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维生素A缺乏对大鼠胚胎生长发育的影响
本文观察了维生素A缺乏对大鼠胚胎生长发育的影响.结果显示:维生素A缺乏使胎鼠的体重,身长,尾长明显小于对照组,囟门明显大于对照组,且维生素A缺乏组第2、5、6胸骨残缺以及前爪骨化不完全者明显较多.脑淤血、脑水肿以及肾盂积水者也明显较多.维生素A缺乏严重地影响了大鼠胚胎的正常生长发育.
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孕前/孕期砷暴露致胎鼠先天性心脏异常的研究
目的 探讨孕前/孕期砷暴露对大鼠胚胎心脏发育的影响.方法 30～40日龄雌性SD大鼠32只,按体重随机分为对照组和低、中、高剂量组,每组8只,分别自由饮用含亚砷酸钠(NaAsO2)浓度为0、37.5、75和150 mg/L的蒸馏水6周,与成年雄性SD大鼠合笼后受孕雌鼠继续饮用原浓度NaAsO2水溶液2周,孕16 d剖腹取胎.观察雌鼠体重变化,流产、吸收胎数及胚胎生长发育情况;通过连续性切片、苏木素-伊红(HE)染色法光镜下观察胎鼠心脏形态结构;采用原子荧光光谱法检测雌鼠毛发砷含量.结果 亚慢性砷暴露致雌鼠体重增长缓慢.中、高剂量组各有2只孕鼠流产.与对照组比较,染毒组胚胎重量、胎盘重量降低,吸收胎发生率升高(P＜0.05).低、中、高剂量组可见胎鼠心脏畸形,包括室间隔缺损、房间隔缺损和法洛三联征.各组心脏畸形发生率随饮水砷浓度升高而升高,中、高剂量组与对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.05).各组雌鼠毛发砷含量随饮水砷浓度升高而升高(P＜0.01).结论 孕前/孕期砷暴露可致胎鼠心脏发育异常,增加先天性心脏病发病风险.
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β-NGF和p75NTR在鼠胚触须隆突区的表达
目的 研究胚胎大鼠触须毛囊隆突区β-神经生长因子(β-NGF)、p75神经营养因子受体(p75NTR)与毛囊干细胞特异标志物的表达规律.方法 冰冻超薄切片,免疫组织化学方法.结果 胚胎大鼠的触须隆突区表达的β-NGF和p75NTn呈规律性变化.3种毛囊干细胞(HFSC)标志物的表达有差异,毛囊发生初期毛囊干细胞(HFSC)不仅仅定位于触须毛囊上段,整个毛囊下部3/4都有表达.结论 β-NGF和p75NTR的表达变化可能与毛囊干细胞以及毛囊的生物学特性有关.
关键词： 大鼠胚胎 触须隆突区 β-神经生长因子 p75神经营养因子受体 -
同型半胱氨酸对大鼠胚胎发育的毒性作用
目的研究同型半胱氨酸(homocysteine,HCY)和同型半胱氨酸诱导基因(homocysteine-induced gene,HCY-2)与心脏畸形的关系. 方法大鼠妊娠8、9、10 3d尾静脉注射同型半胱氨酸,分别于第13、15、 17、19d 取材,用组织学和免疫组织化学ABC法观察心脏畸形和基因Hcy-2在心脏上的表达并进行图像定量分析. 结果HCY对大鼠胚胎心脏有明显致畸作用,主要为心脏偏位,心脏过小;室间隔缺损,心房缺失等;ABC法显示基因Hcy-2在给药组胚胎心脏中表达增强. 结论 HCY对心脏发育是一种新的毒性因子;Hcy-2基因的过度表达与心脏畸形发生可能有一定关系.
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胶质细胞源性神经营养因子对培养的背根神经节的影响
目的探讨胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)在体外促进正常胚胎大鼠背根神经节(DRGn)的存活及突起生长情况. 方法用原代分离培养法建立体外胚胎大鼠背根神经节单细胞培养体系,通过活体观察、MTT微量比色法、NSE免疫组织化学染色观察不同浓度GDNF对体外培养的正常感觉神经元的影响. 结果 GDNF组培养的DRG神经元存活数量增加,神经元突起的长度比对照组明显增长. 结论 GDNF能明显促进体外培养的正常大鼠胚胎背根神经节感觉神经元的存活及突起生长,表明GDNF对正常大鼠胚胎发育期感觉神经元具有神经营养作用.
关键词： 胶质细胞源性神经营养因子 背根神经节 细胞培养 大鼠胚胎 -
苗勒管抑制物质
当男性胚胎的一对中肾管通过雄激素作用分化为输精管和附睾等时，另一对生殖管，苗勒管却逐渐退化。原因为睾丸Sertoli细胞分泌一种称为MIS(mullerian inhibiting substance)的物质。近年来有人已对MIS进行提纯、克隆、基因定位，并发现MIS除抑制苗勒管分化外尚有其他一些作用［1，2］，现就MIS 的分子生物学、作用和临床应用综述如下。 MIS的分子生物学 一、MIS的发现 初有人发现在牛的雌雄同体胚胎中雌胎缺乏苗勒管衍生物，原因为雌雄胎儿共用一个胎盘以致雌胎受到来自雄胎血运物质的影响，称为生殖不全牝犊现象(freemartin phenomenon) 。50年前Jost发现胚胎睾丸能分泌一种不同于睾酮并能使苗勒管退化的物质［1］。 1969年 Picon报告尚未出现性分化的大鼠胚胎苗勒管对不同物种的MIS均起反应［2］。以此为基础，研究人员首先对牛的MIS蛋白进行提纯。
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大鼠胚胎性腺异体异位埋植的研究
为探讨胚胎性腺(睾丸与卵巢)异体异位埋植后的生长发育和内分泌功能,将大鼠胚胎睾丸和卵巢分别移入摘除性腺的成年雄性和雌性大鼠颈部皮下和肾被膜下.埋植后分不同时间取出埋植物,常规染色观察埋植物在异体异位的生长发育.细胞化学和免疫组织化学法观察埋植物的功能状态.放射免疫法测定血清性激素浓度 . 结果显示埋植的胚胎性腺在异体可生长发育至成年状,3-β羟甾脱氢酶、性激素与性激素受体在睾丸与卵巢的内分泌细胞中呈阳性反应,血清促性腺激素和性激素在埋植后均有明显增加.由此证明胚胎性腺埋植到异体成年大鼠体内后可正常发育并具内分泌功能.
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休眠脑细胞的激活及重组重建神经系统功能的实验研究
本研究课题分为以下两个子课题:《大鼠胚胎神经干细胞定位及干细胞克隆的实验研究》和《胚胎大鼠神经干细胞体外黑质细胞定向诱导的实验研究》.
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鼠胚神经干细胞体外培养方法的优化
目的:神经干细胞能够分化为神经元和神经胶质细胞,但其纯化、培养技术尚不完善.通过不同接种密度和传代方法,筛选优化神经干细胞的体外培养技术.方法:实验于2006-05/12在四川大学移植免疫实验室完成.①动物:选取清洁级孕12～16 d雌鼠,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.②实验方法:取孕鼠胚胎脑皮质,胰蛋白酶+乙二胺四乙酸消化组织,分离神经干细胞,加入含B27、碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子的DMEM/F12培养基,传至第3代时,调整细胞密度至1×107 L-1,1×108 L-1,1×109 L-1,1×1010 L-1进行培养.另取原代培养7～10 d后的神经干细胞,收集形成的细胞球,机械吹打法传代是离心后用由粗到细的吸管轻柔吹打,或用带5号针头的无菌注射器吹打分离细胞,操作中避免产生气泡,使用注射器时吹打的次数保持5次.胰酶消化联合机械吹打法传代是离心后加入胰蛋白酶,37 ℃水浴10 min,用由粗到细且经火焰抛光的吸管轻柔吹打,或用带5号针头的无菌注射器吹打,以胎牛血清终止消化.③实验评估:观察第3代神经干细胞生长状态,MTT法检测各密度下培养1,3,5,7 d时的增殖情况.计数两种传代方法亚代神经干细胞形成的克隆球数目,比较增殖效果.免疫荧光染色检测神经球巢蛋白、BrdU标记、神经元特异性烯醇化酶、胶质细胞原纤维酸性蛋白的表达.结果:①神经干细胞的培养和鉴定:从胚胎大鼠脑皮质分离培养出的细胞可聚集成球状,并在体外大量扩增和长期存活,巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶、胶质细胞原纤维酸性蛋白均呈阳性表达,免疫荧光染色可见大量BrdU标记的阳性细胞.②不同接种密度对神经干细胞增殖的影响:按1×109 L-1密度培养的细胞分裂增殖为迅速,于第7天达高峰,且克隆球生成数量明显多于1×107 L-1,1×108 L-1,1×1010 L-1密度(P均＜0.05).③不同传代方法对亚代神经干细胞克隆增殖效果的影响:采用机械吹打法传代的神经干细胞所增殖形成的细胞球结合紧密,抛光玻璃管+注射器吹打后细胞球能较好地分开,但不能完全分散成单细胞,传代后细胞能够继续生长,并形成亚代神经干细胞球.经胰酶消化的神经球在机械吹打后也不能完全形成单细胞,且其亚代克隆的形成能力明显低于机械吹打法(P＜0.05).结论:①从胚胎大鼠脑皮质分离培养出的细胞具有神经干细胞特性,可诱导分化为神经元和星形胶质细胞.②1×109 L-1为佳细胞接种密度,机械吹打法亚代克隆的活性和增殖能力明显优于胰酶消化联合机械吹打法.
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抗氧化作用在锌干预大鼠胚胎心脏畸形发生中的意义
目的:探讨锌干预同型半胱氨酸(Homocysteine,HCY)诱发大鼠胚胎心脏发育畸形中抗氧化应激的意义.方法:SD成年健康清洁级雌雄大鼠各40只,常规方法交配获取孕鼠后,随机分为5个组:①空白对照组,②HCY组,③补锌组,④叶酸组,⑤联合组.各组孕鼠分别于妊娠第13、15、17、19天剖腹取出胚胎,通过切片进行胎鼠心脏组织学畸形观察.取胚胎时抽取孕鼠静脉血检测血清CuZn-SOD活力值及RT-PCR法半定量测定孕鼠外周血淋巴细胞金属硫蛋白-1型基因mRNA表达.结果:HCY组与空白对照组相比,吸收胎死胎率、心脏畸形率及不良胚胎率均明显增高(X2=15.70、35.37、56.53,P<0.001);主要畸形表现为发育延迟、心房缺如、室间隔缺损、心室缺损及大体畸形等,补锌组与HCY组比较,吸收胎死胎率、心脏畸形率及不良胚胎率均明显减少(X2=4.45、15.81、22.85,P<0.05、0.001、0.001);干预组间两两比较各率无明显改变(各组P>0.05);HCY组孕鼠血清CuZn-SOD活力值较对照组明显下降(t=8.28,P<0.005)、外周血淋巴细胞MT-1 mRNA表达较对照组明显下降(P<0.001);补锌组与HCY组比较CuZn-SOD活力值则明显增加(t=5.54,P<0.01)、MT-1基因表达亦明显增加(P<0.001).结论:补锌组孕鼠CuZn-SOD活力值及MT-1 mRNA表达明显增加,不良胚胎率和胚胎心脏畸形率明显下降,表明锌元素能拮抗HCY对大鼠胚胎心脏的致畸作用,其机制与孕鼠抗氧化应激能力增强有关.
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胚胎神经干细胞分化为神经丝蛋白阳性神经元的实验
神经干细胞(neural stem cell,NSC)可以为神经退行性疾病提供取之不尽、用之不竭的细胞供体[1],在不同的环境条件下可以分化为神经元及神经胶质细胞并表达不同的标志蛋白.神经丝蛋白(neurofilament protein,NFP)特异性地分布于神经元胞体及突起中,是轴突成熟的标志之一[2].但是,WFP蛋白在胚胎神经干细胞分化过程中的表达还不清楚.本实验从孕(E11)天大鼠胚胎分离神经干细胞,在体外培养中检测其NFP的表达,以观察胚胎神经于细胞分化为NFP-阳性神经元的状况.
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神经生长因子对周围神经运动纤维再生的影响
神经生长因子(nerve growth factor,NGF)是一种对交感和感觉神经元生长、发育、分化、存活和功能特性的表达,具有重要调剂作用的神经营养因子.它在神经再生的基础及临床研究中有重要的理论意义和实用价值.虽然,近年来已有研究提示大鼠胚胎脊髓运动神经元有NGF受体的mRNA表达[1],成熟的躯体运动神经元亦具有NGF受体的表达潜能.但迄今为止,尚乏直接依据证实躯体运动神经元对NGF具有应答能力.究竟NGF对周围神经的运动纤维的再生是否有促进作用?为此,我们对这一课题进行了尝试性的探索.
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Junctophilin 1 在小鼠胚胎干细胞定向分化心肌细胞及大鼠胚胎心肌发生中的表征
目的:评价膜连接蛋白Junctophilin 1 (JP1)亚型在哺乳动物心肌发生过程中,基因转录和蛋白表达特征,为心肌发育生物学及心脏再生医学相关生命现象本质提供实验依据.方法:小鼠胚胎于( embryonic stem,ES)细胞相继制成单细胞悬液和悬滴,收集拟胚体转至培养皿中悬浮分化培养.每隔2d收集细胞供分子生物学评价,并于心肌分化成熟期(第17天),免疫荧光成像原位检测JP1与心肌小节蛋白α-Actinin和Troponin-T是否呈共表达,流式细胞术定量确认JP1阳染率.另以大鼠胎心为研究对象,大鼠受精后第14天起,每隔2d取胎心直至分娩新生鼠,供RT-PCR和免疫印迹实验用.结果:ES细胞分化过程中,JP1在基因转录层面全程表达,至第11天达高峰.蛋白层面呈一过性表达,在第9天达高峰,此后迅速下降,至分化培养第15天消失,分化成熟期未见表达.大鼠胎心表达趋势与ES细胞分化过程基本一致,但JP1蛋白表达持续在出生后.在分化终端,流式细胞术显示JP2和肌小节蛋白双染率达16.59％,而未见JP1阳染细胞.结论:JP1基因在小鼠ES细胞定向分化心肌细胞全程均有转录,但JP1仅在分化早期有一过性表达.大鼠胎心JP1表达趋势与ES细胞分化过程基本相一致.
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大鼠胚胎胸腺细胞体外培养后存活率及表面抗原的变化
应用同种胸腺移植治疗免疫缺陷和恶性肿瘤,疗效已经得到肯定.但对于胚胎胸腺取出后,经体外培养,细胞的存活情况及是否需经处理以降低其抗原性,尚无统一认识,本实验对其进行了研究,现报道如下.
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比较不同胚胎时期神经干细胞的增殖、分化和凋亡
在中枢神经系统(CNS)发育过程中,神经干细胞(NSCs)通过对称分裂得到两个相同的具有增殖能力的子干细胞,而一小部分通过不对称分裂得到一个子干细胞和一个定向分化细胞[1,2],先后产生神经元细胞、星形胶质细胞和少枝胶质细胞[3].我们对大鼠胚胎脑皮质发育过程中3个非常重要时期(E14、E18和E20)的NSCs的增殖、分化和凋亡进行比较.
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E2F-1在胃癌组织中的突变、表达及其意义
随着研究的深入,E2F-1成为肿瘤基因研究领域中极具争议的一个基因.一方面,E2F-1在某些特定条件下发挥癌基因的作用,例如:E2F-1过度表达可以诱导大鼠胚胎成纤维母细胞转变成肿瘤细胞[1];另一方面,E2F-1基因缺失小鼠的肿瘤发生率明显增加,如生殖道肉瘤、肺腺瘤和淋巴瘤等,提示E2F-1具有抑癌基因的作用[2].本实验旨在观察E2F-1在胃癌中的基因突变、表达情况以及E2F-1过表达对MKN-45胃腺癌细胞株的影响,探讨E2F-1在胃癌发生发展中的可能作用.
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Wnt1、MyoD在正常及先天性肛门直肠畸形大鼠胚胎盆底肌发育中表达的对比研究
肛门直肠畸形术后排便功能障碍与盆底横纹肌的异常发育密切相关,然而ARMs盆底肌发育异常的机制目前仍不清楚.分子生物学的研究进展已对骨骼肌的发育机制进行了初步阐述,生肌调节因子被认为在肌肉发育过程中起到关键的作用;目前认为Wnt、Shh、Bmp等对于生肌调节因子(myogenic regulatory factors,MRFs)都有影响,其中Wnt信号通路是激活MRFs的重要因素;Wnt经典信号通路和非经典信号通路(激酶依赖通路)都对MRFs的激活起着重要作用;也有研究表明,Wnt信号可能通过参与染色质构象的改变而影响MRFs的活性.Wnt信号对于生肌调节因子的调节作用,已从初的单一的线性调节通路发展到目前的网络样调节通路,从而通过多种调节途径对胚胎期的肌发育过程产生重要影响.本研究通过研究Wnt信号通路中的重要因子Wnt1以及生肌凋节因子MyoD在正常及肛门直肠畸形大鼠E13～E21胚胎盆底肌的表达情况来探讨肛门直肠畸形大鼠胚胎盆底肌发育异常的机制.
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高纯度大鼠胚胎背根神经节神经元的培养与鉴定
目的:建立一种取材容易、存活时间长、纯度高的原代大鼠胚胎背根神经节神经元(DRGn)的培养模型.方法:在解剖显微镜下取得胎鼠背根神经节(DRG),通过胰蛋白酶消化,使用Neurobasal (NB)培养基联合抗有丝分裂药物纯化等方法获得DRGn.采用神经丝蛋白免疫细胞化学染色法和hoechst染核鉴定并测定DRGn的纯度.结果:原代培养的DRGn在含有神经生长因子(NGF)的NB培养基中生长良好,存活时间可达45 d,纯度可达到95％以上.结论:该培养模型简单易行,培养稳定,可获得大量高纯度和存活时间长的DRGn.
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大鼠胚胎卵巢移植的实验研究
目的探讨大鼠胚胎卵巢异体异位移植后的生长发育及功能.方法将大鼠胚胎的卵巢移植入去势成年雌性大鼠的肾被膜下,移植40 d后取材进行组织学研究,观察移植效果;同时测定血清雌、孕激素等水平.结果移植后第40天, 组织学观察,移植物内可见大量发育卵泡及黄体与间质腺, 移植卵巢中有丰富的血管.血清雌、孕激素与正常成年大鼠间无显著性差异(P>0.05) .结论大鼠胚胎卵巢移植后能继续生长发育并具有内分泌功能.
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大鼠胚胎背部皮肤基底层β-NGF和p75NTR的表达规律
目的 探讨大鼠胚胎背部皮肤β-NGF和p75NTR的表达规律.方法 使用冰冻超薄切片结合免疫组织化学染色方法和显色半定量统计方法.结果 大鼠胚胎背部皮肤呈现逐渐增厚的趋势,其中毛囊隆突区并不明显,但可明显观察到基底层细胞的表达变化.结论 形态学观察说明毛囊发生初期毛囊干细胞(hair follicle stem cell,HFSC)不仅仅定位于毛囊上段,β-NGF和p75NTR的表达有差异.背部皮肤基底层细胞具有干细胞特性,未分化为表皮细胞或者毛囊中的各种细胞.β-NGF和p75NTR的表达变化可能与毛囊干细胞以及毛囊的生物学特性有关.
