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SV40(Simain Virus 40)的分子生物学研究进展
SV40(Simain Virus 40)是猿猴的病毒,但与多种人类肿瘤关系密切,因此引起人们的重视.SV40基因组较小,广泛的用于载体构建和细胞转化的研究.对于SV40的分子生物学特性及其与人类肿瘤的关系还在进一步研究中,本文就此综述了国内外相关的研究进展.
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白木香AsJAZ1基因原核载体的构建与表达
克隆国产沉香基原植物白木香Aquilaria sinensis jasmonate-zim-domain protein(AsJAZ1)基因的编码区,构建原核表达载体及诱导重组蛋白的表达,为筛选互作蛋白因子和研究基因功能奠定基础.该实验以白木香叶片中分离的总RNA为模板,通过RT-PCR方法克隆到茉莉酸信号转导抑制蛋白基因JAZ(AsJAZ1)的编码区全长序列,克隆到原核表达载体pET-28a上,构建重组原核表达载体pET-28a-AsJAZ1,经酶切鉴定和测序验证后将其转入大肠杆菌BL21(DE3),在37℃经0.5 mmol.L-1异丙基硫代β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达4h后,可获得相对分子质量约为39 kDa的融合重组蛋白的高效表达.该重组蛋白在大肠杆菌的上清和沉淀中均有表达,但以包涵体表达为主.
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肠道病毒71型3C蛋白酶在大肠杆菌中的表达及活性研究
本研究利用大肠杆菌表达系统构建肠道病毒71型3C蛋白酶,并进行纯化,对其酶活性进行研究.首先,将3C蛋白酶基因克隆至pET28a载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,Ni-NTA柱亲和层析纯化获得3C蛋白酶,经肠激酶酶切去除N端His标签后获得无His标签的3C蛋白酶,再以荧光多肽为底物进行酶活性研究.经过双酶切鉴定和测序证实,重组表达质粒pET28a 3C构建正确,表达的重组3C蛋白酶相对分子质量约22kD；纯化后有无His标签的3C蛋白酶均能催化荧光底物3B-3C,并且两者的酶动力学数据无显著差异,含有His标签的3C蛋白酶Km、Vmax、Kcat分别为22μM、434nM.Min-1、0.0669 Min-1；其适反应pH为7.0,佳反应温度为30℃～37℃.本实验成功表达并纯化了重组3C蛋白酶,该酶具有良好的活力,为抗病毒抑制剂、结构蛋白组装、疫苗开发及3C蛋白酶检测方法的研发奠定了基础.
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CD49f剪接异构体在不同细胞系中的表达
目的 比较CD49f选择性剪接异构体在人不同来源干细胞以及结肠癌细胞系中的表达,并构建特定异构体过表达载体用于功能研究.方法 RT-PCR及real-time PCR检测CD49f选择性剪接异构体在不同细胞中的表达;分子克隆方法构建各异构体的慢病毒过表达载体;流式细胞计量术、Western blot及real-time PCR检测CD49f各异构体的过表达;Transwell方法检测细胞侵袭能力的改变.结果 人胚胎干细胞系H9中表达CD49f异构体B,而上皮类细胞仅表达异构体A;间质细胞中二者均有表达,但异构体A表达多于异构体B;检测的4个结肠癌细胞系中CD49f异构体A和B均有表达,其中HT29和HCT116中以异构体A为主,而HCT8和LoVo中异构体B的表达更为明显.构建的慢病毒表达载体可使HT29中CD49f异构体A和B获得特异性过表达,其中异构体B的过表达使HT29的侵袭能力增加.结论 不同类型细胞中CD49f选择性剪接异构体A和B的表达存在显著差异,二者的生物学功能具有差别.
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miR-30a表达载体构建、病毒包装和表达活性的检测
目的 构建携带miR-30a的慢病毒表达载体,为研究miR-30a在慢性粒细胞白血病中的作用机制及对伊马替尼耐药性的影响奠定基础.方法 提取人骨髓细胞基因组DNA,扩增miR-30a的前体序列,克隆到plVTHM慢病毒表达载体上,测序鉴定.重组载体进行病毒包装,感染K562细胞,测定病毒滴度.感染的K562细胞用流式细胞仪分选带有绿色荧光的GFP阳性的细胞,对分选的细胞用实时荧光定量PCR法检测miR-30a在细胞内的表达水平.后用CCK-8法检测各组细胞的增殖情况.结果 重组慢病毒表达载体测序完全正确;病毒滴度检测为6×106 TU/mL;选用160 μL病毒液/1 mL培养基感染K562细胞;感染的K562细胞中miR-30a的表达水平显著增强(P＜0.05);过表达miR-30a后K562细胞增殖水平显著下降(P＜0.05).结论 成功构建了miR-30a慢病毒表达载体,并可在K562细胞中稳定表达,且miR-30a有抑制K562细胞增殖的作用.
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Thy-1表达水平对肺腺癌细胞A549迁移性及部分相关基因表达的影响
目的 验证Thy-1(CD90)基因与肺癌细胞迁移潜能的关系,并探讨其作用机制. 方法 利用真核表达载体pcDNA3.0构建包含Thy-1基因全长序列的重组表达质粒载体,转染A549细胞,G418筛选获得稳定克隆,采用RT-PCR及免疫荧光技术检测重组质粒转染后细胞内Thy-1 mRNA及蛋白表达水平的改变;通过体外Transwell迁移实验研究外源性Thy-1对A549细胞迁移能力的影响. 结果 构建了pcDNA3.0-Thy-1真核细胞表达载体;成功建立了稳定表达外源性人Thy-1蛋白的肺癌A549细胞株.Trenswell实验提示,表达外源性Thy-1蛋白的A549细胞较对照组细胞体外迁移能力下降(P<0.0001);基因芯片结果提示,Thy-1基因在肺癌细胞中表达后,影响了25个细胞迁移相关基因的表达,在检测基因表达差异时,RT-PCR与基因芯片能够得到基本一致的结果. 结论 Thy-1基因的过表达能降低肺癌细胞系A549细胞的迁移能力,并改变A549细胞多个细胞迁移相关基因的表达,提示Thy-1在肺癌组织的表达状态可能影响肺癌的转移性.
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双酶切法构建CRISPR-Cas9载体系统的研究
目的 以pet41a质粒为载体骨架,通过酶切连接法构建crispr-cas9载体系统,建立一种简单有效的基因编辑载体,为研究细菌耐药基因的敲除提供方法. 方法 选择质粒pet41a、pwt-cas9和pgRNA,分析核酸序列,选择合适酶切位点.使用XhoⅠ和BgiⅡ两种限制性内切酶分别酶切pet41a和pwt-cas9,形成带有相同粘性末端的线性载体片段,回收并用T4 DNA连接酶连接,连接产物转化DH5α感受态细胞,转化菌涂布含卡那霉素的固体LB培养基平板进行阳性单克隆筛选并测序,构建的质粒命名为pet41-cas9.使用BgiⅡ和XbaⅠ两种限制性内切酶分别酶切pet41-cas9和pgRNA,经回收纯化、连接和转化后筛选阳性单克隆菌落并测序,重组质粒命名为pet41a-cas9-gRNA.分别将重组质粒pet41-cas9和pet41 a-cas9-gRNA转化BL-21(DE3),IPTG诱导后提取蛋白进行SDS-PAGE分析. 结果 测序证实质粒pet41-cas9、pet4 1a-cas9-gRNA连接正确,载体构建成功.重组质粒粒转染DE3后经IPTG诱导4h,表达相对分子质量为160×103的重组蛋白,与cas9蛋白理论分子质量相符. 结论 成功构建CRISPR-Cas9载体系统质粒pet41a-cas9-gRNA并表达重组cas9蛋白,为细菌基因的编辑研究奠定了实验基础.
关键词： 基因编辑技术 CRISPR-Cas9 载体构建 限制性内切酶 -
pEGFPN1-HBsAg-p30-ROP2真核表达载体的构建及其在293T细胞中的表达
目的 构建pEGFP-N1-HBsAg-p30-ROP2重组表达载体并进行293T细胞的转染表达. 方法 根据pcD-NA3-HBsAg-p30-ROP2重组质粒设计引物,进行PCR扩增,获得HBsAg-p30-ROP2融合基因并进行酶切,酶切片段与pEGFP-N1载体连接,构建pEGFP-N1-HBsAg-p30-ROP2真核表达载体,酶切和测序鉴定后转染293T细胞,采用荧光、Western blot和ELISA检测其蛋白表达效率;分别用P30单抗腹水、ROP2鼠源多抗、乙肝患者血清进行ELISA,检测融合蛋白的免疫反应性. 结果 PCR扩增HBsAg-p30-ROP2基因片段约2 600 bp,与理论值相符.构建的重组质粒pEGFP-N1-HBsAg-p30-ROP2经双酶切获到约4 700 bp和约2 600 bp的两条片段,与预期相符.对重组载体测序,HBsAg基因的252位C→A,345位T→C,ROP2基因的695位A→T,且3个碱基突变均为同义突变.免疫荧光法检测pEGFP-N1-HBsAg-p30-ROP2转染成功并正确表达,细胞蛋白浓度2.40 mg/ml.提取的融合蛋白能被弓形虫p30单抗腹水、ROP2鼠源多抗和乙肝患者血清识别. 结论 成功构建pEGFP-N1-HBsAg-p30-ROP2重组表达载体,并在293T细胞中过表达,表达蛋白具有免疫反应性,为乙肝和弓形虫联合疫苗的研制奠定了基础.
关键词： pEGFP-N1 载体构建 HBsAg-p30 ROP2 蛋白表达 -
幽门螺杆菌外膜蛋白Omp18表达载体构建及其多克隆抗体的制备
目的 制备幽门螺杆菌的外膜蛋白Omp18及其多克隆抗体.方法 设计Omp18基因引物,PCR扩增Omp18基因,将其连入pMD-18T载体,再克隆入原核表达载体pTriEx(TM)-4,重组质粒转化大肠埃希菌JM109DE,IPTG诱导表达Omp18蛋白,纯化后免疫家兔,以获得多克隆抗体.结果 PCR扩增的Omp18基因成功克隆入原核表达载体,重组原核表达载体转化菌表达Omp18蛋白,纯化的Omp18蛋白免疫动物后血清中获得多克隆抗体.结论 本实验成功进行了Omp18蛋白的原核细胞表达并制备了多克隆抗体,为研究Omp18的功能、表达调控以及幽门螺杆菌.检测和疫苗生产等奠定了基础.
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表达干扰素-α2b重组长双歧杆菌工程菌的制备
目的 构建表达人干扰素-α2b(hIFN-α2b)蛋白的双歧杆菌工程菌,并验证靶蛋白的表达水平. 方法 人工合成hIFN-α2b基因,插入双酶切的pBAD质粒,构建重组质粒pBAD-IFN.制备双歧杆菌感受态,用pBAD-IFN电转化后PCR鉴定、筛选阳性克隆,筛选的阳性双歧杆菌克隆在L-阿拉伯糖诱导下表达靶蛋白,并进行Western blot检测.结果测序和双酶切鉴定表明成功构建重组质粒pBAD-IFN,Western blot检测证明氨苄青霉素筛选出的该质粒转化双歧杆菌阳性克隆经L-阿拉伯糖诱导表达分子质量单位为18 ku的hIFN-α2b蛋白. 结论 hIFN-α2b表达载体pBAD-IFN转化双歧杆菌后可表达hIFN-α2b蛋白.
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携带CUEDC1基因的慢病毒载体的构建及其对MOLT-4细胞株增殖和集落形成能力的影响
目的:构建过表达人CUEDC1的慢病毒载体pCDH-CUEDC1,利用慢病毒介导的感染获得稳定表达重组质粒的MOLT-4细胞,分析过表达CUEDC1对MOLT-4细胞增殖和集落形成能力的影响.方法:利用RT-PCR的方法获得CUEDC1全长片段,将CUEDC1 DNA片段酶切回收后克隆至慢病毒转移质粒pCDH-CMV-MCS-EFl-copGFP-T2A-Puro(以下简称pCDH),获得pCDH-CUEDC1慢病毒重组质粒.经三质粒包装系统包装后获得高滴度慢病毒颗粒并感染人白血病细胞系MOLT-4,通过流式细胞仪分选获得稳定表达的白血病细胞系,应用real-time PCR和Western blot方法分别检测稳定转染细胞系的CUEDCl mRNA和CUEDC1的表达.应用CCK-8法和集落形成试验测定CUEDC1对MOLT-4细胞增殖和集落形成能力的影响.结果:经限制性内切酶检测及基因测序证实成功构建了携带CUEDC1的重组慢病毒载体;病毒感染MOLT-4细胞后经流式细胞仪分选获得GFP阳性细胞.实时定量PCR及Western blot证实,病毒感染后CUEDC1的mRNA和蛋白表达上调;CCK-8法及集落形成试验显示,过表达CUEDC1促进MOLT-4细胞的增殖和集落形成能力,与对照组相比,均有统计学差异(P＜0.05).结论:成功构建了表达CUEDC1的慢病毒载体,CUEDC1可以促进MOLT-4细胞的增殖和集落形成能力.
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靶向AATF基因shRNA表达载体的构建及其稳定表达的白血病U937细胞系的建立
本研究旨在构建靶向AATF基因的短发夹RNA(shRNA)真核表达载体,获得干扰质粒稳定转染的人白血病U937细胞系.根据GenBank数据库提供的AATF mRNA序列,以228～249、303 ～ 324、443 ～ 464位序列作为RNA干扰位点,排除同源可能,合成3对互补并编码mRNA基因的特异性shRNA序列的寡核苷酸,克隆至经BamHⅠ、HindⅢ双酶切线性化的pSilencer 3.1人H1启动子干扰载体中,利用测序鉴定所构建的重组载体是否正确,经电穿孔将3个重组载体(pSA-1、pSA-2、pSA-3)转染人白血病U937细胞系,G418(500 mg/L)有限稀释法持续筛选8周后,扩增获得稳定表达的细胞系；RT-PCR、Western blot分别检测稳定转染细胞系的AATF mRNA和AATF蛋白表达.结果表明,AATF干扰序列及读码框完全正确.稳定转染细胞AATF mRNA表达下调,AATF蛋白表达量下降(P＜0.05).结论:成功地构建AATF shRNA真核表达载体及AATF表达稳定抑制的白血病U937细胞系,为以AATF基因为靶点的人白血病进一步研究奠定了实验基础.
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急性髓系白血病(AML)中hsa_circ_0000254的实验研究
目的:通过克隆环状RNA hsa_circ 0000254,构建过表达载体并初步鉴定其表达水平,为进一步的功能研究奠定基础.方法:人工合成hsa_circ_0000254的524 bp序列,用pGH克隆载体合成基因,然后酶切目的片段,连接到慢病毒过表达载体pLCDH-ciR中,测序验证.筛选阳性克隆,分别以pLCDH-circ254(C254)、NC(pLCDH-ciR)转柒293T细胞,培养40 h后收集细胞进行PCR检测及产物测序验证.结果:pLCDH-circ254表达载体经测序验证,测序峰图正常,且无杂峰或叠带,序列对比吻合,表明hsa_circ_0000254成功插入环状RNA表达载体pLCDH-ciR,过表达载体构建成功,表达效率高达1万倍.结论:成功构建hsa_circ_ 0000254表达载体,可高效表达hsa_circ_0000254.
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携带人OCT4A基因的慢病毒载体的构建及其稳定转染K562白血病细胞株的建立
本研究旨在构建共表达人OCT4A与绿色荧光蛋白(GFP)慢病毒载体pLVX-OCT4A-ZsGreen1,并通过感染获得稳定表达重组质粒的白血病K562细胞系,观察OCT4A在其中的表达.根据GenBank数据库提供的OCT4A mRNA序列,合成编码mRNA基因的特异性引物序列,通过RT-PCR技术扩增出OCT4A全长片段,克隆至pCR-Blunt载体.将OCT4A DNA片段酶切回收后克隆至经EcoR1酶切线性化的慢病毒载体pLVX-IRES-Zs-Green1,构建pL VX-OCT4 A-ZsGreen1慢病毒重组质粒,利用测序鉴定所构建的重组载体是否正确.经三质粒包装系统包装后获得高滴度慢病毒颗粒并感染人白血病细胞系K562,通过流式细胞仪分选获得稳定表达的白血病细胞系,应用Real-time PCR和Western blot方法分别检测稳定转染细胞系的OCT4A mRNA和OCT4A蛋白表达.应用CCK-8法和平板细胞克隆形成试验测定OCT4A对K562细胞增殖能力的影响.结果表明,经限制性内切酶检测及基因测序证实成功构建了携带OCT4A基因的重组慢病毒;包装病毒颗粒超速离心后病毒滴度达(1.43±0.25)×108 U/ml;病毒感染K562细胞后经流式细胞仪分选获得GFP+细胞,实时定量PCR及Western blot证实病毒感染后OCT4A基因及蛋白的表达可有效上调;CCK-8法及平板集落形成试验显示病毒感染的K562细胞体外增殖活性明显升高,与对照组相比均有统计学差异(P＜0.05).结论:成功构建了表达OCT4A基因的慢病毒载体,并且获得可稳定上调OCT4A表达的K562细胞株.
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重组变异体二氢叶酸还原酶和绿色荧光蛋白腺相关病毒载体的构建及外源基因表达
构建携带变异体二氢叶酸还原酶(mDHFR)和绿色荧光蛋白(GFP)融合基因的重组腺相关病毒(AAV)载体,并使其在NIH3T3细胞中表达,观察NIH3T3细胞的耐药性变化.先分别扩增mDHFR和GFP基因片段,并用甘氨酸接头以PCR的方法将其连接在一起,插入T载体,酶切后插入AAV载体,包装成病毒后感染NIH3T3细胞,通过PCR、荧光显微镜和流式细胞术对融合基因的表达进行观察.结果:PCR检测到NIH3T3细胞DNA基因组中mDHFR和GFP cDNA,荧光显微镜和流式细胞仪观察到绿色荧光蛋白表达的比率约为25%,MTT法检测转基因组对MTX的耐药性增强.结论:AAV载体可以将mDHFR和GFP融合基因导入NIH3T3细胞并成功表达,使其对MTX的耐药性增强,为mDHFR基因和AAV载体在基因治疗中的应用提供了理论依据.
关键词： 腺相关病毒 变异体二氢叶酸还原酶 绿色荧光蛋白 载体构建 基因表达 -
增强型绿色荧光蛋白逆转录病毒载体的构建和表达
逆转录病毒载体被广泛用作对造血细胞进行基因转移的工具,转导方法的改进有赖于应用可快速分析并被高效选择的基因标志.为此,我们克隆了增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因,并构建可表达EGFP的逆转录病毒载体LGSN,通过脂质体转染和交互感染方法建立高滴度的逆转录产病毒细胞,用以分析对造血细胞标记EGFP基因的可行性.流式细胞术和荧光显微镜检测发现,EGFP病毒转录的GP+envAm12细胞和K562细胞均可发出稳定的绿色荧光信号,阳性率可分别达97%和86%;聚合酶链反应分析显示LGSN转导细胞内有原病毒的整合.上述结果提示,作为新一代选择性标志,EGFP是适于研究对造血细胞基因转移与表达的报告基因,对促进人类基因治疗的研究有重要意义.
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靶向mdr-1基因shRNA真核表达载体的构建与鉴定
本研究构建并鉴定靶向mdr-1基因的短发夹RNA(shRNA)真核表达载体.根据Genbank数据库提供的mRNA序列,选择设计3个能转录短发夹RNA(shRNA)的DNA序列,体外分别合成3对互补并编码mRNA基因的特异性shRNA序列的寡核苷酸,克隆到经BamHI和HindⅢ双酶切线性化的pGCsilencer人U6启动子质粒载体中;为了确定利用酶切和测序鉴定所构建的重组载体是否正确,采用脂质体转染的方法将构建好的3个重组载体(pGY1-1,pGY1-2,pGY1-3)导入慢性髓系白血病耐药细胞株K562/A02,采用实时PCR方法检测转染细胞的mdr-1基因表达,Western-blot检测P-gp表达量的变化.结果表明:应用PCR电泳图谱和测序证实了克隆RNAi打靶序列完全正确,而且该载体又同时表达GFP标记基因,用于测定转染效率.分别转染pGY1-1,pGY1-2,pGY1-3后K562/A02细胞的mdr-1基因表达和P-gp表达水平下降,证明shRNA可以特异性沉默mdr-1基因.结论:靶向mdr-1基因shRNA真核表达载体构建成功,为进一步研究mdr-1基因在K562/A02细胞中的作用奠定了实验基础.
关键词： mdr-1基因 短发夹RNA K562/A02细胞 载体构建 -
多发性骨髓瘤黏蛋白-1基因真核表达载体构建及其在COS-7细胞中的表达
本研究旨在构建多发性骨髓瘤黏蛋白1(两串联)基因(mucl-2vntr)的真核表达载体及该重组体在COS-7细胞中的表达,为研制多发性骨髓瘤基因疫苗奠定基础.以MUC1-2VNTR蛋白的编码基因作为目的基因,在其前端加上KOZAK序列后,两端分别加上HindⅢ和Xba Ⅰ酶的酶切位点,将人工合成的全基因定向插入pcDNA3.1/myc-his B载体中,转化E coli感受态细胞获得重组菌株,经酶切及测序鉴定为pcDNA3.1-2vntr/myc-his B重组质粒后,采用Lipofectimine脂质体介导法转染COS-7细胞,用荧光显微镜对荧光表达进行观察,然后用Western blot检测重组体在细胞内外的表达.结果表明:合成的MUC1-2VNTR基因全长约140 bp,所构建的pcDNA3.1-2vntr/myc-his B重组质粒经双酶切及测序鉴定后,与预期片段大小相符,并含有完整的阅读框架和目的基因.将其转入COS-7细胞后48小时,荧光显微镜和Western blot检测均可证实黏蛋白1表达.结论:成功的构建了多发性骨髓瘤真核表达载体pcDNA3.1-2vntr/myc-his B,并在COS-7细胞中成功地表达黏蛋白1,这为黏蛋白1的功能研究和多发性骨髓瘤基因疫苗的研制提供了实验基础.
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人类免疫缺陷病毒Ⅰ型载体研究进展
人类免疫缺陷病毒Ⅰ型(human immunodeficiency virus type Ⅰ,HIV-Ⅰ)为慢病毒家族成员之一,除gag,pol与env等结构基因外,其结构中还含有编码2个调节蛋白及4个附属蛋白的基因.目前已构建了多种类型的复制缺陷性HIV-Ⅰ载体,产生的病毒滴度高可达107 TU/ml;对包装细胞系的研究发现,将4个附属基因全部去除对载体的转导能力并无显著影响.基因组分离式包装系统降低了产生具有复制能力的病毒的可能性.HIV-Ⅰ载体具有两大特点:可有效转导人CD34+造血干/祖细胞、重复注射不引起排斥反应.改建后的HIV-Ⅰ载体具有广泛的宿主范围.
关键词： 人类免疫缺陷病毒Ⅰ型 慢病毒 逆转录病毒 载体构建 -
遗传性铁粒幼细胞贫血致病的ALAS2基因表达载体的构建
X连锁遗传性铁粒幼细胞贫血(XLSA)是红系特异性δ-氨基γ-酮戊酸合酶(δ-amionlevulinic acid syntase 2,ALAS2)基因突变造成的,本研究构建ALAS2基因的真核表达载体,观察表达载体转染真核细胞后蛋白表达的情况.将获自人胎肝的ALAS2基因插入到红色荧光蛋白质粒pDs-red2-N1中,命名为pDs-red2-N1/ALAS2;采用电穿孔方法将质粒转染K562细胞;转染后48小时提取细胞总RNA,进行RT-PCR检测ALAS2基因表达;流式细胞术检测红色荧光蛋白表达.再采用脂质体方法将质粒转染COS7细胞,转染后72小时提取细胞总RNA,RT-PCR检测ALAS2基因表达,荧光显微镜观察COS7细胞红色荧光蛋白表达情况.结果表明:构建了一种pDs-red2-N1/ALAS2真核表达载体,提取质粒DNA经酶切、电泳可以看到在4 700bp和1 764 bp处存在两条电泳条带;全长测序证实构建的载体序列正确;质粒转染K562和COS7细胞后均出现阳性ALAS2基因转录产物;流式细胞术检测转染后K562细胞红色荧光蛋白表达的阳性细胞百分率为19.2%;荧光显微镜显示转染后COS7细胞红色荧光蛋白,表达高峰出现在转染后第3天,阳性细胞百分率为10.7%,并可持续表达10天左右.红色荧光蛋白的表达可以间接说明ALAS2基因的表达.结论:ALAS2基因的真核表达载体构建成功,可以通过电穿孔和脂质体的方法转染真核细胞中并在其胞浆中表达,有可能用于XLSA患者基因替代治疗.
关键词： 遗传性铁粒幼细胞贫血 ALAS2基因 载体构建 基因转染 基因治疗
