Hep G2细胞中乙肝病毒衣壳包裹绿色荧光蛋白质粒表达的研究

目的:观察乙型肝炎病毒衣壳(hepatitis B virus envelope, HBVE)包裹绿色荧光蛋白质粒在肝癌细胞株(Hep G2细胞)中的表达效果是否优于脂质体包裹绿色荧光蛋白质粒.方法:采用PEG8000病毒浓缩法、β-丙内脂法从Hep G2.2.15细胞上清液中制备HBVE基因转移载体,分别用HBVE及脂质体包裹绿色荧光蛋白质粒(pIRS2-EGFP)后转染Hep G2细胞,通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达情况,流式细胞仪检测细胞发光率.结果:荧光显微镜下观察可见,脂质体组及HBVE组均可见绿色荧光蛋白的表达,HBVE组较之脂质体组具有更高的荧光强度;流式细胞仪检测结果显示,脂质体组的转染效率为49.97%,而HBVE组转染效率为70.65%,其转染效率及荧光强度明显高于脂质体组,P=0.000.结论:HBVE包裹绿色荧光蛋白质粒较之脂质体包裹在Hep G2细胞中具有更好的转染效果.

不同p53功能状态鼻咽癌细胞株的放射生物学特性

目的探讨鼻咽癌细胞不同p53功能状态及其放射生物学特性之间的关系.方法采用脂质体介导的转染方法将携带野生型p53基因的真核表达质粒pC53-SN3,空载体质粒pCMV-Neo-Bam分别转染到鼻咽癌细胞CNE1、CNE2中.p53功能检测技术明确细胞转染p53基因前后的p53功能状态.成克隆实验测定细胞存活分数.采用单击多靶模型和线性二次函数模型拟合细胞存活曲线,求出放射生物学参数D0、Dq、N和αβ、α/β、SF2值.结果转染野生型p53基因后鼻咽癌细胞获得正常p53功能.CNE1-pNeo和CNE1-wtp53细胞的D0值分别为1.17、1.08Gy;Dq值分别为2.25、1.21Gy;α值分别为0.13、0.29Gy-1;SF2值分别为0.765、0.326.CNE2-pNeo和CNE2-wtp53细胞的D0值分别为0.92、0.84Gy;Dq值分别为1.45、1.04Gy;α值分别为0.13、0.76 Gy-1;SF2值分别为0.675、0.156.CNE1、CNE2细胞转染野生型p53基因后,D0、Dq、SF2值均减小,α值增大.结论野生型p53基因转染可以提高p53功能缺陷的鼻咽癌细胞的放射敏感性.

c-myc和K-ras对小鼠卵巢上皮细胞体外转化和体内致瘤的研究

目的 探讨癌基因c-myc和K-ras在卵巢癌发生发展中的作用.方法 用逆转录病毒转基因系统,将正常的c-myc基因和突变的K-ras基因先后导入小鼠卵巢上皮(MOSE)细胞,建立表达c-myc和K-ras基因的细胞株,分别称为MOSE-Myc细胞、MOSE-Ras细胞和MOSE-RM细胞.通过细胞增殖实验、克隆形成实验、体外侵袭实验以及体内成瘤实验,研究转基因后MOSE细胞生物学特性的改变及恶性转化.结果 c-myc和K-ras基因容易被重组逆转录病毒导入MOSE细胞,转导后靶细胞内分别有相应的c-myc或K-ras mRNA转录,以及相应的c-myc(62 000)和K-ras(21 000)蛋白的表达.MOSE-Ras组和MOSE-RM(MOSE-Ras/Myc)组细胞增殖能力显著强于MOSE和MOSE-Myc组(P＜0.01),MOSE-RM组细胞增殖能力显著强于MOSE-Myc组(P＜0.05).MOSE-Ras和MOSE-RM组在软琼脂培养中均能形成克隆集落,而MOSE组和MOSE-Myc组不能形成克隆集落.MOSE-Ras组和MOSE-RM组能够穿透Matrigel,具有侵袭能力.MOSE-Ras组和MOSE-RM组细胞在裸鼠体内形成肿瘤,且肿瘤组织细胞仍然可见有K-ras和c-myc蛋白的表达;而MOSE组和MOSE-Myc组无肿瘤形成.结论 重组逆转录病毒载体作为转基因的工具,转导效率高,可稳定表达,可以感染正常的细胞;突变的K-ras可使MOSE发生恶性转化,在体内形成肿瘤;c-myc作为一个核转录调节因子,不能使MOSE发生恶性转化,但可协同其他因子,加强其他因子的功能.

尿激酶氨基末端基因抗乳腺癌细胞转移的实验研究

目的探讨尿激酶氨基末端（ATF）基因转移对肿瘤转移的抑制作用。方法构建重组ATF基因真核表达载体pcDNA3-ATF,用脂质体Lipofectin介导，将其导入其证明尿激酶（uPA）和尿激酶受体(uPAR)均有表达的人乳腺癌细胞系MCF-7。用Western blot检测转染细胞ATF基因的表达；体外观察并比较了野生型和转基因MCF-7细胞侵袭人工基底膜能力；裸鼠皮下接种癌细胞，复制自发性肿瘤转移模型，观察成瘤性和转移性。结果 uPA/uPAR在MCF-7中有较高水平的表达；转ATF基因后，可检测到ATF的明显表达，体外侵袭穿透人工基底膜的能力明显降低，体内原位成瘤性不受影响，但自主性肺转移能力有一定程度的下降。结论 ATF基因转移后，ATF的表达可能竞争性抑制内源性uPA与uPAR的结合，在一定程度上抑制癌细胞的侵袭和转移。

基因治疗的研究现状与评价

从1990年美国FDA批准第1项人类基因治疗的临床试验方案至今,基因治疗的研究已经走过了 10年余的历程,其研究迅速发展,但仍处于比较幼稚的阶段,还不能成为临床常规的治疗手段.目前已有少数有确切疗效的临床试验,现报告如下.

AP-2α基因转染对人类结肠癌SW480细胞体外增生及侵袭能力的影响

目的 探讨AP-2α基因对人类结肠癌SW480细胞体外增生及侵袭能力的影响.方法 构建PODNA3.1(+)-AP-2α真核表达载体,利用脂质体介导pcDNA3.1(+)-AP-2α和pcDNA3.1(+)转染5W480细胞,并以正常SW480细胞作为空白对照;采用RT-PCR与Western blotting分别检测转染48 h后各组细胞中AP-2αmRNA与蛋白的表达情况;采用平板克隆、软琼脂克隆形成试验以及Transweil侵袭试验,分别检测各组细胞体外增生及侵袭能力.结果 SW480细胞内源性AP-2α蛋白表达缺失;转染AP-2α基因后,在SW480细胞中可检测到高水平的AP-2αmRNA及蛋白,细胞克隆形成率降低(P<0.05),软琼脂克隆体积小且数量少,细胞侵袭能力下降(P<0.05).结论 转染AP-2α基因可以抑制人类结肠癌SW480细胞的体外恶性增生以及侵袭能力.

TH基因修饰的神经干细胞移植治疗帕金森病的实验研究

目的探讨TH基因修饰的神经干细胞脑内移植对帕金森病(PD)的治疗作用.方法构建pN2 ATH逆转录病毒载体质粒,用PA317细胞包装,G418筛选阳性克隆,病毒上清感染神经干细胞,将表达TH的神经干细胞植入PD大鼠纹状体内,测定PD大鼠旋转行为改善,DA和DOPAC含量变化,以及TH在纹状体的表达.结果TH基因修饰的神经干细胞移植8周时能显著降低PD大鼠旋转行为,增加纹状体DA和DOPAC含量,TH在纹状体内的表达增加,疗效好于单纯神经干细胞移植组.结论TH基因修饰的神经干细胞移植对PD大鼠有明显的治疗作用,可望为PD治疗提供新的途径.

重组人生长激素基因细胞移植

目的　通过重组人生长激素基因细胞移植为生长激素缺乏症(GHD)基因治疗的生物学表达研究奠定基础。方法　构建pLXSNhGH人生长激素(hGH)逆转录病毒表达载体后，脂质体转染包装细胞系PA317，提取包装细胞上清的病毒后，将病毒感染原代小鼠胚胎成纤维细胞，将细胞移植于小鼠腹腔内，观察hGH的表达情况。结果　hGH体内持续表达达2个月以上，但由于高滴度抗hGH抗体的影响，表达水平呈波动性。结论　重组人生长激素基因原代成纤维细胞移植体内的持续表达，为细胞移植系统引入GHD基因治疗的研究奠定了实验基础。

222经前庭液和耳蜗液两种途径基因转移后的小鼠内耳功能和结构变化

236内耳基因转导的研究进展

基因治疗是指在体细胞中转入具有治疗价值的新的遗传物质,使其在体内稳定表达,在一段时期内持续提供蛋白药物可达到治疗目的.对于一些日常用药物难以奏效的内耳疾病来说无疑是一种有潜力的治疗方法.由于内耳存在血迷路屏障,使得一些如生长因子、细胞因子和酶类等大分子难以通过血迷路屏障并输送到靶部位而发挥生物学作用.另外,由于这些蛋白质分子的半衰期短,因而需要重复多次耳蜗内注射及微泵灌注,技术上的复杂性大大限制了这类分子在内耳中的应用.故基因治疗的关键是建立有效的基因转移方法,以使目的基因得到高效率及长时间的表达.同时还要具备相应的调控手段.

携带Mathl基因的重组腺病毒构建和鉴定及在豚鼠耳蜗中的表达

目的 探讨利用重组腺病毒介导的Mathl基因转移治疗感音神经性耳聋的可行性.方法 利用腺病毒细菌内同源重组方法,构建携带Mathl基因的复制缺陷型重组腺病毒Ad-Mathl,通过向豚鼠耳蜗底回注射重组腺病毒Ad-Mathl后,利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测内耳Mathl的mRNA的表达,Western Blot方法检测Mathl蛋白表达.结果 构建的重组腺病毒Ad-Mathl酶切电泳鉴定正确,重组腺病毒Mathl通过底回导入豚鼠耳蜗24小时后检测到Mathl的mRNA表达:Western Blot方法检测到Mathl蛋白的表达.结论 本实验成功构建了携带Mathl基因的重组腺病毒,由腺病毒介导的Mathl基因转移可在豚鼠耳蜗内有效表达.

腺相关病毒载体(AAV)在视网膜色素变性基因治疗中的应用

随着分子生物学的发展，应用基因转移技术治疗视网膜色素变性疾病成为可能。目前研究认为腺相关病毒载体(AAV)能使外源基因有效地导入感光细胞而且在细胞中稳定长期表达，而且对细胞无毒性，将有可能成为有效的基因转染工具。本文对AAV病毒的形态、生长和分子生物学特征、AAV介导的视网膜细胞基因转移、AAV病毒载体在视网膜色素变性基因治疗中的应用、以及作为基因治疗载体的优缺点进行了综述。

视网膜疾病基因治疗的现状

近年来,随着分子生物学技术的发展、各种视网膜疾病机制研究的不断深入以及大量视网膜疾病的动物模型的建立,基因治疗技术已广泛地应用于视网膜疾病的基础与临床研究之中.本文对基因治疗的概念、策略、基因表达调控、基因转移的方法及其在常见视网膜疾病中的应用作一综述.

阳离子脂质体介导的p21WAF1基因转染对人角膜基质细胞增殖的影响

目的探讨阳离子脂质体介导的外源标志基因LacZ转染人角膜基质细胞的有效性和安全性及p21WAF1基因转染对人角膜基质细胞增殖的影响.方法 (1)利用阳离子脂质体 lipofectamineTM reagent介导的外源标志基因LacZ的质粒DNA转染人角膜基质细胞,行X-gal染色,确定转染率;(2)利用免疫细胞化学和四甲基偶氮唑盐法,观察阳离子脂质体lipofectamineTM reagent介导p21WAF1基因转染对人角膜基质细胞增殖的影响;(3)用0.5%锥虫蓝染色观察各组细胞活性率.结果阳离子脂质体lipofectamineTM reagent可介导含标志基因LacZ的质粒DNA对人角膜基质细胞的转染,在1∶4和1∶8两组中均观察到转染率随转染时间延长而增高,随观察时间延长而降低,在质粒DNA/脂质体比例为1∶8,转染时间为24 h,观察2 d时达高峰,为40.5%;阳离子脂质体lipofectamineTM reagent介导外源p21WAF1基因转染可提高人角膜基质细胞中p21蛋白的表达,并抑制该细胞的增殖;0.5%锥虫蓝染色显示各组细胞活性率均≥90%,未见明显细胞毒性.结论阳离子脂质体可介导外源目的基因对人角膜基质细胞安全、相对高效的转染;其介导的p21WAF1基因转染可抑制人角膜基质细胞的增殖;并无明显细胞毒性反应.

绿色荧光蛋白逆转录病毒及其介导的视网膜色素上皮细胞基因转移研究

目的制备携带绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)基因的逆转录病毒,感染原代与建株的人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞,评价逆转录病毒对人RPE细胞的感染能力,为视网膜病变的基因治疗奠定基础.方法分离编码GFP的cDNA片段并插入逆转录病毒载体pLNCX,借助脂质体将重组逆转录病毒载体pLNCX-GFP转入单嗜性及双嗜性包装细胞,G418筛选抗性克隆,分离GFP表达水平高的克隆,收集含病毒颗粒的上清液感染NIH3T3及体外培养的人原代与建株的RPE细胞.结果重组逆转录病毒载体pLNCX-GFP转染各种包装细胞后,可产生GFP逆转录病毒.由双嗜性包装细胞产生的GFP逆转录病毒能够感染原代与建株的人RPE细胞,GFP基因可持续在RPE细胞内表达.结论逆转录病毒能够简便、快速、稳定将目的基因转入RPE细胞,可作为眼底病变基因治疗介导目的基因转移的重要工具.

钙释放通道稳定蛋白基因转染对心力衰竭心室肌细胞收缩功能的影响

目的 探讨钙释放通道稳定蛋白FKBP12.6基因转染对心力衰竭心室肌细胞收缩功能的影响.方法 建立大鼠心力衰竭模型,采用酶解分离技术分离心室肌细胞,正常对照组用Ad-GFP感染正常心室肌细胞,Ad-FKBP12.6-GFP组用携带FKBP12.6基因的重组腺病毒Ad-FKBP12.6-GFP感染心力衰竭心室肌细胞,Ad-GFP组用Ad-GFP感染心力衰竭心室肌细胞.通过RT-PCR和Western blotting技术检测转基因的表达;在局部场刺激条件下,激光共聚焦线扫描检测心肌细胞内的钙瞬变,采用激光共聚焦面扫描测量心肌细胞舒张期末和收缩期末长度,以评价心肌细胞的收缩功能.结果 Ad-FKBP12.6-GFP组的FKBP12.6 mRNA和蛋白表达水平(分别为2.48±0.08,0.94±0.11)显著高于正常对照组(分别为0.96±0.12,0.48±0.07,P＜0.01)、Ad-GFP组(分别为0.47±0.08,0.25±0.04,P＜0.01),且正常对照组显著高于Ad-GFP组;Ad-FKBP12.6-GFP组的钙瞬变幅度(F/F0峰值,3.16±0.42)显著高于正常对照组(2.14±0.41,P＜0.05)、Ad-GFP组(1.43±0.38,P＜0.01),且正常对照组显著高于Ad-GFP组(P＜0.05);AdFKBP12.6-GFP组心室肌细胞收缩分数(9.36%±1.78%)显著高于正常对照组(8.17%±3.74%,P＜0.05)、Ad-GFP组(5.24%±1.25%,P＜0.01),且正常对照组显著高于Ad-GFP组(P＜0.01).结论 FKBP12.6基因转染改善了心力衰竭大鼠心室肌细胞的收缩功能,上调FKBP12.6的表达可能是心力衰竭治疗的一条新途径.

应用大鼠海绵移植模型评价血管内皮生长因子基因的成血管作用

为建立一种重复性好,能客观、连续地表明血管内皮生长因子(VEGF)基因的体内促血管生成作用的评价体系,将聚乙烯醇海绵植入大鼠皮下,构建大鼠海绵移植模型.术后5天,以VEGF表达质粒pCMV4-VEGF165与空载体pCMV4分别注射到植入的海绵内,观察转基因后7天、11天的血管生成及组织生长情况,以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)检测VEGF基因在海绵组织、血清及肝组织中的的表达情况.对海绵病理切片行苏木精-伊红(HE)染色及血管内皮细胞特异性Ⅷ因子免疫组化,应用计算机图像分析系统分析海绵内组织生长情况.以Stata软件对数据进行统计分析.结果显示:VEGF基因的表达局限于注射部位并明显促进海绵内组织生长,无远端效应.本研究应用大鼠海绵移植模型成功地观察到血管内皮生长因子基因的成血管作用,为VEGF局部转基因治疗缺血性疾病提供了理论基础.

靶向性腺病毒载体的研究进展

腺病毒载体广泛应用于恶性肿瘤的基因治疗,但它在体内应用时仍存在感染效率低、缺乏靶向性等问题.近年来,多种方法对腺病毒载体进行改建使之具有感染或表达的特异性,提高外源基因的表达效率和特异性.本文对腺病毒载体的靶向性构建相关进展作一综述,主要包括:①转导靶向设计,即通过改变腺病毒的嗜性,提高对靶细胞的转导效率或增加对靶细胞感染的特异性;②转录靶向设计,即在转录水平控制外源性基因的表达,限制基因在靶细胞中表达;③双靶向设计,即以上两方面结合起来改建腺病毒载体.

关节腔内注射裸露DNA治疗关节炎机制的实验研究

关节腔内注射裸露DNA,是实现关节内基因转移的一种简便的方法,但其机制尚不了解.本实验利用差速离心法,提取类风湿性关节炎患者关节滑膜细胞的非核膜蛋白,以大鼠肝细胞非核膜蛋白作为对照,应用 32P标记的DNA,进行DNA膜蛋白结合实验.我们发现在滑膜细胞微粒体膜的抽提物中存在一种非核DNA结合蛋白质,分子量约为83KDa,这种蛋白质能特异地与双链线状DNA结合,可能在关节滑膜介导的基因转移中起一定作用.

基因治疗在运动医学中的应用

基因治疗是人类很多疾病治疗的重大变革,为人类战胜疾病,延长寿命,提供了新的途径. 人类基因治疗领域的发展速度非常迅猛,已由早期针对单基因遗传性疾病的治疗迅速扩展到治疗获得性疾病,而且基因转移还可用作一种药物的传递系统.运动创伤经常涉及一些愈合能力十分有限的组织,例如,关节软骨、韧带、半月板、肌腱等.近研究证明,一些生长因子和细胞因子在愈合过程中起着重要作用,这些分子有望成为治疗运动创伤的新药,但是从临床上讲还没有有效的方法能将它们传入体内.发展基因治疗技术可以通过局部的方法将生物药物传入体内.目前已完成了将标记基因传递到滑膜、软骨细胞、半月板纤维软骨细胞、腱细胞和韧带成纤维细胞中的实验研究,为基因治疗终在运动医学领域中的临床应用奠定了基础[1,2].