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生物素代谢及其对基因表达影响的研究现状
1 生物素及其代谢生物素,又称作维生素H,是有机体必需的一种维生素,在羧化和脱羧反应中发挥辅酶作用.人类细胞中有5种生物素依赖性羧化酶,在催化糖原异生、氨基酸分解代谢和脂肪酸合成中起关键作用.在遗传性疾病中,生物素利用和循环的微妙平衡被打破,同时导致代谢稳态的破坏.
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Box-Behnken效应面法优化主动靶向复方阿霉素/槲皮素脂质体
目的 通过Box-Behnken效应面优化法筛选处方,制备生物素介导的阿霉素和槲皮素的复方脂质体.方法 采用薄膜分散法制备槲皮素脂质体,通过硫酸铵梯度法主动包载阿霉素.分别以磷脂与胆固醇质量比(X1)、脂质与槲皮素质量比(X2)、硫酸铵浓度(X3)和孵育温度(X4)为考察指标,以阿霉素(doxorubicin,DOX)包封率(y1,w旺/%)、槲皮素(quercetin,QUE)包封率(y2,wEE/%)及粒径(y3,d/nm)为评价指标;采用四因素三水平Box-Behnken效应面优化法筛选脂质体处方;测定优化脂质体的粒径、zeta电位和外观形态并考察脂质体的稳定性.结果 优化处方工艺为磷脂与胆固醇质量比为3.48∶1;磷脂与槲皮素质量比为26∶1;硫酸铵浓度为0.15 mol·L-1;阿霉素孵育温度为50℃;载药脂质体的平均粒径为148.5 nm;zeta电位为-23.1 mV;15 d内泄露率小于20%.结论 采用Box-Behnken实验设计法优化处方所得数学模型预测性良好,可以用于复方阿霉素/槲皮素脂质体的处方优化.
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生物素修饰的冬凌草甲素脂质体的处方工艺优化
目的 制备生物素修饰的冬凌草甲素脂质体,考察处方和工艺各因素对包封率的影响.方法 以包封率为指标,应用L9(34)正交实验设计优化生物素修饰的冬凌草甲素脂质体的处方和工艺.结果 佳处方组成为磷脂的质量浓度为30 g·L-1,氢化大豆卵磷脂(hydrogenated soybean phospholipids,HSPC)与大豆卵磷脂(soybean phospholipids,SPC)的质量比为1∶1,pH6.8的磷酸盐缓冲液,药物与磷脂的质量比为1∶18,磷脂与胆固醇的质量比为6∶1.生物素-甲氧基聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(Biotin-PEG2000-DSPE)摩尔浓度为6 mol·L-1.佳制备工艺为二氯甲烷10 mL,成膜温度40℃.包封率为(81.52±2.21)%(n=3),平均粒径为(131±26) nm,Zeta电位为-(26.2±1.1)mV.结论 优化得到佳处方,制得的生物素修饰的冬凌草甲素脂质体粒径较小,包封率较高.
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高效液相色谱法测定6种水溶性维生素
水溶性维生素包括Vit C、Vit B1、Vit B2、Vit B6、Vit B12、烟酸、叶酸、生物素、泛酸等.在以前的测定中应用较多的方法有光度法、微生物法、酶标法等,这些方法费时且不能同时测定.高效液相色谱法可快速分离、能同时测定多种水溶性维生素.
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血管紧张素Ι化学发光免疫分析方法的建立
目的:建立人血管紧张素Ⅰ( Ang Ⅰ)化学发光免疫分析方法,通过测定血浆中血管紧张素Ⅰ的含量计算肾素活性。方法:用生物素标记Ang Ⅰ抗原,荧光素标记AngⅠ抗体,将抗荧光素抗体包被于化学发光板,以链亲和素酶为催化剂,采用竞争法建立Ang Ⅰ化学发光免疫分析方法。结果:本方法的测量范围为100~7800 pg/ml,灵敏度为24.3 mU/ml,批内变异为5.6%~8.7%,批间变异为6.8%~10.4%,回收率为95.4%~105.3%,稀释实验测定值与理论值呈线性相关,相关系数为r=0.999。与放射免疫分析试剂盒的相关性方程分别为y=0.95x+235.70,相关系数r=0.973。包被板、生物素标记AngⅠ抗原以及荧光素标记AngⅠ抗体在37℃存放一周稳定性良好。结论:方法学鉴定结果符合免疫分析的基本要求。
关键词: 血管紧张素Ⅰ(AngⅠ) 生物素 荧光素 链亲和素酶 化学发光免疫分析 -
异基因骨髓移植中T细胞表达Ly49A与移植物抗宿主病发生相关
杀伤细胞抑制性受体(Killer Inhibitory Receptor,KIR)是一种主要表达在NK、T细胞上的抑制性信号传递分子[1].鼠的KIR分子被称为Ly49家族(Ly49A-I).在细胞免疫识别阶段,Ly49分子特异地与不同的MHC I分子配体结合,传递抑制性信号,抑制杀伤细胞的早期活化.移植物抗宿主病(GVHD)主要是供者T细胞活化后对宿主细胞和组织的攻击所致.Ly49A/MHC I作为T细胞活化的抑制性信号传递分子,其在GVHD发生中的表达如何将有助于揭示KIR分子参与控制GVHD的可能机制.本文采用抗生物素-生物素-过氧化物酶复合物(ABC)的免疫组织化学法检测正常鼠和半相合异基因骨髓移植后发生GVHD鼠T细胞Ly49A表达.
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应用ABC法检测淋球菌病48例
亲合素-生物素辣根过氧化物酶复合物(ABC)法是近些年来引入免疫诊断学中的一种新技术,目前被广泛应用于可溶性细菌[1]、病毒[2,3]及真菌[4]的抗原及抗体的检测中是免疫组织化学的一个进展[5].但用此法将免疫学与形态学相结合检测淋球菌报道较少,2004年尹占东、张亚芹建立了ABC法检测淋菌的新技术[6].本文应用此方法对淋病患者分泌物涂片进行检测,显微镜下观察淋球菌的形态,有效地提高了淋菌的检出率.
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生物素与bcl-2在脑胶质瘤中的表达及其生物学意义
目的 探讨凋亡蛋白抑制因子生物素( Survivin)基因在脑胶质瘤中的表达与其在脑胶质瘤恶性增殖和抗细胞凋亡中的作用,及与Bcl-2基因在脑胶质瘤中的相关性.方法 选择50例脑胶质瘤标本,采用免疫组化链霉卵白素生物素复合物(SABC)方法检测Survivin和增殖细胞核抗原(PCNA)蛋白及bcl-2的表达,分别计算Survivin免疫反应评分(IRS)和增殖指数(PI);采用TUNEL方法检测脑胶质瘤凋亡细胞,计算凋亡指数(AI).结果 脑胶质瘤Survivin IRS、PI及AI分别为3.8±3.9、15%和0.9%,三者均随脑胶质瘤病理级别的增高而升高(P均<0.05).Survivin阳性组PI明显高于阴性组PI(P<0.05),PI与Survivin IRS呈显著正相关(r=-0.372,P<0.001).Survivin阳性组与阴性组之间AI差异无统计学意义(P>0.05),但AI与Survivin IRS呈显著负相(r=-0.372,P<0.001).结论 Survivin在脑胶质瘤中高表达,随病理级别增高而明显升高.其在脑胶质瘤恶性增殖和抗细胞凋亡过程中发挥重要作用.Bcl-2可以上调生物素的抗凋亡效应,两者呈正相关.
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生物素-亲和素-DNA纳米颗粒信号放大检测载体的构建
目的 构建用于检测细菌、病毒等病原体DNA的生物素-亲和素纳米颗粒信号放大载体.方法 设计并合成两端和一端标记生物素的寡核苷酸探针(2B/1B-DNA),与抗生蛋白链菌素葡聚糖(Poly-STV)通过生物素与亲和素作用,偶联形成大分子纳米网状颗粒,并筛选佳探针类型及其长度、2B-DNA和Poly-STV的浓度及比例和反应条件.结果 2B-DNA和Poly-STV形成纳米颗粒信号放大载体的佳浓度分别为1 μmol/L和5 μmol/L.佳浓度比为1:5,2B-DNA长度为60 bp,缓冲液为Buffer B,反应条件为55℃,800 r/min,20 min.结论 已成功构建了生物素一亲和素大分子纳米颗粒,可作为DNA检测信号放大技术的备选载体.
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用于表位抗原标记的抗HA高亲和性抗体(3F10)
新的抗HA高亲和性抗体(3F10克隆)现在可与生物素、荧光素(FITC)或辣根过氧化物酶(HRP)有效结合,这些结合物与市售的其他抗HA抗体产生相比,结果更清晰.敏感性更高,特异性更好.由于此抗体具高亲和性,所以用低浓度的抗体就可以获得更好的特异性.另外,抗HA高亲和性抗体结合物使蛋白定位和测定工作简单化,可做一些以前无法进行的试验.
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延长用于荧光原位杂交的DNA探针的使用寿命
FISH所需的整条染色体标记探针是由数千个单一序列组成的,每个单一序列都是原始序列的多个拷贝.这些探针是用DOP-PCR法扩增经纤维切割或流式分类法所获DNA.获取染色体DNA后即可进行PCR,30~40个循环,产物即为原始序列储备液.取一小份用生物素或若丹明标记即可作为FISH的标记探针,这些探针用完后可在PCR产物中再取少量重新制备探针.为避免再次做纤维切割或流式分类,可取一份这样的储备液进行再扩增,但无需标记,这样就可以获得更多的未标记DNA储备液以制备更多的探针.
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一种基于三顺反子表达载体的生物素诱导表达系统的建立
目的:建立一种以无毒的生物素为诱导剂的哺乳动物细胞诱导表达系统.方法:通过基因组PCR或重叠延伸PCR获得该系统的三个基本构件:大肠杆菌生物素连接酶(BirA)、链亲和素-四环素依赖的抑制因子融合蛋白(SA-TetR)和生物素化信号-VP16转录激活结构域融合蛋白(Avitag-VP16).将上述基因连入三顺反子表达载体,与响应载体一起共转染293f细胞,以EGFP为报告基因,检测EGFP荧光强度随培养体系中生物素浓度变化的情况.结果:随着生物素浓度的增加,目的基因表达出现OFF-ON-OFF的变化,诱导状态下的EGFP荧光强度约为抑制状态下的3倍.结论:可通过调节生物素浓度对目的基因的表达进行可逆的调节,该系统是一种有应用前景的诱导表达系统.
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柯萨奇B组病毒与病毒性心肌炎和扩张型心肌病关系的研究
病毒性心肌炎和扩张型心肌病是心血管疾病中的常见病和多发病.许多学者的研究证实病毒性心肌炎的发病大部分与肠道病毒感染有关,尤其以柯萨奇病毒为多见[1-4],占心肌炎的40%~50%.关于扩张型心肌病的病因很复杂,可能与病毒感染、免疫障碍、神经体液因素、小血管病变、酗酒、遗传、中毒等因素有关.但目前有许多资料提示扩张型心肌病与病毒感染有关[5-8],主张它是由CBV感染导致心肌炎进一步发展的结果.确定病毒感染与病毒性心肌炎和扩张型心肌病的关系,对两病的预防、诊断和治疗均具有指导意义.本实验用CBV3cDNA重组质粒PGP51BDNA片断,通过光敏生物素法制备CBV3cDNA核酸探针与心肌切片标本进行原位杂交,检测心肌组织中柯萨奇B组病毒核酸,证实了柯萨奇B组病毒与病毒性心肌炎和扩张型心肌病的关系.
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两种培养基对阴道加德纳菌分离鉴定的比较
阴道加德纳菌(gardneralla vaginalis,GV)是非特异性阴道炎(nospecific vaginitis,NSV)的主要致病菌之一,在一般条件下不易生长,生长需要利用生物素、叶酸、烟酸、硫胺素、核黄素并至少两种嘌呤-嘧啶.常规实验室培养基不足以提供适宜的生长条件,而国外的GV分离培养基价格昂贵,因此研制一种价格低廉,检出率高,又易于推广应用的培养基,非常有必要.我室自行配制一种既有选择性又有鉴别性的人血H培养基获得满意效果.现报告如下.
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免疫荧光技术和免疫酶标法在T淋巴细胞亚群检测中的应用体会
用McAb检测T淋巴细胞亚群的方法有多种,如生物素-亲和生物素-辣根过氧化物酶复合法,免疫金银法,免疫酶标法(APAAP法)、荧光抗体技术和流式细胞仪技术,其中FACS方法先进,但仪器价格昂贵,目前还只能在少数实验室使用.我们实验室目前使用的是荧光抗体技术和APAAP法,经反复摸索实验,将两种方法介绍如下.
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人可溶性B7-2分子的定量检测及应用
选取识别不同抗原位点的鼠抗人B7-2单抗1F9和6C8分别作为包被和检测抗体,用生物素(Biotin)标记检测抗体,建立双单抗夹心的sB7-2检测方法.在对其特异性、稳定性和准确性进行分析的基础上,对20例系统性红斑狼疮(SLE)患者及30名健康献血者血清中sB7-2的含量进行了测定.建立的sB7-2检测方法的灵敏度为0.15 ng/ml,具有良好线性关系的检测范围0.31~20.00 ng/ml.单抗1F9包被的测定板,4 ℃放置30 d内,工作曲线中各测定点的变异系数<5.9%.SLE患者血清中sB7-2的含量为(2.207±0.517) ng/ml,与健康献血者的(1.275±0.263) ng/ml比较具有统计学的显著差异(p<0.01).本研究中建立的人sB7-2检测方法,能够对血清中sB7-2进行定量分析,可为该分子的基础研究及临床相关疾病的辅助诊断与判断预后提供参数.
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抗生物素单克隆抗体的制备及其在核酸检测中的应用
生物素与亲和素有相当强的亲和力(Kd10-15M),已被广泛用于细胞化学、免疫组织化学、免疫测定以及核酸原位分子杂交。但是生物素-亲和素系统中,亲和素是一种高碱性(PH0.5)糖蛋白,易引起较强的非特异性结合。近Bager报道抗生物素抗体有模拟亲和素功能作用,并显示较好的特异性[1]。本文报道建立二株抗生物素单克隆抗体,并初步用于乙型肝炎DNA的检测。
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生物素-亲和素系统控制细胞在表面的粘附力
粘附作用具有重要的生理学意义.细胞与表面的粘附是产生多种生物效应(包括生长、分化、迁移等)的基本要素.比如,细胞与表面粘附较强时,细胞通常生长;细胞与表面粘附减弱时,细胞发生分化;而细胞要进行分裂,首要的是先去粘附.
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妊娠相关血浆蛋白A酶联免疫诊断方法学研究
目的 建立供临床检测妊娠相关血浆蛋白A(PAPP-A)的酶联免疫诊断方法.方法 用足月孕妇血清通过分子筛以及离子交换层析纯化后制备抗体,进而制备生物素标记的PAPP-A以及酶标记抗体.按照常规的酶联免疫吸附试验(ELISA)操作步骤检测标本,观察本方法的敏感性、特异性、回收率、稳定性等指标.测定30份早孕患者血清与美国DRG公司试剂盒做对比.结果 分子筛与离子交换层析纯化效果良好.标准曲线范围为1~50 μg/mL.敏感性为0.35 μg/mL,回收率均>100%,特异性、稳定性试验结果显示效果良好.本试验方法与美国DRG公司试剂盒检测结果高度相关,回归方程为:Y=2.286 1+1.026 9X(r=0.982,P<0.01).结论 PAPP-A抗体标记生物素后,利用生物素与亲和素的高度亲和力进行ELISA,该方法在PAPP-A的临床检测中有较大的实际意义.
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重视化验单之外的信息——由生物素干扰检验而被误诊为Graves病甲状腺功能亢进症的实例谈诊断甲状腺疾病的要素
本文首先介绍一个生物素干扰甲状腺指标检验,结果误诊为Graves病甲状腺功能亢进症的临床实例,并借此思考正确诊断甲状腺疾病的要素,倡导坚持以患者为中心,重视化验单之外的信息,合理看待辅助检查在疾病诊断中的权重.