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LIMK1-siRNA真核载体的构建及在人软骨细胞中的蛋白表达
目的 构建LIMK1-siRNA真核表达载体,为骨关节发病机制的研究奠定基础.方法 合成3条LIMK1的小RNA分子的寡聚脱氧核苷酸链,重组质粒测序,瞬时转染人软骨细胞,采用Western blot检测LIMK1表达情况.结果 Western blot检测LY3号质粒的细胞中LIMK1蛋白表达明显下调,经通用引物对LY3号重组质粒测序鉴定,与设计序列核对完全相符.结论 成功构建LIMK1-siRNA真核表达载体,有效沉默了人软骨细胞中LIMK1蛋白表达.
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Cpn0147基因真核表达载体的构建及在HeLa细胞中的表达
目的 构建肺炎衣原体Cpn 0147基因真核表达重组质粒,为进一步研究其与宿主相互作用的分子机制打下基础. 方法 以Cpn AR39株基因组为模板,以Cpn0147全长编码特异性引物进行PCR扩增;将Cpn0147基因插入至pcDNA3.1 +/His/Myc载体,构建pcDNA3.1+ /His/Myc Cpn0147重组质粒,经双酶切及测序鉴定后转染至HeLa细胞中,采用RT-PCR检测重组质粒转染情况,采用免疫荧光法及Western blot检测Cpn0147蛋白在细胞中的表达.试验设pcDNA3.1 +/His/Myc载体为阴性对照. 结果 从CpnAR39株基因组DNA中扩增出Cpn0147基因片段,大小466 bp,经双酶切、连接、转化、筛选,得到pcDNA3.1 +/His/Myc-Cpn0147重组质粒,序列测定证实与GenBank CpnAR39株Cpn0147基因序列一致;RT-PCR扩增出Cpn0147基因,与理论大小一致;免疫荧光检测重组质粒转染后HeLa细胞胞浆观察到红色荧光,对照组无荧光;Western blot检测到特异反应条带位于16 kd,对照组无此条带. 结论 成功构建pcDNA3.1 +/His/Myc-Cpn0147重组质粒并在真核细胞内表达Cpn0147蛋白,为进一步研究其分子生物学功能奠定了基础.
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布鲁氏菌Omp19基因真核载体的构建及对细胞免疫的影响
目的 了解羊种布鲁氏菌Omp19基因在真核细胞中的表达和对细胞免疫的影响. 方法 根据GenBank公布的羊布鲁氏菌16M株外膜蛋白Omp19基因序列设计1对引物,以其全基因组为模板进行扩增,Omp19基因扩增片段连接pMD18-T载体,转染及测序鉴定正确后进行双酶切,构建重组质粒pLEX-MSC-Omp19,转染巨噬细胞RAW264.7中,用Western blot分析Omp19基因在巨噬细胞内的表达,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测转染Omp19基因的细胞干扰素γ(IFNγ) 和IL-6分泌的影响. 结果 获得534 bp目的基因片段并成功构建Omp19真核表达载体,Omp19基因在巨噬细胞内成功表达,表达蛋白Omp19可显著提高细胞分泌IFN-γ和IL-6水平(P＜0.01). 结论 Omp19基因表达产物在细胞内具有免疫原性,能提高细胞免疫水平,可作为亚单位疫苗候选基因.
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鼠抗人血小板CD36分子单克隆抗体的制备及活性分析
本研究旨在制备具有功能活性的重组人血小板表面CD36抗原的鼠抗人单克隆抗体.提取人肝细胞总RNA,经RT-PCR扩增编码人血小板CD36抗原胞外区(Gly30-Asn439)氨基酸残基cDNA,构建于原核表达载体pMD18并转化大肠杆菌DH5α,筛选获得阳性重组子pMD18-CD36,提取质粒.经序列测定后,将该基因插入到真核细胞瞬时表达载体pTE2上,构建成为pTE2-s-CD36-10 His真核瞬时表达载体.采用lipofectamine 2000转染法,将重组质粒转染至HEK293细胞,表达产物经Ni2+2NTA柱层析纯化.以制备的重组CD36蛋白免疫BALB/c小鼠后,取脾与小鼠骨髓瘤细胞融合,筛选出阳性克隆,行Western blot检测抗体结合活性.结果显示:RT-PCR扩增获得了1.4 kb的片段.经测序,该序列分析结果与GenBank中的NM_001001547.2完全一致.SDS-PAGE证实转染的HEK293细胞表达了人CD36抗原胞外区蛋白片段.鼠单克隆抗体在Western blot中可以识别重组CD36蛋白,灵敏度达到8 ng.结论:成功制备了抗人血小板CD36单克隆抗体,为临床筛选CD36阴性患者及献血员、深入研究人血小板CD36表面抗原对血小板输注无效的影响提供了实验基础.
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SEA和喉癌MAGE-A3基因重组真核共表达载体的构建和鉴定
目的 构建超抗原SEA和喉癌来源的MAGE-A3基因共表达的真核表达载体,检测、鉴定其在293T细胞中的表达.方法 分别用RT-PCR方法及人工化学合成法获得MAGE-A3和SEA基因片段,然后依次将MAGE-A3和SEA基因克隆至含内部核糖体进入位点的真核表达载体IRES序列的上、下游,构建成重组质粒pMAGEA3-IRES-SEA.经脂质体转染至293T细胞以后,用荧光定量PCR、蛋白免疫印迹分别鉴定SEA、MAGE-A3基因的表达.结果 限制性内切酶酶切分析证实MAGE-A3基因和SEA基因均正确地克隆在pMAGEA3-IRES-SEA中,基因测序结果与GenBank公布的MAGE-A3、SEA序列完全一致,实现了双基因的正确重组.重组质粒转染293T细胞后能检测到MAGE-A3、SEA基因的高水平表达.结论 成功地构建了pMAGEA3-IRES-SEA真核表达质粒,并能在293T细胞中有效表达MAGE-A3和SEA蛋白,由此奠定了其作为抗喉癌DNA疫苗应用的基础.
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SV40病毒T抗原真核载体的构建与表达
目的设计、构建SV40病毒T抗原真核表达载体,并导入真核细胞进行表达鉴定. 方法采用重叠延伸拼接法,从pUC19-SV40载体中亚克隆切除内含子的SV40病毒T抗原基因全长片段,EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切后定向克隆至pEGFP-N1真核表达载体上,酶切鉴定重组质粒;用脂质体转染的方法将构建的载体导入原代培养的正常人成纤维细胞进行表达,检测SV40病毒T抗原基因在成纤维细胞内的表达. 结果 SV40病毒T抗原基因成功克隆至pEGFP-N1真核表达载体中;转染成纤维细胞提取基因组DNA及总RNA,分别经PCR和RT-PCR反应扩增出288 bp的特异性片段. 结论本试验构建的SV40病毒T抗原重组质粒为利用SV40T抗原进行真核细胞研究提供了稳定、可靠的分子工具.
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AFP/HSP7O重组蛋白表达载体抗人肝癌细胞免疫的实验研究
目的:构建真核表达载体pBBS212-AFP/HSP70,进行肝癌基因工程疫苗主动免疫的初步研究.方法:构建的真核表达载体pBBS212-AFP/HSP70,磷酸钙共沉淀法转染SP2/0细胞,放射免疫和双夹心ELISA法鉴定AFP和AFP/HSP70融合蛋白的表达.以上构建真核载体进行BALB/C小鼠股四头肌注射,免疫3次后,取脾制备悬液,经PHA和AFP刺激后,与HepG2细胞混合培养,MTT检测细胞毒反应.结果:构建的pBBS212-AFP/HSP70真核载体经磷酸钙共沉淀法转染,建立了分泌表达AFP/HSP70融合蛋白的SP2/0细胞株.上真核载体免疫小鼠后脾细胞与肝癌细胞混合培养,MTT检测显示对AFP表达较高的HepG2细胞呈现明确的杀伤效应,而空载体免疫组混合细胞培养表现较弱的效应.结论:pBBS212-AFP/HSP70真核载体的构建及其抗人肝癌细胞的体外细胞毒实验初步显示pBBS212-AFP/HSP70作为基因工程疫苗具有一定的意义,为今后深入实验研究奠定了良好的基础.
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pBBS212-AFP／HSP70真核载体的构建及鉴定
目的：构建真核表达载体pBBS212-AFP／HSP70，进行肝癌基因工程疫苗主动免疫的初步研究。方法：RT-PCR扩增AFP目的基因片段，与同酶切的pBBS212栽体连接，构建真核表达栽体pBBS212-AFP／HSP70。用碱裂解法和酶切对筛选阳性克隆进行鉴定。结果：成功构建pBBS212-AFP／HSP70真核载体，酶切显示AFP基因片段正确插入载体。结论：pBBS212-AFP／HSP70真核载体的构建为今后进行基因疫苗的实验研究奠定了良好的基础。
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FAM3B基因cDNA克隆及其在胃癌细胞系BGC-823的表达
目的 克隆FAM3B cDNA,构建FAM3B重组表达载体并在胃癌细胞系BGC-823中表达,观察其对细胞系的影响,探索新的肿瘤治疗途径.方法 构建pEGFP-N2-FAM3B真核表达质粒,将pEGFP-N2-FAM3B转染人胃癌细胞系BGC-823,研究其对胃癌细胞产生的作用.结果 重组pEGFP-N2-FAM3B真核表达质粒构建成功,经pEGFP-N2-FAM3B转染后,荧光显微镜下可见转染的BGC-823细胞有绿色荧光蛋白的表达,转染后的BGC-823细胞生长减慢.结论 构建完成真核表达载体pEGFP-N2-FAM3B,重组pEGFP-N2-FAM3B质粒在胃癌细胞系BGC-823细胞内成功表达.
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人KiSS-1基因克隆及其真核表达载体的构建
目的:克隆转移抑制基因KiSS-1的不含信号肽的表达序列,构建人KiSS-1基因的真核表达载体.方法:从人正常胰腺组织中提取总RNA,经RT-PCR得到KiSS-1基因开放阅读框cDNA序列,并将其克隆到真核表达载体pcDNA3中,构建真核表达质粒pcDNA3/KiSS-1.结果:经PCR、酶切鉴定和基因序列测定,证实重组入载体pcDNA3的片段为目的基因开放阅读框的核苷酸序列.结论:重组质粒pcDNA3/KiSS-1的成功构建,为该基因相应蛋白质的表达和其抗体的制备研究提供基础.
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多细胞相互作用培养的简易方法
在基因治疗研究中为研究转染外源基因的细胞对机体其他细胞的影响,目前生物学研究中常将不同种类的细胞在一起联合培养(co-culture),以模拟基因治疗在体内的作用环境[1],传统的方法是使用TRANSWELL培养瓶,利用生物半透膜将不同细胞隔开分别培养[2],该方法具有培养瓶价格过于昂贵、半透膜之间存在一定浓度差不利于细胞间相互作用[3]、TRANSWELL培养瓶结构复杂、瓶口相对较小,细胞收集困难等缺点.笔者在实验中利用一些细胞贴壁的特性将其中一种细胞先爬在载玻片上,再与培养在培养皿中的另一种细胞混合培养,有效地克服了以上缺点.现以NIH3T3细胞与转入pEGFP-C3-PENK真核载体的COS-7细胞为例共同培养加以说明.
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乙型肝炎病毒前前-S真核载体的构建与表达
前前-S位于乙型肝炎病毒(HBV)基因组前-S1区上游,长135 bp,编码45 aa,相对分子质量约45 000[1].杨倩等[2,3]对前前-S基因启动子序列分子生物学研究以及小样本的北方分子流行病学研究证实,前前-S基因广泛存在于我国HBV基因组中.
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叶酸受体α真核表达载体的构建及在HEK293细胞中表达的鉴定
从高表达叶酸受体α的卵巢癌细胞株SKOV3中提取总RNA,RT-PCR扩增FRα基因片段,使用HindⅢ和EcoRⅠ双酶切后克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中,对其进行酶切及测序鉴定；用脂质体介导法将重组质粒转染入人胚肾细胞HEK293中,并利用RT-PCR、Western blot及细胞免疫荧光染色检测细胞内FRα基因的表达情况.通过RT-PCR扩增得到750 bp左右的FRα基因片段,并构建了真核表达重组质粒,经酶切、测序鉴定正确.转染HEK293细胞后,RT-PCR检测到细胞中FRα mRNA的存在,Western blot、细胞免疫荧光证明FRα蛋白在细胞中的表达.成功构建了FRα基因的真核表达重组质粒,该质粒可在真核细胞中表达FRα蛋白,这些实验结果为卵巢癌基因疫苗的研究奠定了基础.
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表达翻转重组酶的真核载体的构建
目的 构建表达翻转重组酶(FLP)重组表达的真核载体.方法 以质粒pFRT为模板,用聚合酶链反应(PCR)扩增出两端包含了Xba Ⅰ和BamH Ⅰ内切酶识别位点的全长FLP基因片段,将该片段插入用Nhe Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切后的载体质粒pBK-CMV上,构建出重组质粒pBK-CMV-FLP.经过转化、挑选菌落,PCR鉴定且测序均正确.结果 成功构建重组质粒pBK-CMV-FLP.结论 构建好的pBK-CMV-FLP质粒为生物工程上删除筛选标记物提供了良好的条件.
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幽门螺杆菌NCTC11637、NCTC11639毒素相关基因A的克隆、序列分析及真核表达载体的构建
目的 克隆幽门螺杆菌毒素相关基因A (cytotoxin-associated gene A, CagA)全长序列并进行序列分析,构建表达CagA的真核表达载体,研究CagA调控胃泌素基因的表达.方法 PCR扩增出CagA基因全长片段后构建克隆载体 pMD18-T/ CagA7和pMD18-T/CagA9,测序结果登录GenBank,登录号分别为GQ161098(NCTC11637)和GQ161099(NCTC11639),用测序后筛选的PstI和BamHI内切酶将原核载体上的CagA基因酶切后连接到pcDNA3.1/ZEO(-)真核表达载体上,构建真核表达载体pcDNA3.1ZEO(-)/CagA7和pcDNA3.1ZEO(-)/CagA9,并经双酶切和 CagA PCR扩增鉴定,后转染胃癌细胞,检测胃癌细胞中胃泌素基因的表达.结果 序列比对结果显示NCTC11 637和NCTC11 637 CagA的同源性为88.77%,NCTC11 637与已收录的NCTC11 637 (AB 015 416) 同源性为99.22%,序列分析显示两者均有两个CagA酪氨酸磷酸化位点,转染细胞后CagA上调胃泌素基因的表达.结论 成功克隆了CagA全长基因,并构建了含CagA全长基因的真核表达载体,在胃癌细胞内上调了胃泌素基因的表达.
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甲型流感病毒核蛋白基因的真核质粒的构建及其表达
目的 构建甲型流感病毒A/PR/8/34(H1N1)核蛋白(nucleoprotein.NP)基因的真核表达载体,转染Hela细胞,并用甲型流感病毒检测试剂盒(Flu A Rapid Test Kit)检测其表达情况.方法 用特异引物从甲型流感病毒cDNA中采用PCR技术克隆出NP基因,将其插入到真核表达质粒pcDNA3.1(+).酶切、PCR、测序鉴定后,构建好的peDNA3.1(+)/NP用脂质体转染法转染到Hela细胞,通过甲型流感病毒检测试剂盒检测其蛋白表达.结果 克隆出一个核苷酸长度为1432bp的基因,和A/PR/8/34(H1N1)(GenBank/NCB,GI:8486129)有98%的同源性,转染Hela细胞后用甲型流感病毒检测试剂盒检测到24h、48h、72h细胞内外的蛋白表达.结论 成功构建甲型流感病A/PR/8/34(H1N1)核蛋白基因的真核表达质粒,为进一步研究理化因素对该基因的影响、基因的结构和功能打下良好的基础.
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SV40T抗原真核表达载体的构建及其在食管癌细胞EC9706中的表达鉴定
构建胃壁细胞特异性表达载体pcDNA3.1(-)/HKSV和非特异性表达载体pcDNA3.1(-)/SV,行酶切及测序鉴定.用脂质体转染法将构建的载体导入食管癌细胞EC9706细胞株,RT-PCR法检测SV40T抗原基因的表达,免疫组化法检测蛋白表达情况. 结果限制性内切酶分析与测序结果示H+/K+ATP酶β亚基启动子与SV40T基因成功构建于pcDNA3.1(-)真核表达载体中;转染细胞提取基因组DNA及总RNA,分别经PCR和RT-PCR反应扩增出618 bp和272 bp的特异性片段,非特异性表达载体pcDNA3.1(-)/SV瞬时转染时SV40T抗原表达阳性,而特异性表达载体pcDNA3.1(-)/HKSV转染组蛋白表达阴性.认为构建特异性表达载体pcDNA3.1(-)/HKSV并在食管癌细胞EC9706中检测其表达为转基因肿瘤动物模型的建立奠定了理论基础.
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SV40T抗原真核表达载体的构建及表达
目的:构建SV40T抗原的特异性真核表达载体,并导入胃癌细胞株SGC7901进行表达鉴定.方法:扩增小鼠H+/K+ATPase β亚基启动子,与pMT18-T载体相连,并将其亚克隆至真核表达载体 pcDNA3.1(-),构建pcDNA3.1(-)/HK; 从含有SV40T基因的pLITAg质粒酶切回收SV40T基因,与pcDNA3.1(-)/HK相连,构建胃壁细胞特异性表达载体pcDNA3.1(-)/HKSV,同时构建非特异性表达载体pcDNA3.1(-)/SV,进行酶切及测序鉴定.用脂质体转染的方法将构建的载体导入胃癌细胞株SGC7901,PCR扩增基因组DNA,RT-PCR检测SV40T mRNA的表达.结果:限制性内切酶分析与测序结果显示,真核表达载体pcDNA3.1/HKSK构建成功;转染该载体的SGC7901细胞可检测到SV40T基因DNA的存在,且有SV40T mRNA的表达.结论:特异性表达SV40T基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)/HKSV构建成功.
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裸质粒转染细胞的可行性研究
目的 验证裸质粒转染细胞的可行性与合适的转染的条件.方法 取PCDNA3 1( + )-EGFP与pEGFP-C3两种绿色荧光载体,以不同的浓度转染细胞,观察转染效果,选取转染效果较好的质粒浓度进行动物实验,进一步验证其效果.结果 真核载体可直接通过细胞膜进入细胞并表达绿色荧光.结论 真核载体可直接通过细胞膜进入细胞,但其通过效率与自身的结构与质粒浓度有一定关系.
