NO)的影响研究苯甲酸的抗内毒素作用.结果 0.416 mg·mL-1苯甲酸可使4 EU内毒素降解为0.926 EU,破坏率为78%;0.25%苯甲酸溶液可使内毒素引起的家兔体温升高显著降低,使同等剂量脂多糖引起的小鼠死亡率从70%降为20%;板蓝根中的苯甲酸可抑制脂多糖致小鼠血清中TNF-α和NO的过度释放,其抑制率呈剂量依赖性.结论 从板蓝根中提取分离出的苯甲酸有抗内毒素作用.
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急性肺损伤大鼠肺组织NF-κB表达的研究
目的 在脂多糖(LPS)复制的急性肺损伤(ALI)大鼠模型,观察NF-κB改变,探讨NF-κB在ALI发病中的作用.方法 在LPS复制的大鼠ALI模型,观察动脉血气、肺湿/干(W/D)比值、肺组织病理,用RT-PCR法检测肺组织肿瘤坏死因子-α(TNF-α)mRNA表达,用ELISA法检测TNF-α蛋白变化,并使用Western blot方法观察肺组织NF-κB的改变.结果 在SLI大鼠,动脉血氧分压显著降低(P＜0.05),肺W/D比值均显著高于对照组(P＜0.01),MPO活性均显著高于对照组(P＜0.01),病理显示肺组织受损;肺组织TNF-αmRNA即显著升高(P均＜0.01),与此同时肺组织匀浆和血浆中TNF-α亦显著升高,2h达高峰.致伤后肺组织胞浆中P65蛋白的表达强度均较对照组显著降低(P＜0.01),而胞核中P65蛋白表达强度均较对照组显著升高(P＜0.01).结论 LPS引起肺组织和血中TNF-α大量释放,肺组织NF-κB由细胞浆向细胞核转移而活化,提示NF-κB参与炎症的调控,在ALI中起重要作用.
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加味逍遥散对抑郁大鼠行为学及海马组织炎症因子表达的影响
目的:观察加味逍遥散对抑郁大鼠行为学及海马组织炎症因子表达的影响,探讨其可能的作用机制.方法:将60只SD大鼠随机分为空白组、模型组、氟西汀组、加味逍遥散低、中、高剂量组,每组10只.除空白组外,其余各组均腹腔注射LPS建立抑郁大鼠模型.氟西汀组每天灌胃盐酸氟西汀1.54 mg/(kg·d),加味逍遥散低、中、高各剂量组每天分别灌胃加味逍遥散2.5 g/(kg·d)、5g/(kg·d)、10g/(kg·d),空白组及模型组灌胃等体积生理盐水.通过旷场实验及强迫游泳实验观察大鼠行为学的变化,采用高效液相-质谱联用(HPLC-MS/MS)技术检测海马组织中5-羟色胺(5-HT)含量,实时荧光定量PCR (RT-PCR)检测海马组织IL-1β mRNA、IL-6 mRNA、TNF-α mRNA表达水平.结果:与空白组比较,模型组大鼠的起立数、穿格数、修饰数均明显减少,强迫游泳不动时间延长,海马组织5-HT浓度显著降低,而IL-1β mRNA、IL-6 mRNA、TNF-α mRNA表达显著升高,差异均有统计学意义(P＜0.01).与模型组比较,氟西汀组、加味逍遥散高剂量组大鼠起立数、穿格数、修饰数显著增加,强迫游泳不动时间缩短,海马组织5-HT浓度显著升高,而IL-1β mRNA、IL-6 mRNA、TNF-α mRNA表达量明显降低,差异均有统计学意义(P＜ 0.05,P＜0.01).结论:加味逍遥散对LPS诱导抑郁模型大鼠具有明显抗抑郁作用,通过抑制IL-1β mRNA、IL-6mRNA、TNF-α mRNA的过度表达,增加大鼠海马组织5-HT的含量来改善大鼠抑郁症状.
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大黄酸对LPS刺激下RAW264.7细胞HMGB1表达的影响
目的:探究大黄酸对脂多糖(LPS)诱导RAW264.7细胞高迁移率族蛋白B1(HMGBl)表达的影响.方法:将培养的RAW264.7细胞分为空白对照组、模型组(LPS)、正丁酸钠阳性对照组及大黄酸低(140 μmol/L)、高(210 μmol/L)浓度组共5组,给药24h后收集培养液上清并提取细胞总RNA、总蛋白.采用ELISA法检测培养液上清中HMGB1的含量;RT-PCR法检测HMGB1 mRNA表达;Western Blot检测HMGB1、HDAC3蛋白表达;免疫细胞化学共聚焦显微镜观察HMGB1定位.结果:与LPS组比较,大黄酸低、高浓度组细胞培养液上清HMGB1含量和细胞HMGB1总蛋白及HMGB1 mRNA表达均显著降低(P＜0.05或P＜0.01);激光共聚焦显微镜结果表明,LPS组红色标记的HMGB1出现在细胞质内,大黄酸组胞质内的HMGB1显著减少,胞核增多.与LPS组比较,大黄酸低、高浓度组细胞HDAC3总蛋白表达显著升高(P＜0.05或P＜0.01).结论:大黄酸能有效抑制LPS刺激下RAW264.7细胞HMGB1的表达和释放.
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肠道菌群在酒精性脂肪肝中的作用及相关机制研究
目的 :分析酒精性脂肪肝C57BJ/N小鼠肠道菌群变化,探讨肠道菌群在其发病过程中的可能作用机制.方法 :45只清洁级雄性C57BJ/6小鼠随机分为对照组(NC)、10％v/v alcohol组 、20％v/v al-cohol组(每组15只)自由饮食24周,模拟长期慢性饮酒致酒精性脂肪肝模型;分别以不同浓度alco-hol、脂多糖(LPS)刺激LO2细胞24 h.高通量Illumina平台测序检测各组小鼠肠道菌群变化;检测血清LPS、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST),禁食后行糖耐量试验(GT T);油红"O"染色检测肝脏脂质沉积,H&E染色观察肝组织形态改变,验证酒精性脂肪肝模型,Western-blot检测LO2细胞NL-RP3、IL-1β 表达水平.结果 :不同浓度饮酒致肠道菌群拟杆菌门/厚壁菌门比例改变,其中20％v/v al-cohol组较对照组拟杆菌门/厚壁菌门比例明显增加(P<0.05),且血清中LPS水平较对照组增加(P<0.05);体外实验中alcohol、LPS干预LO2细胞24 h后,NLRP3、IL-1β 表达量较正常组明显上调.结论 :长期慢性饮酒可引起小鼠肠道菌群变化,且血清中LPS水平显著增加;LPS、alcohol可能通过激活NLRP3炎性小体,致促炎因子IL-1β 释放,引起肝细胞损害,从而导致酒精性脂肪肝.
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急性肺损伤大鼠肺组织PPAR-γ表达的研究
目的 在脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)复制的急性肺损伤(acute lung injury,ALI)大鼠模型中,观察PPARγ表达的改变,探讨PPAR-γ在ALI发病中的作用.方法 在LPS复制的大鼠Au模型中,观察动脉血气、肺湿/干(W/D)比值、肺组织病理,用RT-PCR法检测肺组织PPAR-γ、TNF-α mRNA表达,用ELISA法检测TNF-α蛋白变化,并用免疫组化观察肺组织PPAR-γ的改变.结果 ALI大鼠,PaO2显著降低(P<0.05),肺W/D比值显著高于对照组(P<0.05),病理显示肺组织受损;肺组织TNF-αmRNA显著升高(P<0.05),与此同时血浆TNF-α亦显著升高(P<0.05).正常大鼠肺组织可表达PPAR-γ,LPS致伤后肺组织PPAR-γ mRNA在1 h即开始下降,2 h降至谷底,并持续至实验结束.免疫组化显示致伤后1、2 h与对照组无显著差异,从4 h显著降低并持续至8 h(P<0.05).结论 正常大鼠肺组织可表达PPAR-γ,LPS可引起ALI大鼠肺组织PPA-γ的基因和蛋白水平表达下降,这可能与ALI炎症持续和损伤有关.
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内毒素耐受发生机制的研究进展
1 内毒素耐受的概念内毒素耐受是指以小剂量内毒素或其同系物预处理实验动物后,短期内再给予致死剂量内毒素时,内毒素导致的一系列诸如发热、体重下降、休克乃至死亡等病理生理现象减轻甚至消失,细胞因子、细胞表面抗原、转录因子、细胞周期和凋亡相关蛋白、细胞信号转导分子等发生改变(并非一定是减少)的客观现象[1].根据诱导剂量、诱导次数、时间间隔等的不同,可将内毒素耐受分为2个阶段:早期耐受和晚期耐受.早期耐受出现早,非抗体介导,短暂而可逆,为内毒素刺激后细胞激活状态的改变,表现为单核巨噬细胞系统尤其是肝脏巨噬细胞内生性致热原生成大幅度减少;晚期耐受出现晚,乃针对O抗原及核心抗原的抗内毒素抗体介导的巨噬细胞释放内生性致热原能力减弱.一般所指的内毒素耐受为早期耐受.目前认为,内毒素耐受是生物在长期进化过程中形成的一种保守的保护性调节机制,是一种适应性应答,避免了机体对内毒素刺激的持续过度反应,是机体防御机制的重要组成部分.
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法舒地尔(Fasudil)抑制脂多糖诱导的小鼠星形胶质细胞活化和炎性反应及其机制
目的 探讨法舒地尔(Fasudil)对脂多糖(LPS)诱导的星形胶质细胞活化和炎症反应及Toll样受体4(TLR4)/核因子κB(NF-κB)信号通路的影响.方法 体外培养新生C57BL/6小鼠大脑皮质星形胶质细胞,细胞分为PBS对照组、1μg/mL LPS刺激组、1 μg/mL LPS联合15 μg/mL盐酸法舒地尔处理组,Griess法检测培养细胞上清液一氧化氮(NO)的水平,ELISA检测肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)、IL-10和IL4的水平,免疫荧光细胞化学染色检测星形胶质细胞胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)及TLR4的表达,Western blot法检测GFAP、TLR4和磷酸化的NF-κBp65(p-NF-κBp65)蛋白水平.结果 与PBS组比较,LPS组NO、TNF-α和IL-6水平显著升高,IL-10和IL-4水平降低;法舒地尔能抑制LPS诱导的NO、TNF-α和IL-6的分泌,增加IL-10和IL-4的分泌.法舒地尔处理组星形胶质细胞GFAP表达显著降低,同时TLR4和NF-κB蛋白的水平也降低.结论 法舒地尔阻断TLR4/NF-κB信号通路抑制LPS诱导的星形胶质细胞活化及炎性反应.
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NSD3促进组蛋白H3K36双甲基化抑制巨噬细胞中TNF-α的产生
目的 主要研究巨噬细胞中核受体结合SET结构域蛋白3(NSD3)对脂多糖(LPS)触发的肿瘤坏死因子α(TNF-α)的调控作用,并探讨其调控机制.方法 以小鼠腹腔巨噬细胞和RAW264.7细胞作为细胞模型.100 ng/mL LPS刺激小鼠腹腔巨噬细胞,采用实时定量PCR检测NSD3 mRNA水平,Western blot法检测NSD3蛋白水平;在RAW264.7细胞中过表达NSD3或采用RNA干扰技术敲低腹腔巨噬细胞中NSD3的表达,ELISA检测NSD3对LPS触发的TNF-α分泌的影响;Western blot法检测敲低NSD3对LPS触发的核因子κB p65 (NF-κBp65)信号通路的影响;荧光素酶法检测NSD3对NF-κBp65介导的TNF-α基因转录活性的影响;染色质免疫沉淀实验检测TNF-α基因启动子区组蛋白H3的36位赖氨酸(H3K36)甲基化的募集.结果 LPS抑制巨噬细胞中NSD3的表达;过表达NSD3抑制LPS触发的TNF-α的产生,敲低NSD3则促进LPS触发的TNF-α的产生,但对NF-κB活化无影响;NSD3抑制NF-κBp65介导的TNF-α基因的转录活化,促进TNF-α基因启动子区的H3K36二甲基化.结论 NSD3促进TNF-α基因启动子区H3K36的双甲基化,抑制TNF-α的表达.
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CD11b激动剂leukadherin-1通过促进髓源性抑制细胞聚集和活化缓解小鼠内毒素休克发病
目的 研究CD11b激动剂白细胞黏附素1(LA1)对髓源性抑制细胞(MDSC)的聚集和免疫抑制功能的影响,并检测其对脂多糖(LPS)诱导的内毒素休克模型小鼠的治疗效果.方法 C57BL/6雌性小鼠腹腔注射LA1(40μg/g),12 h和48 h后,流式细胞术检测脾脏MDSC及其亚型粒细胞性髓源性抑制细胞(G-MDSC)和单核细胞性髓源性抑制细胞(M-MDSC)的比例.取C57BL/6雌性小鼠股骨及胫骨,体外诱导MDSC,通过实时定量PCR分析LA1处理对其免疫抑制相关因子白细胞介素10(IL-10)、NADPH氧化酶1(NOX1)及诱导型一氧化氮合酶(iNOS) mRNA水平的影响.用C57BL/6雌性小鼠随机分为PBS组、LA1组、PBS联合LPS组和LA1联合LPS组,通过流式细胞术检测MDSC、G-MDSC及M-MDSC的比例及巨噬细胞表面CD86和CD40的表达,HE染色检测肝肺组织病理损伤,原位末端转移酶标记技术(TUNEL)检测肝肺组织细胞凋亡情况,观察小鼠死亡率反映小鼠病情的严重程度.通过以上检测指标分析LA1对内毒素休克小鼠体内MDSC的聚集及对病情的影响.结果 LA1处理12、48 h,均显著上调小鼠脾脏中MDSC的比例.与对照组相比,LA1处理12 h可显著上调G-MDSC的比例;体外实验发现,LA1可诱导MDSC中IL-10、NOX1及iNOS高表达;体内实验中,与PBS联合LPS组相比,LA1联合LPS组脾脏MDSC及G-MDSC的比例显著增加,肝、肺组织损伤减轻,死亡率下降,巨噬细胞活化程度显著降低.结论 CD11b激动剂LA1可通过促进MDSC的聚集及其免疫抑制相关因子的表达缓解内毒素休克的发病.
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黄芪多糖通过抑制中性粒细胞活化减轻脂多糖诱导的大鼠肺损伤
目的 探讨黄芪多糖(APS)对脂多糖(LPS)诱导的大鼠肺损伤模型的保护作用.方法 36只SD成年大鼠随机分为对照组、LPS模型组和APS治疗组.利用气管内注射LPS的方法制备大鼠肺损伤模型,采用HE染色观察大鼠肺损伤程度,ELISA检测大鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)中肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素1β(IL-1β)的水平,细胞计数法检测BALF中总白细胞和中性粒细胞的数量变化;利用相应试剂盒分别检测肺组织髓过氧化物酶(MPO)活性变化和活性氧(ROS)的水平.结果 与对照组相比,LPS模型组大鼠肺组织损伤明显,主要表现为肺组织水肿、血管通透性增加;造模后48 h,LPS模型组大鼠肺组织中白细胞显著增多,以中性粒细胞数量增加更为显著;BALF中TNF-α和IL-1β含量增加,LPS模型组肺组织中MPO活性增加、ROS水平显著升高.给予注射APS处理的大鼠,其肺损伤程度显著减轻,白细胞和中性粒细胞渗出减少,BALF中TNF-α和IL-1β含量显著降低;肺组织中MPO活性和ROS水平均显著下降.结论 APS通过抑制中性粒细胞活化有效减轻LPS诱导的大鼠肺损伤.
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佛波酯联合脂多糖诱导THP-1炎症细胞模型的优化及评价
目的 优化条件建立人急性单核白血病细胞THP-1炎症细胞模型,评价其对磷酸二酯酶抑制剂类抗炎剂咯利普兰的响应.方法 THP-1细胞经佛波酯(PMA)诱导分化、脂多糖(LPS)刺激,ELISA检测细胞上清肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)水平.考察PMA和LPS剂量及其作用时间获得较优模型;于LPS同时加入咯利普兰考察此THP-1炎症细胞模型对抗炎作用的响应.结果 THP-1单核细胞经PMA诱导分化24h呈巨噬细胞形态,延长至48 h细胞形态不变,诱导的细胞经LPS刺激产生显著升高的TNF-α和IL-6.PMA在100 ng/mL较50 ng/mL诱导分化THP-1经LPS刺激所产生TNF-α水平显著升高,且随LPS剂量增加而增加并在LPS达0.2 μg/mL后趋于恒定;IL-6在PMA 100 ng/mL及LPS≥1 μg/mL时释放明显.100 ng/mL PMA联合0.5 μg/mL LPS相较于0.1 μg/mL LPS刺激THP-1产生TNF-α被咯利普兰抑制更显著.结论 100 ng/mLPMA诱导分化的THP-1细胞在LPS刺激下炎性因子水平显著升高;100ng/mL PMA联合不低于0.2 μg/mL LPS刺激THP-1细胞可获较优炎症细胞模型,此模型对抗炎剂作用更敏感.
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Notch1信号激活核因子κB(NF-κB)参与小鼠RAW264.7巨噬细胞炎症介质释放
目的 观察Notch1信号在脂多糖(LPS)诱导巨噬细胞炎症介质表达中的作用并探讨其作用机制.方法 给予100 ng/mL LPS处理小鼠RAW264.7细胞8h,反转录PCR观察RAW264.7细胞Notch1和发状分裂相关增强子1(Hes1) mRNA表达;LPS处理前给予Notch1信号抑制剂10 μmol/L(3,5-二氟苯乙酰基)-L-丙氨酰基-L-2-苯基甘氨酸叔丁酯(DAPT)预处理1h,ELISA检测细胞培养液中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β (IL-1β)、IL-6、一氧化氮(NO)和前列腺素E2(PGE2)含量,反转录PCR检测诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和环加氧酶2(COX-2) mRNA水平,Westem blot法检测iNOS、COX-2、核因子κBp65(NF-κBp65)、磷酸化的核因子κB抑制蛋白α(p-IκBα)蛋白水平.结果 LPS刺激RAW264.7细胞后明显提高细胞Notch1和Hes1 mRNA水平,DAPT明显抑制LPS诱导RAW264.7细胞TNF-α、IL-1β、IL-6、NO和PGE2的表达.DAPT阻断Notch1信号后明显降低LPS诱导RAW264.7细胞的iNOS和COX-2 mRNA和蛋白水平,DAPT能够抑制LPS诱导的IκBα磷酸化和NF-κBp65核转位.结论 Notch1通过激活NF-κB参与LPS诱导巨噬细胞炎症介质释放.
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没食子酸通过拮抗脂多糖诱导的TLR4/NF-κB活化抑制RAW264.7巨噬细胞炎性反应
目的 观察没食子酸对脂多糖(LPS)诱导RAW264.7巨噬细胞Toll样受体4/核因子κB(TLR4/NF-κB)通路的影响.方法 将巨噬细胞分为空白对照组、LPS组、LPS联合没食子酸组、LPS联合NF-κB抑制剂吡咯二硫代甲酸(PDTC)组和LPS联合地塞米松(DM)组.处理后的细胞培养24h,ELISA检测肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1(IL-1)、IL-6水平,实时定量PCR检测ⅡLR4、NF-κB mNRA水平,Western blot法检测p65、p-p65、TLR4、磷酸化的NF-κB抑制蛋白α(IκBα)的蛋白表达水平.结果 LPS诱导RAW264.7巨噬细胞后TNF-α、IL-1、IL-6水平升高,没食子酸可降低LPS诱导引起的TNF-α、IL-1和IL-6表达水平升高.LPS刺激后TLR4 mRNA及蛋白表达增加,NF-κB活化,没食子酸可拮抗以上作用,阻止NF-κB活化.结论 没食子酸可通过TLR4/NF-κB通路抑制LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞炎性反应.
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脂多糖活化的单核细胞对人Th17细胞分化的影响
目的:拟建立体外人外周血CD4+T细胞与CD14+单核细胞共培养体系,观察脂多糖(LPS)活化的单核细胞,在联合或不联合抗CD3 mAb、不同浓度和时间条件下对诱导Th17细胞分化的影响.方法:采用免疫磁珠法分离纯化健康志愿者外周血CD4+T细胞与CD14+单核细胞,在两者共培养体系中分别单加LPS或抗CD3 mAb、抗CD3 mAb刺激下添加不同浓度LPS刺激培养3d或同时加入LPS和抗CD3 mAb刺激培养3～10d.以流式细胞术检测细胞表面分子CD4,胞内细胞因子IL-17及IFN-γ,确定各种刺激培养条件下,诱导生成的Th17及Th1等细胞亚群占CD4+T细胞的百分比.结果:单独采用LPS或抗CD3 mAb刺激,分别仅能诱导(1.30±0.19)％、(1.10±0.21)％CD4+T细胞分泌表达IL-17,而采用LPS联合抗CD3 mAb刺激显著增加Th17频率,可达(2.01±0.46)％(P＜0.05).在抗CD3 mAb刺激条件下,LPS浓度分别为0.1 μg/mL,1μg/mL,10 μg/mL时,诱导生成Th17细胞频率依次为(1.92±0.21)％、(1.30±0.37)％、(1.01±0.25)％,随LPS浓度增加,Th17细胞生成显著减少(P＜0.05).LPS体外刺激3d可诱导(2.13±0.32)％ Th17细胞生成,随时间推移,Th17细胞减少(P＜0.05),Th1细胞在6d达高频率(17.45±3.04)％,10 d时下降到(11.34±1.29)％.结论:低剂量LPS联合抗CD3 mAb活化的单核细胞可在短时间内诱导CD4+T细胞向Th17细胞分化,所建立的共培养体系更加贴近类风湿关节炎等炎症性疾病体内异常免疫应答的微环境.
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蓝玉簪颗粒抑制脂多糖诱导大鼠肺泡巨噬细胞TNF-α产生及相关机制研究
目的:探讨蓝玉簪颗粒对脂多糖(LPS)诱导大鼠肺泡巨噬细胞(AM)内TNF-α表达及可能作用机制.方法:分离纯化AM,应用ELISA法检测蓝玉簪颗粒对LPS诱导的大鼠AM培养上清中的TNF-α水平的影响,应用Western blot方法检测大鼠AM内TNF-α及pERK蛋白表达水平,同时应用ERK拮抗剂(PD98059)观察AM内TNF-α蛋白表达.结果:蓝玉簪颗粒可剂量依赖的降低由于LPS刺激导致的AM培养上清内TNF-α含量升高;蓝玉簪(100 mg/L)颗粒可显著降低由于LPS刺激导致的AM细胞内pERK及TNF-α蛋白表达升高;ERK特异性抑制剂(PD98059 30 mol/L)及蓝玉簪颗粒干预,蓝玉簪颗粒+PD98059干预后,我们发现与LPS刺激组相比,大鼠AM中TNF-α表达显著降低.结论:蓝玉簪颗粒可以抑制LPS诱导AM TNF-α表达,其作用的机制之一可能与蓝玉簪抑制细胞外信号转导通路有关.
关键词： 蓝玉簪颗粒 脂多糖(LPS) 肺泡巨噬细胞(AM) TNF-α ERK
