病毒学报杂志
Chinese Journal of Virology 병독학보
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H5亚型禽流感病毒现场实时荧光RT-LAMP检测方法点的建立与优化
H5亚型禽流感是重要的人兽共患病,建立现场快速分子学检测方法是其防控关键.本实验首次借助热裂解法抽提病毒RNA,建立H5亚型禽流感病毒(H5 subtype avian influenza Virus,AIV-H5)实时荧光反转录环介导等温扩增(Fluorescent quantitative real-time reversetranscription-LAMP,qRT-LAMP)检测法,并对该法进行特异性、敏感性、可重复性及可靠性分析；同时对比钙黄绿素(Calcein)、SYBR Green Ⅰ、羟基萘酚蓝(Hydroxynaphthol blue,HNB)、SYTO 81四种荧光染色剂在颜色判定中的工作情况,筛选佳染料.试验结果显示本实验所建AIV-H5qRT-LAMP法可有效鉴别AIV-H5,其敏感性较国家标准实时荧光RT-PCR检测法高100倍,低检测限可达1个基因拷贝；该法与IBV、NDV等常见禽呼吸道传染病病原无交叉反应,特异性强；同时该法具有良好重复性.本实验筛选出佳染色剂Calcein.小规模田间试验显示该法用于AIV-H5的普查监测结果可靠.可见本实验建立AIV-H5 qRT-LAMP检测法可满足AIV-H5现场快速分子检测需求,具广阔应用空间.
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利用细胞筛选法从噬菌体抗体库鉴定人源HIV-1单克隆中和抗体
以细胞法从HIV-1 CRF07_BC特异性噬菌体抗体库中筛选和鉴定针对病毒包膜蛋白(Envelope,Env)的人源单克隆中和抗体.将pCH064.2-Env质粒转染293T细胞,以表达Env的活细胞淘洗噬菌体抗体库;利用细胞ELISA方法筛选Env特异性噬菌体阳性克隆,并测定抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)序列;以Ni+2_NTA层析柱纯化抗体Fab,SDS-PAGE分析抗体纯度;采用基于转染细胞和重组蛋白的ELISA以及流式细胞技术分析抗体的结合活性;以HIV-1假病毒系统评价抗体的中和活性.四轮淘洗使细胞特异性噬菌体得到约650倍的高度富集,细胞ELISA筛选到28个抗HIV Env的阳性克隆,序列分析发现五个具有不同VH和VL序列的抗体Fab(2801、2837、2863、2870和2920).这些抗体与转染env的293T细胞反应,但不与重组表达的可溶性gp120蛋白反应,说明它们有可能针对依赖于Env复合物的空间构象表位.我们发现2801、2863和2870三个Fab抗体对HIV-1 CRF07_BC亚型CH120.6毒株具有较强的中和活性,其IC50值分别为2.24 μg/mL、0.89 μg/mL和3.09μg/mL.其中,2801和2863对B亚型HIV-1毒株SF162具有较强的交叉中和作用,其IC50值分别为0.69 μg/mL 和3.52 μg/mL.提示表达于293T细胞表面的HIV-1 Env可以有效富集和筛选噬菌体抗体库,并能成功分离和鉴定依赖于Env空间构象表位的HIV-1中和抗体.因此本研究为探讨HIV-1中和抗体的反应机制和研发艾滋病疫苗提供了新的技术平台.
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鸭甲肝病毒3型2012年山东分离株VP1基因的序列分析
为揭示近年来鸭甲肝病毒3型(DHAV-3)中国分离株VP1基因的遗传变异规律,本研究对2012年从山东省分离到的13株DHAV-3的VP1基因分别进行PCR扩增、序列测序与分析.结果显示,13株DHAV-3的VP1基因均由720个核苷酸组成,共编码240个氨基酸,核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别为94.6％～99.9％和95.0％～100％.与GenBank中公布的31株DHAV-3的VP1基因的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为92.5％～100％和90.8％～100％.系统进化分析显示,DHAV-3可分为两个基因型,其中除疫苗毒B63之外所有中国分离株均属于GⅠ型,越南分离毒株主要属于GⅡ型S1亚型,而韩国分离株组成GⅡ型中的S2亚型,具有明显的地域特征.
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构建一种新型腮腺炎病毒核酸检测阳性对照品
为快速鉴定腮腺炎病毒核酸检测中由阳性对照引起的交叉污染问题,本研究建立了一种新型腮腺炎病毒核酸检测阳性对照.该阳性对照为合成的RNA转录产物,在使用相同的引物和反应条件下,该阳性对照在RT-PCR和巢式PCR试验中产生的PCR产物和正常腮腺炎病毒核酸阳性标本的PCR产物片段长度不同,通过比较PCR产物的大小可快速鉴定由阳性对照引起实验室交叉污染.这种新型腮腺炎病毒RNA阳性对照可广泛应用于腮腺炎病毒实验室诊断和基因定型中,对腮腺炎病毒核酸检测可进行良好的实验室质量控制.
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2009～2011年甘肃省和陕西省流行的人副流感病毒3型基因特征分析
为了解我国甘肃省、陕西省流行的人副流感病毒3型(Human parainfluenza viruse-3,HPIV-3)的基因特征和流行规律,2009～2011年从上述两省急性呼吸道感染患者中共采集咽拭子标本719份,采用多重反转录聚合酶链反应(Multiplex reverse transcription polymerase chain reaction,多重RT-PCR)方法对常见呼吸道病毒性病原体进行筛查,HPIV-3阳性标本再用巢式PCR(nested polymerase chain reaction,nested PCR)扩增其血凝素-神经氨酶蛋白(Hemagglutinin-neuraminidase,HN)基因,进行序列测定和基因分析.共获得13株HPIV-3 HN基因序列,均属于C3亚群,核苷酸差异和氨基酸差异分别为0.2％～2.3％和0～1.1％.与美国、加拿大和澳大利亚的HPIV-3的HN基因序列之间的核苷酸差异和氨基酸差异较大,大分别为6.0％和3.4％.shaanxi09 2与shaanxi10H0091、shaanxi10-H0055与gansu11-62110372和shaanxi09-2与BJ/291/09之间存在核苷酸差异分别为0.9％、0.5％和0.6％,但均无氨基酸差异.提示甘肃和陕西两省在不同年份之间存在HPIV-3的持续循环传播.引起2009～2011年甘肃和陕西两省HPIV-3流行的毒株属C3亚群.
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H5N1亚型禽流感病毒HA糖基化位点缺失突变株的构建及生物学特性
不同H5亚型禽流感(AIV) HA上糖基化位点的分布是不同的,然而不同糖基化位点对病毒的作用仍不十分清楚.本研究利用定点突变和反向遗传操作构建了3个不同糖基化位点单缺失突变病毒,并对其增殖特性和毒力进行了测定.结果表明,通过HA基因序列测定和免疫印迹分析证实已成功去除了特定糖基化位点.158位糖基化位点缺失突变株rS△158在鸡胚中的EID50和MDCK细胞上TCID50比野生型rS略低,空斑直径显著减小;而单独去除169位和290位糖基化位点的rS△169和rS△290的EID50和TCID50略高于野生型rS,空斑直径相近,但空斑数要比后者高出10倍以上.所有突变株及野生型病毒在CEF上增殖速率相同,对SPF鸡均是高致病性的.因此,糖基化位点可影响病毒的体外增殖,但结果因细胞而异.
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禽白血病病毒J亚群自然感染蛋鸡病毒负载、受体表达及致瘤谱关系
J亚群禽白血病病毒(Subgroup J avian leukosis virus,ALV-J)通过与宿主细胞膜上的受体chNHE1蛋白结合感染细胞并引起宿主发病,进而引起肿瘤.本研究对确诊为ALV-J感染的肿瘤携带鸡进行病理组织学观察和病毒分离,应用荧光定量PCR技术检测ALV-J自然感染蛋鸡体内ALV-J负载量与其受体chNHE1蛋白mRNA表达量,分析ALV-J负载量、受体表达量及致瘤谱之间的相关性.结果显示:ALV-J在蛋鸡及地方品种鸡体内所诱发的肿瘤呈现多样化,但是病毒负载量与肿瘤谱相关性不明显;ALV-J负载量与chNHE1蛋白mRNA表达量呈正相关;组织在发生肿瘤时chNHE1蛋白mRNA表达量升高,可见,chNHE1蛋白不仅是ALVJ感染宿主细胞的受体,而且在肿瘤形成过程中也发挥重要作用.本研究为ALV-J致瘤机制的深入研究提供了科学基础.
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HIV-1感染上调细胞系中泛素样蛋白ISG15表达
利用体外细胞感染模型,分别检测HIV-1感染的细胞系中转录和翻译水平ISG15的表达及细胞上清中p24蛋白水平,探讨HIV-1感染对ISG15表达的影响及后者对前者的抑制效应.6种HIV-1易感细胞系中,以IFN-α2b刺激作为阳性对照,利用HIV-1感染性克隆pNL4-3转染293T、TZM-bl和HeLa细胞;HIV-1假病毒感染Jur-kat、MT-4和THP-1细胞,24 h收细胞提取RNA,利用荧光定量PCR (qPCR)的方法检测转录水平ISG15的表达情况.48 h后收细胞提取总蛋白,Western blot检测蛋白水平ISG15的表达情况.HIV-1感染或转染后明显上调ISG15转录水平,且THP-1和TZM-b1细胞中上调尤为显著.但除了TZM-bl细胞,其他5种细胞系中没有表现出ISG15蛋白水平的上调.ISG15真核表达质粒与HIV-1感染性克隆pNL4-3共转染结果显示,293T细胞中ISG15能直接抑制HIV-1子代病毒颗粒的产生和成熟,并且这种抑制作用具有时间剂量依赖性;TZM-bl中虽然也有显著的抑制作用,但是趋势不同.HIV-1感染明显上调ISG15转录但却无ISG15蛋白产生,预示该病毒能对抗固有免疫细胞的识别活化及其效应功能,具体机制还有待进一步阐明.
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人副流感病毒3型HN糖蛋白N-糖链的功能研究
为了研究人副流感病毒3型(hPIV3) HN糖蛋白N-糖链的功能,采用基因定点突变技术构建糖基化位点突变体,然后检测各突变株的蛋白电泳速率、细胞表面表达量、受体结合活性、神经氨酸酶活性和促细胞融合活性.HN分子的G1、G2、G3和G4 4个糖基化位点分别和联合突变后发现G1、G2和G4及其联合突变株(G12、G14、G24和G124)电泳速率加快,而G3突变株电泳速率没有变化.各突变株的表达效率,神经氨酸酶活性与野毒株相比差别无统计学意义(P＞0.05),但受体结合活性和促细胞融合活性均有不同程度的降低(P＜0.05).G1、G2和G4位点突变后受体结合活性分别为突变前的83.94％、76.45％和55.32％,而促细胞融合活性降为突变前的80.84％、77.83％和64.16％.联合突变株G12、G14、G24和G124血吸附活性进一步降低,为突变前的33.07％、20.67％、19.96％和15.11％,促细胞融合活性进一步降低为突变前的46.36％、12.04％、13.43％和4.05％.结果表明:hPIV3 HN糖蛋白的糖链对HN糖蛋白的受体结合活性和促细胞融合活性有重要影响,推断糖链的丢失可能会引起HN糖蛋白头部结构(受体结合活性位点所在区域)或者方向的改变或者无法与宿主细胞膜表面的凝集素受体(一种与N-糖链结合的受体)结合,进而导致受体结合活性和促细胞融合活性的降低.
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苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒E25序列突变对其入核定位和芽殖型病毒体增殖的影响
为了认识杆状病毒E25不同区段序列对其入核运输和定位及对病毒复制的作用,用egfp依次替代苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒e25不同区段序列或插入其不同位点构建7个e25突变体,分别插入e25缺失型或野生型bac-mid构建了14个e25突变型bacmids,用于对Sf9细胞的转染感染实验.免疫荧光和共聚焦显微镜分析显示,由EGFP替代E25 2～45aa构成的融合蛋白在被转染细胞质中弥散分布;EGFP插入1aa/2aa处构成的融合蛋白沿核膜外侧分布,未入核;EGFP替代46～118aa或插入118aa/119aa处形成的E25-EGFP在细胞核膜内、外侧和核质中呈稀疏点块状分布.EGFP替代119～228aa或插入45/46aa或C-末端的融合蛋白的定位与野生型bacmid转染细胞中的E25相似,呈环状或弥散分布.这些结果显示虽然E25 N-端序列对其定向入核运输和膜定位是必需的;但其中间段序列对其入核运输和定位也有一定影响.在正常E25和E25-EGFP突变子同时存在的情况下,不同的E25-EGFP突变子与正常E25呈现共定位特征,显示E25可能以二聚体或多聚体形式存在.在转染-感染实验中,只有兼含正常e25和2～45aa编码序列被替代的e25突变体的bacmid能够产生高感染性芽殖型病毒体(Buddedvirus,BV);其它e25突变型bacmids只能产生少量或完全不能产生感染性BV,显示E25结构严谨,所有替代和插入突变都导致其功能丧失或异常.
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传染性造血器官坏死病毒糖蛋白原核表达及免疫原性分析
为了建立传染性造血器官坏死病毒的免疫学检测方法,本研究以IHNV-Sn分离株基因组提取物为模板,利用RT-PCR方法扩增出其表面糖蛋白(glycoprotein,G)的基因序列(1527bp).将该基因克隆到pET27b(+)表达载体中构建出重组质粒pET27b-G,通过大肠杆菌BL21 (DE3)表达菌株获得高效表达.SDS-PAGE电泳分析显示表达蛋白约55 kD,大部分以包涵体的形式表达.利用尿素变性复性处理后获得高纯度的纯化蛋白,制备兔抗血清.间接ELISA结果显示,所制备的兔抗血清能够与重组糖蛋白和IHNV-Sn病毒株表面糖蛋白发生特异性反应,与重组蛋白的反应效价为1∶20 000;间接免疫荧光结果显示,该兔抗血清可与IHNV-Sn分离株和IHNV参考毒株产生特异性的荧光,以上结果说明本研究所表达的IHNV糖蛋白具有良好的免疫原性和免疫反应性,该研究为IHNV检测方法的建立及疫苗的研制提供了基础材料和理论依据.
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人感染猪流感病毒概述
本综述通过总结人感染猪流感病毒(Swine influenza viruses,SIVs)的病例,归纳了与SIVs感染有关的危险因素以及人感染SIVs的诊断方法.数据表明从1958年首次用血清学方法证明SIVs感染人至2009年3月甲型H1N1暴发前,全球报道的人感染猪流感病毒共有56例,其中7例死亡.从2009年甲流暴发后至今,SIVs的感染人数超过300人(不包括甲流感染病例).虽然猪群暴露史是人感染SIVs的重要危险因素,但仍有一半感染者在感染近期没有接触史,提示SIVs还有可能通过其他未知的途径突破种群屏障感染人.此外,流行病学资料表明部分病例可能存在有限的人传人.因此,进一步加强和完善我国人群和猪群中SIVs的监测,有利于做好流感大流行的应对工作.
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SELEX技术及近年研究进展
指数富集配体系统进化技术(Systematic evolution of ligand by exponential enrichment,SELEX)是近20年来出现的一种新型体外筛选技术.该技术将文库技术与筛选技术相结合,从核酸文库中筛选出的一段核酸分子:配基-适配子(aptamer);适配子与抗体类似,可以与相应靶物质特异性结合.SELEX技术筛选适配子的技术有快速的进步,而适配子也被应用到医学生物学等各个方面.在HIV等病毒学研究与治疗方面,SELEX的应用也有了可观的进展,多种病毒的相关适配子被筛选出来,为病毒相关疾病的防治提供了新的方向.本文主要就近三年来的SELEX技术发展状况及在应用上的发展进行简要综述.
关键词： 指数富集的配体系统进化 适配子 -
风疹病毒诱导细胞凋亡分子机制的研究进展
风疹病毒是披膜病毒科风疹病毒属的唯一成员,能够诱导细胞发生细胞凋亡.Ras-Raf-MEK-ERK和PI3K-Akt信号通路是病毒增殖与细胞生存的必要通路,在细胞凋亡过程中起着必不可少的作用.p53蛋白和TAp63蛋白能够进入细胞核与DNA特异结合,抑制Bcl-2的表达,促进Bax的表达,导致线粒体内外膜间的物质(细胞色素C等)释放,进而引起caspase级联反应,终导致细胞凋亡.本文从风疹病毒感染的细胞系,病毒感染导致的细胞病理改变和病毒诱导的细胞凋亡信号通路及其相关因子等方面对风疹病毒诱导细胞凋亡的分子机制进行了综述.
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正黏病毒科索戈托病毒研究进展
索戈托病毒属于正黏病毒家族,是一种由蜱传播给人或动物的虫媒病毒,其基因结构特征、复制及转录、编码产物的功能等与流感病毒有诸多相似之处,对流感病毒保守位点的探究具有重要意义,而且索戈托病毒属病毒的动物模型有望作为人感染高致病性流感病毒的一个替代模型.不过迄今为止全球对索戈托病毒的研究尚少,尚未引起足够的重视.本文主要对索戈托病毒的分类、基因组成及各基因编码产物、进化特点等进行了介绍,重点总结了其第六个基因片段编码的基质蛋白M和ML蛋白在病毒复制周期中所发挥的作用以及病毒与宿主间的相互作用机制等方面的研究进展.
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化学修饰的重组腺相关病毒载体
重组腺相关病毒(Recombinant adenovirus-associated virus,rAAV)载体源于腺相关病毒(Adeno-associated virus,AAV),以其无致病性、低免疫原性、可定点整合及在宿主细胞内长期表达等优势,广泛应用于肿瘤和遗传疾病等基因治疗研究,被视为有前途的基因治疗载体之一.但是人体内广泛存在AAV中和抗体,以及rAAV对体内特定组织或细胞的靶向性欠理想,限制了其在临床上的应用.经化学修饰的rAAV可以抵御血清中和抗体,提高转导靶向性,还可实现rAAV体内动态监测,这为解决当前rAAV载体的问题提供了新的思路和方法.本文对化学修饰的rAAV展开系统阐述,并对其未来发展趋势作出展望.
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人星状病毒非结构蛋白C末端nsP1a/4蛋白6种删除突变体的构建与表达分析
星状病毒(Human astrovirus,HAstV)是通过引起小肠上皮细胞凋亡从而导致婴幼儿腹泻的重要病原体.课题组前期研究表明HAstV非结构蛋白nsP1a C末端蛋白nsP1a/4是诱导凋亡的主要功能性蛋白,可能含有与凋亡相关的重要结构域.为了探索nsP1a/4蛋白中的凋亡结构域,本研究采用绿色荧光蛋白真核表达载体,根据nsP1a/4蛋白功能性结构域的位置,选择不同的删除位点,构建nsP1a/4蛋白及不同结构域删除的nsP1a/4蛋白突变体,并将其转染BHK21细胞,在转染的24～72h检测重组蛋白在细胞内的表达并进行初步分析.结果显示,24h后荧光显微镜下可观察到融合nsP1a/4蛋白和其突变体的绿色荧光.Western blot分析结果显示7种融合蛋白均能在体外细胞中高效表达,72h表达量明显高于48h.这些结果表明我们构建的nsP1a/4蛋白及其删除突变体可在BHK21细胞中表达,可用于HAstV非结构蛋白nsP1a/4的凋亡结构域研究,从而为进一步研究HAstY分子致病机制提供研究平台.
| 年 | 期数 |
| 2018 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2017 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2016 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2015 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2014 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2013 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2012 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2011 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2010 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2009 | 01 02 03 04 05 06 z1 |
| 2008 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2007 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2006 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2005 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2004 | 01 02 03 04 |
| 2003 | 01 02 03 04 |
| 2002 | 01 02 03 04 |
| 2001 | 01 02 03 04 |
| 2000 | 01 02 03 04 |
| 1999 | 04 |
