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胞嘧啶脱氨酶和血管内皮抑素基因慢病毒载体的构建与鉴定
目的 构建携带胞嘧啶脱氨酶(CD)和血管内皮抑素(ES)基因的慢病毒载体.方法 根据GenBank提供大肠杆菌源CD和ES基因序列设计、合成2个基因并构建与荧光蛋白融合的真核表达载体pEGFP-CD和pDS-RED-ES.酶切和测序鉴定后,将载体瞬时转染HEK293细胞,运用实时PCR检测CD和KS基因表达情况.把载体中基因片段EGFP-CD和DS-RED-ES通过BP/LR重组分别构建慢病毒载体,并利用293FT细胞进行慢病毒的包装.将病毒原液浓缩,并测定病毒滴度.结果 酶切、测序及PCR鉴定证实构建出慢病毒载体pLenti6.3-CD-EGFP和pLenti6.3- ES- Monomer - DsRed.感染293FT细胞后荧光显微镜下观察到GFP和DsRed的表达.浓缩慢病毒滴度分别为2.2× 108 TU/ml和6.5×107 TU/ml.结论 成功构建了CD和ES基因慢病毒载体.
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胞嘧啶脱氨酶APOBEC3G可能通过G→A突变抑制乙型肝炎病毒的复制
目的 研究胞嘧啶脱氨酶APOBEC3G(A3G)对HBV复制的影响及作用机制.方法 利用脂质体介导A3G和HBV的真核表达质粒瞬时共转染人肝癌细胞株HepG2,以空载体pcDNA3.1与HBV真核表达质粒共转染为对照,同时转染含增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的质粒载体以判定转染效率.共转染两天后用荧光定量PCR方法定量细胞内核壳体(core)相关HBV DNA水平,用Western blot检测细胞内A3G和HBcAg的表达,并对细胞内core相关HBV DNA X基因进行PCR扩增、T-A克隆和测序,分析X基因中的碱基突变.结果 经EGFP判定的转染效率平均为29%.共转染0.5 μg A3G和0.5 μg HBV的HepG2细胞内core相关HBV DNA量平均下降为对照的8.9%,共转染2μg A3G和0.5 μg HBV的平均下降为对照的0.6%.共转染A3G和HBV表达质粒后,HepG2细胞内HBV的X基因中发生G→A突变的数目明显增多,33个克隆中有9个克隆检测到了16～37个G→A突变,突变总数达254个,而对照的33个克隆中仅有2个克隆各检测到2个G→A突变.进一步的分析发现,共转染A3G后发生的G→A突变大多集中于几个热点区域,突变靶点常在GG二核苷酸中的第一个G上.结论 胞嘧啶脱氨酶APOBEC3G可能通过诱导HBV DNA的X基因发生G→A超突变,抑制HBV在人肝癌细胞HepG2中的复制.
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活化诱导的胞嘧啶脱氨酶（AID）抗病毒作用研究进展
APOBEC （ apolipoprotein B mRNA-editing enzyme catalytic polypeptide-like protein ）家族为载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样蛋白，具有脱氨酶功能，到目前为止共发现了11种该家族成员：APOBEC1、APOBEC2、APOBEC3s（A～C，DE，F～H）、APOBEC4、AID［1］。 APOBEC家族成员可以通过固有免疫和适应性免疫作用抑制病毒感染和限制病毒复制［1］。作为APOBEC家族成员之一，活化诱导的胞嘧啶脱氨酶（ ac-tivation induced cytidine deaminase ， AID）主要通过介导免疫球蛋白基因类别转换（ gene class switch DNA recombination ， CSR）和体细胞高频突变（somatic hypermutation，SHM）产生高亲和力抗体参与机体的适应性免疫功能［2］，近年来研究发现AID可以通过介导病毒感染细胞凋亡或病毒基因组降解等方式发挥抗病毒作用［3-6］。本文主要对AID在抗病毒中发挥作用进行综述。
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CD/5-FC自杀基因体系对肝、胆、胰肿瘤细胞的杀伤作用及机制
目的:通过CD/5-FC自杀基因体系对肝BEL-7402、胆QBC、胰BXPC-3三系肿瘤细胞杀伤效率的比较,探讨影响这种杀伤差异的可能机制.方法:测定BEL-7402、QBC、BXPC-3三系肿瘤细胞的生长周期及倍增时间.FACS测定阳离子脂质体介导的三系肿瘤细胞瞬时转染效率.MTT法测定阳离子脂质体介导CD/5-FC自杀基因体系对瞬时转染的肝胆胰三系肿瘤细胞体外杀伤效率.观察细胞倍增时间与转染效率与杀伤效率之间的关系.FACS对三系肿瘤细胞瞬时转染自杀基因后凋亡进行比较,并用H0chest33342染色后进行观察.结果:BEL-7402、QBC、BXPC-3的倍增时间分别是34.48、64.94、26.29 h.QBC细胞同BEL-7402及BXPC-3相比差异有显著性(P＜0.05):BEL-7402、QBC、BXPC3三系细胞阳离子脂质体介导的转染率分别为26.99%、2.25%、30.36%.BEL-7402和BXPC-3同QBC细胞有显著差异(P＜0.05);瞬时转染自杀基因后抑制效率分别为83.24%,16.97%,92.32%;在CD/5-FC杀伤三系细胞可能的机制-凋亡的研究中,三者凋亡率分别为27.8%,5.49%,36.5%.结论:生长周期短,倍增时间快的细胞系瞬时转染率高,对CD/5-FC自杀基因疗法比较敏感,该自杀基因疗法可能对临床晚期消化系恶性肿瘤是一种很有前景的治疗方法.
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胰腺癌的基因治疗
胰腺癌仅占恶性肿瘤的2%,却占癌症死亡的第4位.迄今为止,胰腺癌的切除率从未超过20%,五年生存率低于5%.
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胃泌素拮抗剂增加CD自杀基因对结直肠癌细胞的杀伤作用
目的:研究联合应用胃泌素拮抗剂和胞嘧啶脱氨酶(CD)的基因治疗对结肠癌细胞的杀伤作用.方法:脂质体法转染G1CEACDNa至LoVo细胞.用含1mmol/L5-FC或/和1×10-8mmol/L CI-988的100ml/L胎牛血清的RPMI1640培养基培养细胞,测生长曲线;MTT法测细胞杀伤率;透射电镜观察细胞的超微结构;流式细胞仪annexin V和PI双重染色行凋亡相关检查;Balb/c裸鼠背部皮下接种CD+LoVo细胞,5-FC(500mg/kg)腹腔注射或/和CI-988(10mg/kg)灌胃处理20 d,处死裸鼠后肿瘤称重,病理切片HE染色,瘤组织透射电镜检查.结果:用5-FC或/和CI-988处理6 d后CD+LoVo细胞抑制率分别为90%和50%,二者合用于3 d和6 d抑制率分别为40%和97%;MTT法检测联合应用5-FC和CI-988较单用任何一种处理对CD+LoVo细胞杀伤作用更强,有统计学差异(0.53±0.05 vs 0.49±0.02,0.38±0.06,F=29.5536,n=5,P＜0.01);电镜和流式细胞仪分别显示CD/5-FC和CI-988结合处理72 h后细胞有凋亡现象;用5-FC(500 mg/kg)腹腔注射和CI-988(10 mg/kg)灌胃处理荷瘤裸鼠均可出现明显的抑瘤作用,抑瘤率分别为69.4%和495%,二者合用抑瘤较单用任一种处理更明显,有统计学意义(0.42±0.12 vs0.69±0.11,1.22±0.22,F=33.1709,n=5,P＜0.05),抑瘤率达81.5%,电镜下见瘤组织内有凋亡小体.结论:联合应用胃泌素拮抗剂CI-988可以提高CD/5-FC对结肠癌细胞的杀伤作用.凋亡相关过程可能是这种协同作用的原因.
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腺病毒介导CD/UPRT自杀基因系统治疗胰腺癌的实验研究
目的 探讨CD/UPRT自杀基因系统在胰腺癌基因治疗中的作用.方法 采用同源重组技术构建重组腺病毒Ad-CD、Ad-CD/UPRT和Ad-GFP;体外感染人胰腺癌SW1990细胞,RT-PCR检测UPRT mRNA表达;MTT法检测细胞对5-FC的敏感性及旁观者效应;流式细胞仪分析细胞凋亡率;建立胰腺癌裸鼠皮下移植瘤模型,瘤体内直接注射腺病毒,观察CD/UPRT自杀基因的原位治疗作用.结果 转染CD/UPRT的胰腺癌SW1990细胞对5-FC的敏感性明显提高,Ad-CD/UPRT组的IC50为25 μmol/L,而Ad-CD组和Ad-GFP组分别为100 μmol/L和＞1 000 μmol/L.Ad-CD组、Ad-CD/UPRT组和Ad-GFP组的细胞凋亡率分别为61.3%、40.5%和3.0%,3组比较有显著差异(P＜0.05).CD/UPRT基因转染存在旁观者效应.Ad-CD/UPRT瘤内注射治疗后种植癌体积缩小81%,Ad-GFP治疗肿瘤缩小63%.结论 CD/UPRT自杀基因系统能提高对胰腺癌细胞的杀伤作用.
关键词： 胰腺肿瘤 胞嘧啶脱氨酶 尿嘧啶磷酸核糖转移酶 腺病毒 基因治疗 -
5-氟胞嘧啶对CD基因修饰的胰腺癌细胞作用的电镜观察
目的应用微观检查方法探讨5-氟胞嘧啶(5-flurocytosine,5-FC)对胞嘧啶脱氨酶(cytosine deaminase,CD)基因修饰的胰腺癌细胞体外、体内杀伤的作用机制.
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CD/5-FC系统对胰腺癌裸鼠移植瘤的抗血管形成作用的初步探讨
目的探讨自杀基因系统对胰腺癌裸鼠移植瘤的微血管形成的抑制作用.方法构建含大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(cytosine deaminase,CD)基因的腺病毒穿梭载体pAdTrack CMV-CD,与骨架载体pAdEasy-1在细菌内重组为pAd-CD,经293细胞包装、扩增,氯化铯密度梯度离心制备纯化高效的CD腺病毒液,建立胰腺癌裸鼠皮下移植瘤模型,观察CD基因的原位治疗及微血管形成抑制情况.结果含CD基因腺病毒载体经酶切鉴定正确,包装纯化后,检测病毒滴度为2×1011pfu/ml,体内实验显示CD基因原位转导对裸鼠胰腺癌移植瘤的微血管形成具有较明显的抑制效应.结论腺病毒介导CD/5-FC自杀基因系统,不仪可以直接杀灭癌细胞,而且还可通过抑制移植瘤微血管的形成来抑制胰腺癌细胞的生长,可作为胰腺癌基因治疗的有效方法.
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5-氟胞嘧啶对CD基因修饰的胰腺癌细胞作用的电镜观察
目的应用微观检查方法探讨5-氟胞嘧啶(5-flurocytosine,5-FC)对胞嘧啶脱氨酶(cytosine deaminase,CD)基因修饰的胰腺癌细胞体外、体内杀伤的作用机制.方法构建含大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因的腺病毒载体,经包装、扩增后制备纯化高效的CD腺病毒液,体外培养胰腺癌细胞并建立胰腺癌裸鼠皮下移植瘤模型,电镜下观察转染CD基因及加入前药5-FC后胰腺癌细胞的微观变化情况.结果含CD基因腺病毒载体经酶切鉴定正确,病毒滴度为2×1011pfu/ml,电镜观察到CD/5-FC系统对胰腺癌的体外杀伤是一种凋亡现象而非坏死,而体内实验观察到坏死与凋亡并存,同时亦观察到淋巴细胞浸润.结论 CD/5-FC系统对胰腺癌的作用,有多种因素及旁观者效应参与其内.体外结果显示,凋亡小体的摄入和毒性代谢产物的直接作用可能起主要作用.体内实验结果显示细胞坏死与凋亡并存,免疫反应在抑制肿瘤生长中也起着重要作用.
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CEA启动子特异性启动双自杀基因CD与TK在CEA+恶性肿瘤中表达
目的 探讨CEA启动子(CEA promoter, Cp)在肿瘤细胞特异性启动双自杀基因胞嘧啶脱氨酶(cytosine deaminase,CD)与胸苷激酶(thymidine kinase, TK)的作用.方法 培养Lovo与Hela细胞,传代冻存.10 μl带有Cp.CD.TK重组腺病毒(recombinantadenovirus with Cp.CD.TK, RA-Cp.CD.TK)病毒液转染Lovo与Hela,荧光显微镜观察,收集细胞提取总RNA, PCR扩增Cp、CD与TK,电泳鉴定.病毒转染Lovo与Hela传代接种96孔培养板,每株细胞分两组,每组24孔:第一组给予5-氟胞嘧啶(5-fluorocytosine,5-Fc)10 mg/L培养液,第二组给予更昔洛韦(ganciclovir,GCV) 5 mg/L培养液,光镜观察细胞形态,台盼蓝染色检测细胞活力.结果 转染病毒的Lovo细胞及Hela细胞均可见绿色荧光,PCR均可扩增出Cp、CD和TK.5-Fc和GCV对Lovo细胞具有很强的杀伤作用,对Hela细胞则微弱,5-Fc实验组Lovo细胞活力平均为8.54%±1.34%,Hela细胞平均为95.05%±2.18%( P＜0.01).GCV实验组Lovo细胞活力平均为8.38%±1.22%,Hela细胞平均为95.39%±1.64%(P＜0.01).结论 RA-Cp.C.T靶向性杀伤CEA+的Lovo结肠癌细胞,而对CEA-的Hela子宫颈癌细胞生长无影响.
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腺病毒介导的双自杀基因对直肠癌细胞的杀伤作用
目的探讨直肠癌的基因治疗方法. 方法用重组腺病毒介导外源胞嘧啶脱氨酶(CD)基因、单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因转移到人直肠癌细胞系HR-8348,通过细胞集落形成实验、细胞存活率测定(MTT法),检测、分析CD和HSV-tk双自杀基因系统对肿瘤细胞的作用. 结果重组腺病毒介导的CD和HSV-tk自杀基因可在HR-8348细胞高效表达.用腺病毒穿梭质粒pAdCMV-Link1 (CD+tk)、pAdCMV-Link1(-)、pAdCMV-Link1(CD)、pAdCMV-Link1(tk)重组腺病毒感染HR-8348细胞,不加5-氟胞嘧啶(5-FC)、环氧鸟苷(GCV),各组肿瘤细胞的集落形成和存活率的差异无显著性意义(P＞0.05).应用5-FC、GCV 后,pAdCMV-Link1(CD+tk)转染组细胞集落形成和存活率显著低于对照组和pAdCMV-Link1(-)转染组(P＜0.01),也低于pAdCMV-Link1(CD)、pAdCMV-Link1(tk)转染组(P＜0.05).CD和5-FC、HSV-tk和GCV 系统联合作用较单一自杀基因系统对HR-8348直肠癌细胞的集落形成、细胞生长有更显著的抑制作用,对肿瘤细胞有更强的杀伤能力和"旁观者效应”. 结论 CD和HSV-tk双自杀基因联合作为肿瘤基因治疗的一种手段和方法,较单一自杀基因具有更强的抗肿瘤作用.
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CDglyTK双自杀基因腺病毒系统的构建及其对瘢痕疙瘩成纤维细胞的杀伤作用
胸腺嘧啶核苷激酶(thymidine kinase,TK)基因和胞嘧啶脱氨酶(cytosine deaminase,CD)基因整合形成的双自杀基因CDglyTK,通过适当的载体导入靶细胞内,同时给予两种基因前体药物,前体药物在自杀基因表达产物作用下转化为有毒性的代谢产物,通过干扰DNA和RNA的合成抑制细胞增殖,促进靶细胞凋亡.我们利用改良细菌内同源重组法构建CDglyTK双自杀基因的腺病毒,并观察其对瘢痕疙瘩成纤维细胞的杀伤效应,为进一步研究重组CDglyTK双自杀基因对瘢痕疙瘩的治疗作用提供依据.
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半胱天冬酶3前酶增强胞嘧啶脱氨酶-胸苷激酶融合双自杀基因系统治疗人卵巢癌的体外研究
目的探讨半胱天冬酶3前酶(procaspase-3)能否增强胞嘧啶脱氨酶-胸苷激酶/5-氟胞嘧啶+更昔洛韦(CD-TK/5-FC+GCV)系统对人卵巢癌细胞的体外杀伤作用.方法构建procaspase-3的表达载体pcDNA3-casp3和人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子调控下的CD-TK融合双自杀基因表达载体pBTdel-279-CD-TK.应用蛋白印迹法检测pcDNA3-casp3和pcDNA3质粒转染后的3AO细胞(3AO-pcDNA3-casp3、3AO-pcDNA3细胞)中procaspase-3蛋白的表达情况;应用RT-PCR技术检测pBTdel-279-CD-TK和pBTdel-279分别转染的3AO-pcDNA3-casp3和3AO-pcDNA3细胞中CD和TK基因的表达情况;应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法、流式细胞仪技术、蛋白印迹法和荧光底物分析法分别检测4种细胞在CD-TK/5-FC+GCV系统作用后的细胞存活率、细胞周期及半胱天冬酶3(caspase-3)活性.结果 3AO-pcDNA3-casp3细胞有明显的procaspase-3蛋白表达,而3AO-pcDNA3细胞则无表达.3AO-pcDNA3-casp3和3AO-pcDNA3细胞在pBTdel-279-CD-TK转染后均可检测到CD和TK基因,但在pBTdel-279质粒转染后则CD和TK基因表达均为阴性.在5-FC+GCV作用下,3AO-pcDNA3-casp3+pBTdel-279-CD-TK细胞的存活率显著低于3AO-pcDNA3+pBTdel-279-CD-TK细胞.在5-FC(2 mmol/L)+GCV(10 μg/ml)作用48 h后,3AO-pcDNA3-casp3+pBTdel-279-CD-TK细胞的凋亡率为37.98%,S期比例为49.67%,分别高于3AO-pcDNA3+pBTdel-279-CD-TK细胞的21.34%和35.76%,两者分别比较,差异有统计学意义(P<0.05).在5-FC(1 mmol/L)+GCV(1 μg/ml)作用48 h后,3AO-pcDNA3-casp3+pBTdel-279-CD-TK细胞中的caspase-3活性值为189.7,高于3AO-pcDNA3+pBTdel-279-CD-TK细胞的44.9,两者比较,差异有统计学意义(P<0.05).结论procaspase-3可显著增强CD-TK/5-FC+GCV系统对人卵巢癌细胞的杀伤作用.
关键词： 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 胞嘧啶脱氨酶 胸苷激酶 基因疗法 卵巢肿瘤 -
胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶基因治疗联合放疗对裸鼠子宫颈癌移植瘤生长抑制作用的研究
目的探讨胞嘧啶脱氨酶(CD)/5-氟胞嘧啶(5-FC)基因治疗联合放疗对裸鼠宫颈癌移植瘤的生长抑制作用,以及CD/5-FC基因治疗与放疗之间是否具有协同作用.方法将24只鼠龄6～8周成功接种了HeLa细胞的BALB/C雌性裸鼠,随机分为对照组、基因治疗组、放疗组以及联合治疗组,每组6只,观察各组治疗前后的肿瘤体积、肿瘤生长抑制率及肿瘤体积增加倍数.结果(1)治疗21 d后,基因治疗组裸鼠的肿瘤体积是(728±201)mm3,联合治疗组是(357±113)mm3,放疗组是(739±419)mm3,对照组是(1168±380)mm3,基因治疗组、联合治疗组、放疗组肿瘤体积均小于对照组,3组分别与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05);联合治疗组肿瘤体积小于基因治疗组及放疗组,前者分别与后两组比较,差异有统计学意义(P<0.05).(2)放疗组的肿瘤生长抑制率为36.74%,基因治疗组为37.66%,联合治疗组为69.45%,联合治疗组明显高于放疗组及基因治疗组,前者分别与后两组比较,差异有统计学意义(P<0.05).(3)联合治疗组平均肿瘤体积增加倍数为7.71倍,基因治疗组为19.16倍,放疗组为18.86倍,对照组为40.57倍.析因设计的方差分析结果,CD/5-FC基因治疗与放疗之间有交互作用(P=0.03),当与放疗联合使用时,CD/5-FC基因治疗的疗效大于其单独使用时所产生的疗效;当与CD/5-FC基因治疗联合应用时,放疗的疗效大于其单独使用时所产生的疗效.结论 CD/5-FC基因治疗与放疗联合应用,对裸鼠宫颈癌移植瘤的生长具有抑制作用,并且两者之间具有协同作用.
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胞嘧啶转氨酶基因联合5-氟胞嘧啶对喉癌细胞的抑制作用
目的 研究腺病毒载体(Ad)介导的胞嘧啶转氨酶(CD)基因转移联合5-氟胞嘧啶(5-FC)对喉鳞状细胞癌(简称喉癌)细胞株Hep-2的体外作用.方法 将构建的含CD基因的重组腺病毒载体在293细胞中扩增,体外感染喉癌细胞株Hep-2,并给予不同浓度前药5-FC进行肿瘤细胞体外杀伤效果观察.结果 用制备的Ad-CD液感染Hep-2细胞,加入不同浓度的前药5-FC,肿瘤细胞生长受到不同程度的抑制.结论 Ad介导的CD基因转染效果强,可直接杀伤喉癌细胞Hep-2.
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胞嘧啶脱氨酶尿嘧啶-磷酸核糖基转移酶融合基因/5-氟胞嘧啶治疗鼻咽癌的实验研究
目的 研究胞嘧啶脱氨酶-尿嘧啶磷酸核糖基转移酶融合基因/5-氟胞嘧啶(fusion cytosine deaminaseuracil phosphoribosyl transferase gene/5-Flurocytosine,FCU/5-FC)对鼻咽癌CNE-2细胞的杀伤效应以及对鼻咽癌移植瘤生长的抑制作用.方法 构建表达质粒载体pcDNA3.1(-)CMVe·Egr-1·FCU,BamHⅠ酶切鉴定重组质粒,分析FCU基因和融合启动子CMVe·Egr-1的序列.电穿孔法将重组质粒转染CNE-2细胞,300 μg/ml～600 μg/mlG41 8筛选1 4天获得稳定表达FCU基因的CN E-2细胞,RT-PCR鉴定FCU基因的表达.以转染空白载体pcDNA3.1(-)的CNE-2细胞为对照,MTT法观察5-FC对表达FCU基因的CNE-2细胞生长的抑制作用,考察FCU基因的细胞旁杀效应.5×106的CNE-2细胞接种裸鼠右腋下,建立鼻咽癌裸鼠移植瘤模型,12天后将裸鼠随机分成3组:CU组,CU+PBS组和CU+5-FC组,观察不同处理对移植瘤生长的抑制作用.结果 酶切和序列分析证明重组质粒含完整的FCU基因和Egr-1启动子的核心序列,RT-PCR从转染细胞总RNA中扩出330bp的预期片段.表达FCU基因的CNE-2细胞在5-FC干预下,生长受到抑制.随着表达FCU基因的细胞比例增加,细胞存活率相应地下降.CU组,CU+PBS组移植瘤体积与CU+5-FC组有显著性差异(P＜0.05).结论 表达FCU基因的CNE-2细胞可以被5-FC杀伤,FCU/5-FC系统抑制了移植瘤生长,为治疗鼻咽癌提供了新的策略.
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PWZL质粒介导的双自杀基因前药系统对人晶状体上皮细胞杀伤作用的研究
目的 探讨PWZL质粒介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(TK)和大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因(CD)双自杀基因系统在前体药物作用下对人晶状体上皮细胞(LEC)的杀伤效应.方法 为实验研究.以PWZL质粒为载体将双自杀基因转入体外培养的LEC,然后使用不同浓度的前体药物5-氟胞嘧啶(5-FC)(20、40、60、80 mg/L)和(或)丙氧鸟苷(0.1、1.0、10、50、100 mg/L)作用于CD-TK基因转染的细胞,光镜下观察细胞生长情况,四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法计算细胞存活率,统计各组细胞的存活率差别,并进行旁观者效应分析.实验所得细胞生存数值采用独立样本t检验,组间比较采用X2检验.结果 经PCR和半定量分析检测,CD-TK基因在LEC中可获得稳定表达;仅行CD-TK基因转染组与空白对照组细胞生存率差异无统计学意义,各使用前体药物组细胞生存率随时间延长呈逐渐下降趋势,观察期末,GCV 10 mg/L+5-FC 60 mg/L组、GCV 10 ms/L+5-FC 100ms/L组、GCV 100 ms/L+5-Fc 100 ms/L组细胞生存率低,此3组间经卡方检验差异无统计学意义(X2=1.25,P>0.01);旁观者效应分析表明,GCV 100 mg/L+5-FC 1130 mg/L组、GCV 10 mg/L+5-FC 60 mg/L组细胞存活率明显低于对照组(t=10.26,13.16;P<0.01).结论 PWZL质粒可成功、有效地将CD-TK基因转入人LEC并能获得稳定表达;双自杀基因前体药物系统对人LEC具有杀伤作用;联合用药可提高杀伤力、减少前体药物使用量.
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CD/5-FC自杀基因系统治疗胰腺癌的实验研究
为探讨自杀基因CD/5-FC系统对胰腺癌的杀伤作用及作用机制,应用细菌内同源重组法构建含大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(cytosine deaminase, CD)基因的腺病毒载体,经293细胞包装、扩增,氯化铯密度梯度离心制备纯化CD腺病毒液,体外转染人胰腺癌细胞,并给予前药5-FC,观察其体外杀伤效果;并建立胰腺癌裸鼠皮下移植瘤模型,瘤内直接注入CD腺病毒液,随后腹腔内注入5-FC,观察CD基因的原位治疗效应.含CD基因腺病毒载体经酶切鉴定正确,包装纯化后,检测病毒滴度为2×1011pfu/ml,将重组腺病毒转染胰腺癌细胞株后,可见 5-FC对转导入CD基因的胰腺癌细胞有明显细胞毒性作用,而对未导入CD基因的人胰腺癌细胞毒性较低,体内实验显示CD基因原位转导对裸鼠胰腺癌疗效较明显.腺病毒介导CD基因,不仅转染效果强,而且加用5-FC后,可直接或通过旁观者效应杀伤胰腺癌细胞或抑制移植瘤的生长,可作为胰腺癌基因治疗的有效方法.
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新型聚酰胺-胺型大分子介导融合自杀基因促肿瘤细胞凋亡的研究
本研究证明了一种以季戊四醇衍生物为核的新型聚酰胺-胺型树状大分子(G5 PD dendrimer)可以有效介导融合胞嘧啶脱氨酶(cytosine deamniase,CD)自杀基因在多种肿瘤细胞内表达并诱导其发生凋亡.通过研究G5 PD dendrimer与融合基因形成复合物的性质,筛选出优处方对肿瘤细胞进行转染,并观察自杀基因促肿瘤细胞凋亡的作用.结果显示,G5 PD dendrimer和质粒的佳复合比为0.2∶1,复合物的粒径为(100±5) nm.实验中,以G5 PD dendrimer和质粒按质量比1∶1形成的复合物分别对3种肿瘤细胞进行转染,其效果均高于商用转染试剂.抑制肿瘤细胞增殖实验发现转染了CD基因的细胞可以在很短的时间内将少量5-氟胞嘧啶(5-FC)高效地转化为氟尿嘧啶(5-FU)并抑制癌细胞增殖,而且该结果也呈现出一定的细胞选择性.上述结果表明,该类新型的CD/5-FC自杀基因传递系统具有较好的应用前景.
关键词： 聚酰胺-胺型树枝状大分子 胞嘧啶脱氨酶 自杀基因 基因传递
