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结核杆菌检测基因芯片的制备研究
目的:建立结核杆菌检测基因芯片的制备技术.方法: 靶基因的制备、标记,用点样仪点于玻片介质上,并经过点样后处理制成基因芯片,用扫描仪测定处理前后芯片上荧光强度的变化,计算DNA固定率,分别设计了不同的玻片,不同的点液,不同的点样后处理方法的固定率的测定.结果:对结核杆菌检测基因芯片制备的条件和方法优化实验表明,用醛基修饰玻片作为介质,点样液用DMSO溶液作为点样液,点样后芯片处理,以水合1 h再干燥30 min为佳.结论:本研究建立的结核杆菌检测基因芯片的制备技术有较高的效率和可靠的实用性能.
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IL-17对人表皮细胞增殖过程中DNA含量的影响
目的:探讨IL-17对人表皮细胞增殖过程中DNA含量的影响.方法:将正常人皮肤移植于裸鼠,建立人皮肤-裸鼠嵌合模型60只;按配对设计要求随机分成实验组30只和对照组30只,实验组使用IL-17 0.1 mL (10 ng/mL) 注射于裸鼠移植皮肤内,对照组使用0.9%氯化钠0.1 mL注射于裸鼠移植皮肤内,每日1次,均连续使用28天后,以激光扫描共聚焦显微镜测试移植皮肤组织的人表皮细胞DNA荧光强度值.结果:与对照组相比,注射IL-17组人表皮细胞DNA荧光强度值明显增加,差异具有统计学意义(t=3.08,P<0.05).结论:IL-17可促进人表皮细胞增殖过程中DNA含量升高.
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蛋白质芯片制作条件的优化
目的探讨以醛基化玻片为固相载体制备蛋白质芯片的条件.方法蛋白质用含40%甘油的PBS稀释后点加在醛基化玻片上,室温干燥1h,4℃冰箱保存,经封闭剂封闭,PBS漂洗后,依次加入抗体,反应结果用扫描仪进行扫读.结果以醛基化玻片为固相载体时预点10～15个点后点样均一性较好;点样后4℃冰箱保存24～48h再进行漂洗和封闭处理,所得结果的荧光测量值较高;3%BSA为封闭剂时所得图像的荧光背景值低;点样量影响荧光信号的强度.结论以醛基化玻片为固相载体制备蛋白质芯片时要预点15～20个点后再正式点样,点样后应4℃保存24～48h再进行漂洗和3%BSA封闭处理.
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IL-10对人表皮细胞增殖分化过程中DNA含量影响的实验研究
目的 探讨IL-10对人表皮细胞增殖分化过程中DNA含量的影响.方法 将正常人皮肤移植于裸鼠,建立人皮肤-裸鼠嵌合模型60只;按配对设计要求随机分成实验组和对照组各30只,实验组使用IL-10 0.1 ml (10 ng/ml)注射于裸鼠移植皮肤内,对照组使用0.9％氯化钠0.1ml注射于裸鼠移植皮肤内,均每天1次、连续使用28天,后以激光扫描共聚焦显微镜测试移植皮肤人表皮细胞DNA荧光强度值.结果 IL-10可使人表皮细胞DNA荧光强度值显著降低[实验组(353 928.93±11 672.33) vs.对照组(369 649.30±8576.48),t=5.97,P＜0.05].结论 IL-10能减少人表皮细胞增殖分化过程中DNA含量.
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平均白细胞前向散射强度在尿路感染中意义的探讨
UF-100尿沉渣分析仪定量分析尿液中的白细胞对诊断尿路感染有着很高的临床价值[1].UF-100利用前向散射光强度(Fsc)、前向散射光脉冲宽度(Fscw)、荧光强度(Flc)、荧光脉冲宽度(Flw)等参数来描述尿中白细胞.凭借白细胞在散点图上分布的区域,可为急慢性尿路感染的初步诊断提供帮助.本研究对急慢性尿路感染患者尿液进行分析,以了解平均白细胞前向散射强度(WBC-MFsc)与急慢性尿路感染的关系.
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基于量子点标记技术在人血清甲胎蛋白中的意义
目的：建立1种基于新型纳米颗粒———量子点（QD）作为荧光标志物检测人血清甲胎蛋白的新方法。方法生物素标记的甲胎蛋白单克隆抗体与血清中的甲胎蛋白抗原特异性结合形成抗原抗体复合物，耦联生物素的 QD-605和 QD-655作为荧光标志物与抗原抗体复合物结合，借助磁场的清洗分离效应，去除反应体系中的非特异性物质，利用荧光分光光度计检测 QD 标记的甲胎蛋白抗原抗体复合物的荧光强度及光谱。结果用350 nm 波长的光作为激发光，量子点 QD-605单独作为标志物时，荧光发射谱在605 nm 处有1个波峰；QD-655单独作为标志物时，荧光发射谱在655 nm 处有1个波峰；QD-605和 QD-655混合作为标志物时，荧光发射谱出现2个波峰，分别在605和655 nm 处。结论本选题利用 QD 标记技术检测血清中的甲胎蛋白，有望为临床免疫诊断学提供1种更快捷、有效的方法。
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贫血患者网织红细胞及其荧光强度检测的临床意义
目的 探讨流式细胞术加核酸荧光染色技术在网织红细胞(Ret)及其荧光强度分析中的临床应用价值.方法 用Sysmex XT-2000i全自动血液分析仪分析不同类型贫血患者的网织红细胞(Ret)和荧光强度的变化.结果 285例贫血患者与102例正常人群比较,其Ret绝对值及其Ret百分比有不同程度的升高、轻度降低或显著降低;荧光强度的变化差异较大,表现为低荧光强度网织红细胞比率(LFR)降低,幼稚网织红细胞比率(IRF)、中荧光强度网织红细胞比率(MFR)和高荧光强度网织红细胞比率(HFR)升高,差异均有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01).结论 全自动血液分析仪对网织红细胞的自动化分析测量细胞多,避免了主观因素导致的误差,操作简便、快速、灵敏、重复性好、误差小、结果准确,方法易于标准化.网织红细胞及其荧光强度分析可作为某些贫血鉴别诊断的初筛指标及骨髓造血系统抑制和恢复较敏感的指标,对判断和监测骨髓的损伤程度和预后具有重要的临床意义.
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新生大鼠心肌细胞内Ca2+的空间分布及调控的离体研究
游离钙是细胞内为关键的第二信使,参与细胞内许多重要生命过程的调节.因此胞浆和核钙稳态的精密调节,将对细胞功能的维持具有至关重要的意义.真核细胞核是细胞遗传信息和生命活动的控制中心,由于心肌细胞内的游离钙随心脏的收缩周期呈大幅度的周期性变化,细胞核上是否存在核Ca2+调节系统,从而保证在心肌胞浆Ca2+大幅度周期变化时核功能的精密调节,已成为国内外学者争论的热点.本研究在培养的新生大鼠心肌细胞上,以Fluo-4/AM荧光指示剂负载心肌细胞,应用激光共聚焦扫描显微镜,观察多种工具药对胞浆和核Ca2+的空间分布和钙信号的变化形式的影响,以初步揭示心肌细胞核上是否存在相对独立的钙调节系统.结果显示,心肌细胞核的荧光强度明显高于细胞浆,并存在小幅度的钙震荡,AngⅡ使胞浆及其核内的钙震荡幅度均增大,其作用可被NO所完全抑制.Ca2+-ATPase抑制剂thapsigargin(10-6mol/L)、钙释放通道ryanodine受体2激动剂咖啡因(5mmol/L)和大剂量L-型Ca2+通道阻滞剂verapamil(500μmol/L),不仅使心肌细胞胞浆内出现钙闪烁现象,核膜上也出现钙闪烁团.EGTA首先螯合心肌细胞胞内的游离Ca2+,继之螯合胞浆钙库Ca2+,后仅显示心肌细胞核膜腔Ca2+库影.L-型Ca2+通道阻滞剂verapamil引起心肌细胞自发的钙波传递消失,核和胞浆内荧光强度一过性升高后下降,且核钙升高的幅度明显高于胞浆.由此说明心肌细胞胞浆和核内均存在钙震荡、钙闪烁、钙波以及瞬时性钙增高等多种钙信号形式.核Ca2+与胞浆Ca2+之间存在一定的屏障,核与胞浆Ca2+变化不完全同步.心肌细胞受到外来因素刺激后,也启动核内钙调节系统形成核Ca2+震荡等钙信号.心肌细胞核也可能作为胞内钙库起作用,并具有相对独立的钙转运系统,胞浆和核Ca2+库对Ca2+的摄取和释放在细胞功能的调节中可能起重要作用.不同亚细胞定位的Ca2+信号可能通过频率和幅度的差异来编码外来信息,进而影响细胞的各种功能.
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心肌细胞核钙信号的研究
采用激光扫描共聚焦显微镜、荧光分光光度计和荧光显微镜,观察培养的大鼠心肌细胞和离体细胞核的Ca2+信号变化.结果:培养的心肌细胞内Ca2+荧光分布不均匀,即核的荧光强度显著高于胞浆;β-受体激动剂异丙肾上腺素(10-6mol/L)使核钙浓度[(Ca2+)n]增加程度显著大于胞浆钙浓度[(Ca2+)c],β-受体阻滞剂心得安(10-3mol/L)浓度显著降低细胞核/胞浆游离钙梯度;P物质(10-6mol/L)作用下,[(Ca2+)n]增加2.17倍,而[(Ca2+)c]仅增加91.45%(P<0.05),[(Ca2+)n]/[(Ca2+)c]大幅度上升.心肌细胞经钙泵抑制剂thapsigargin和EGTA刺激后,可见核膜腔存在钙库.正常心肌细胞存在小幅度的钙震荡,分别加入去甲肾上腺素(10-5mol/L)、AngⅡ(10-6mol/L)和ATP(3×10-3mol/L),均使心肌细胞胞浆Ca2+和核Ca2+震荡幅度明显升高(P<0.01),NO-供体硝普钠(10-5mol/L)和KCI(20mmol/L)使钙的周期性震荡消失.IP3和Ryanodine分别使核Ca2+短暂升高1.68倍和1.93倍(P<0.001),而Thapsigargin预处理心肌细胞核,均能显著的阻断IP3和Ryanodine的致核Ca2+升高作用(P<0.05),荧光染色观察可见IP3受体染色主要位于核内膜,而钙泵和ryanodine受体染色主要位于核外膜.结论:心肌细胞核是细胞内的钙库之一,心肌细胞核也存在Ca2+震荡,并受多种因素影响.心肌细胞核膜上存在Ca2+-ATPase、RyR和IP3受体等核Ca2+摄取和释放系统.核Ca2+释放的前提条件是首先存在核Ca2+摄取.
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普通墨汁对中、小血管行荧光染色
自发荧光的生物物质或经荧光染料标记的物质可在荧光显微镜下发荧光.但市售普通墨汁对组织结构可行荧光染色,经查未见报告.我们给小鼠、大鼠、幼兔注射普通墨汁,分别取肺、肾、肝、肠系膜,均可见其中、小血管显现很强的黑色荧光,其他组织无荧光.碘化钾对血管荧光有很强的猝灭作用.现报道如下:1 材料与方法1.1 材料 (1)A液即市售普通墨汁原液.(2)B液取墨汁100ml,明胶3g,隔水加温,使明胶溶解于墨汁中即成.(3)C液蒸馏水100ml,明胶3g,加温溶解.1.2 动物实验动物分三组,每组小鼠、大鼠、幼兔各一只.1.3 方法小鼠、大鼠均断颈处死,幼兔耳静脉空气注射处死.迅速开胸,从心脏作全身注射.第一组注入A液,第二组注入B液,第三组注入C液.20min后取材,所有动物分别取肺、肾、肝、肠系膜,10%福尔马林固定24hr.肺、肾、肝行常规石蜡切片, 片厚15μm.肠系膜行铺片.常规二甲苯脱蜡封片.另取A组肾切片分别浸0.01%、 1%碘化钾5sec、5min,烘干后封片.荧光显微镜(激发滤片BG12,阻断滤片 535)及普通光镜观察.2 结果与分析2.1 在普通光镜下,墨汁组和墨汁明胶组的各器官组织中、小血管均清晰可见,但以墨汁明胶组效果略好.而明胶组则看不到血管(肠系膜上较粗血管肉眼可见除外).2.2 荧光显微镜观察,墨汁组各器官中、小血管呈现很强的黑色荧光,墨汁明胶组强度较弱,单纯明胶组根本不可见.2.3 碘化钾对血管荧光有很强猝灭作用,当切片经过不同浓度的碘化钾后其血管均不显荧光,其他组织亦无荧光.2.4 普通墨汁有市售,经济易得,荧光强度大,保持时间长.我们有保存十多年的切片, 其荧光强度几乎未减.利用其行荧光染色,有一定实用价值.
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利用激光共聚焦显微镜研究MP多肽抑制粒细胞呼吸爆发造成的脂质过氧化作用
目的:研究MP多肽抑制呼吸爆发的作用机制.方法:培养人白细胞系THP1细胞,对照组细胞培养体系中仅给予内毒素(LPS,100ng/ml)刺激,治疗组在同样浓度的LPS刺激同时加入MP多肽(20μM),采用乙酰乙酸盐2,7二氯氢化荧光素(D399)和碘化丙啶(PI)双标记,用D399及PI对两组细胞进行染色,激光共聚焦显微镜检测两组细胞D399在细胞内的脂质过氧化产物2,7二氯荧光素及PI的荧光强度.
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光学法检测血小板体外保存期间跨膜电位的变化
目的 建立使用流式细胞仪检测血小板跨膜电位的方法,观察血小板在体外保存期间跨膜电位变化.方法 使用电压敏感染料DiBAC4(3)对20(人)份血小板(20 mL/份)染色后,用流式细胞仪测定血小板在静息状态下和完全去极化时的荧光强度,根据能斯特方程计算血小板跨膜电位,并利用此方法观察血小板在体外保存期间跨膜电位的变化情况.结果 20人份新鲜血小板跨膜电位平均值为(-56±4)mV,CV=5.5％,与膜电位钳法得到的结果(-50-60)mV相似,保存1、3、5d的血小板跨膜电位分别为(-56±4)、(-54±8)和(-46±6)mV,其中血小板跨膜电位在血小板保存1d时明显高于5 d(P ＜0.05).结论 所建立起的方法用于测定血小板跨膜电位准确、可靠.
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一种测定淋球菌对环丙沙星吸收和积累量的新方法--实时监测荧光强度变化法
目的探讨测定淋球菌对环丙沙星吸收和积累量的新方法.方法将淋球菌与含有 2mg/L 环丙沙星的培养液混合培养,随后监测上清液荧光强度随时间的变化情况 ,推算出细菌对环丙沙星的吸收和积累量.结果用该方法测定了敏感组和耐药组对环丙沙星的积累量,分别为 94.2和 39.4ng;还测定了淋球菌在不同时间点对环丙沙星的吸收量,并显示淋球菌吸收环丙沙星的关键在于起初 5min,细菌吸收环丙沙星有一定极限,敏感菌和耐药菌的吸收极限分别介于 70～ 110和 20～ 55ng间.结论在一定线性范围内,实时监测荧光强度变化法可以测定淋球菌对环丙沙星的吸收和积累情况,并且具有简便、直观、快速、重复性好等特点.
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UF-100流式尿沉渣全自动分析仪常见故障分析和排除
UF-100流式沉渣全自动分析仪系日本希森美康(Sysmex)公司产品,为当今世界上先进的全自动尿液沉渣分析仪,该仪器利用先进的流式细胞技术、电阻法、电导体、激光和荧光染色方法,检测尿液中各种有形成分(白细胞、红细胞、上皮细胞、酵母样细胞、细菌、各种管型、结晶、精子等)产生的不同散射光和荧光强度,经计算机多参数分析,得出图像和定量报告,有助于临床对病情的分析和尿液测定标准化,具有准确、快速、重复性好等优点.
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影响IFMA效果的常见问题与对策
IFMA是时间分辨免疫荧光分析测定法的简称,是继免疫吸附试验和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术.它以免疫学反应为基础,将抗原与抗体的特异性反应与金属铕标记抗体作用相结合,再加入增强液将复合物标记抗体上的Eu3+解离到溶液中,并与增强液中有效成分形成高荧光强度的螯合物,其荧光强度与溶液中的待测物质的浓度成正比.
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DNA芯片技术在疾病诊断中的应用
DNA芯片是由大规模集成电路所控制的机器人在尼龙膜或玻璃片等固相支持物表面，有规律地合成大量寡核苷酸探针，或预先合成由机器人点样于固相支持物表面，然后与标记的样品DNA或cDNA进行杂交，通过放射自显影或激光共聚焦显微镜扫描后，对杂交结果进行计算机软件处理分析，获得杂交信号的强度及分布模式图，以此反映样品靶分子的数量及基因表达强弱的信息。本文就DNA芯片技术在疾病诊断中应用作一综述。1 检测原理对于以核酸杂交为原理的检测技术，主要过程为：首先用生物素标记经扩增的序列或样品，然后再与芯片上的大量探针进行杂交，用链-霉亲和素偶联的荧光素或其它荧光显微装置，对片基扫描。近年，美国已开发了专一的DNA芯片检测系统(Scan Array 3000)，采用激光聚焦扫描原理进行荧光信号采集，由计算机处理荧光信号，并对每一点的荧光强度数字化后进行分析。由于完全正常的配对双链要比具有错配碱基的双链分子具有较高的热力学稳定性，因此，前者的荧光强度要比后者强出5%～35%，所以检测方法具有一定的特异性，而且荧光信号的强度还与样品中靶分子含量呈一定的线性关系。
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GFP共表达检测重组型Caspase-3对HeLa细胞凋亡的诱导作用
[贾林涛,于翠娟,许彦鸣,赵晶,高下,张淼丽,王成济,杨安钢. 细胞与分子免疫学杂志,2001;17(3):218-221]目的探讨由野生型人caspase-3大小亚基颠倒构建的重组型caspase-3的促细胞凋亡活性. 方法用RT-PCR法获得人caspase-3基因. 通过重组PCR进行改造,构建小亚基位于大亚基之前的两种重组型caspase-3基因,它们所对应的蛋白质的N端,分别带有或没有其自身识别的四肽序列. 将上述基因克隆入绿色荧光蛋白(GFP)表达载体pIRES2-EGFP中,转染人HeLa细胞,在荧光显微镜和电镜下观察转染细胞的形态和结构. 结果成功地获得了野生型caspase-3基因及两种重组型caspase-3基因. 构建了重组型caspase-3基因的表达载体. 转染HeLa细胞后,重组型caspase-3基因在细胞中得到表达,随后引起细胞荧光强度下降,生长状况变差甚至死亡. 电镜观察显示,许多细胞呈现凋亡的典型特征. 结论重组型caspase-3可促进HeLa细胞的调亡.(井晓梅)
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基于生物介质的丙三醇对分子荧光强度影响的研究
目的:生物介质中加入丙三醇是一种保存荧光样品的重要方法,研究丙三醇含量对生物介质中不同发射波长荧光分子的荧光强度的影响.方法:以磷酸盐缓冲液(PBS)作为介质,测定不同丙三醇体积分数下的拓扑替康、磺酰罗丹明B(SRB)、吖啶橙(AO)和罗丹明B的荧光强度以及丙三醇的荧光光谱和紫外-可见吸收光谱.结果:研究发现丙三醇本身无荧光,但其能够增强上述荧光分子的荧光强度.随着丙三醇体积分数的增大,荧光分子的荧光强度逐渐增强.结论:生物介质中加入丙三醇后能够增强分子的荧光强度.选择含高体积分数丙三醇的生物介质,有利于提高荧光分子检测的灵敏度.
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激光扫描共聚焦显微镜中荧光强度的测定条件研究
目的对应用激光扫描共聚焦显微镜进行荧光强度的测定条件做了详细的分析.方法选择和设置激光扫描共聚焦显微镜的各参数,对用间接免疫荧光法检测改性后的材料表面对人牙龈成纤维细胞分泌细胞外基质纤粘连蛋白FN和Ⅰ型胶原的影响进行荧光强度的定量.结果细胞在材料表面接种后FN的荧光染色强度在四组材料之间没有显著差异,说明材料表面化学成分的改变对FN的形成没有明显影响.但四组材料对Ⅰ型胶原分泌的影响有差异.结论选择和设置适合的激光扫描共聚焦显微镜中荧光强度的测定条件,可以真实有效的反映实验的结果.
关键词： 激光扫描共聚焦显微镜 荧光强度 -
激光共聚焦显微镜对样品检测中的温度变化及不同固定方法的研究
目的:研究环境温度的变化和样本固定的方法对于激光共聚焦显微镜检测样品的影响.方法:选取1个铃兰样片,对在冷冻保存和常温下的样片进行荧光强度检测.将样片保存于冰箱-20℃冷冻12 h,取出恢复至室温后利用激光共聚焦显微镜观测样片荧光强度变化;采集室温下铃兰样片图,观测样片荧光强度;样片观测时间间隔5 min,相同视野下采集图像,共采集30 min.依据处理方法的不同将其分为A组和B组,A组为甲醇处理组(3个皿);B组为甲醛处理组(3个皿),分别采用4％多聚甲醛缓冲液、预冷的甲醇两种固定剂,固定人正常肺上皮细胞,同时两组各再加渗透试剂TritonX-100处理细胞,用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)复染液对肺上皮细胞核染色;在相同显微镜的物镜和样品荧光激发强度及图像采集参数条件下,使用激光共聚焦显微镜观测、采集图像.结果:在冰箱-20℃冷冻保存的样片的荧光强度呈逐步上升趋势,室温下样片的荧光强度无明显改变.两组固定剂再加渗透试剂TritonX-100处理,细胞核染色效果更好.结论:环境温度的变化会影响样本荧光强度,普通固定剂固定细胞之后再加渗透试剂处理有利于细胞核染色.
