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系列截短和缺失的hTERT启动子报告载体的构建及活性验证
目的 构建系列截短及缺失的hTERT启动子荧光素酶报告载体并验证其活性.方法 PCR扩增系列截短及缺失的hTERT启动子基因,克隆人pGL3-Basic质粒,构建荧光素酶报告载体.分别与pRL-TK内参照质粒共转染HepG2和COS-7细胞,48h后裂解细胞,双荧光素酶分析法检测启动子的活性.结果 成功构建系列截短及缺失的hTERT启动子报告载体,分别命名为pGL3B-895、pGL3B-371、pGL3B-DELS2、pGL3B-349、pGL3B-329、pGL3B-318、pGL3B-306.双荧光素酶报告基因检测结果显示在肝癌细胞和工程细胞中上述报告载体均具有启动子活性.结论 成功构建具有启动子活性的系列截短及缺失的hTERT启动子荧光素酶报告载体,为进一步探讨肝癌发生中人端粒酶逆转录酶表达调控机制提供必要的实验材料.
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核孔复合体相互作用蛋白(NPIP)对乙型肝炎病毒核心启动子转录活性的调节作用
目的:构建HBV核心启动子及NPIP的重组载体,研究NPIP对核心启动子表达的调节作用.方法:根据HBV核心启动子及NPIP的序列设计引物,用聚合酶链反应(PCR)的方法分别扩增HBV核心启动子和NPIP基因,分别构建HBV核心启动子的报告载体及NPIP的真核表达载体,脂质体法瞬时转染HepG2细胞.结果:成功构建HBV核心启动子的报告载体及NPIP的真核表达载体.脂质体法瞬时转染HepG2细胞48 h后,用ELISA法检测β-gal的表达,显示核心启动子在NPIP的影响下,其活性有降低3-4倍.通过体内实验证明NPIP可以下调HBV核心启动子的表达.结论:NPIP明显降低HBV核心启动子的表达,为进一步研究HBV复制的分子生物学机制提供了新的线索.
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乙型肝炎病毒X蛋白上调前-X基因启动子表达活性
目的:研究乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBxAg)对前-X基因启动子的调节作用,研究HBxAg在HBV致病的分子生物学机制中的作用.方法:应用聚合酶链反应(PCR)扩增HBV前X基因启动子,以T-A克隆法,将前-X基因启动子(promoter)的基因片段连入载体pGEM-T.将获得的质粒pGEMT-前-X-promoter与报告质粒pCAT3-basic分别用KpnⅠ和BglⅡ双酶切后构建前-X启动子报告基因表达载体pCAT3-前-X-promoter,以重组表达质粒pCAT3-前-X-promoter分别与pcDNA3.1空载体和HBxAg表达载体pcDNA-HBxAg瞬时转染HepG2细胞,以转染pCAT3 basic的HepG2细胞为阴性对照,48 h后收获细胞.用酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞中氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性,以了解HBxAg对前X基因启动子的调节作用.结果:构建的报告载体pCAT3-前-X-promoter经过序列分析和酶切鉴定正确.真核表达载体pcDNA3.1(-)-X和pCAT3-前-X-promoter共转染的HepG2细胞的CAT表达活性是CAT3启动子的3.12倍,是pCAT3-前-X-pro-moter的2.65倍,是pCAT3-3.1空载体和pCAT3-前-X-promoter共转染的2.28倍.结论:HBxAg可以上调乙型肝炎病毒基因组中前-X基因启动子的活性.
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丙型肝炎病毒核心蛋白上调细胞周期调节蛋白Wee1基因表达研究
目的:了解丙型肝炎病毒核心蛋白和细胞周期调节蛋白Wee1基因表达的关系,研究HCV核心蛋白在HCV致病的分子生物学机制中的作用.方法:应用聚合酶链反应(PCR)扩增Wee1基因启动子,命名为Weep.以T-A克隆法,将Weep基因片段连入载体pGEM-T.将获得的质粒pT-Weep,与报告质粒pCAT3-basic分别用KpnI和XhoI双酶切后构建Weel启动子报告载体pCAT3-Weep,分别以重组报告载体pCAT3-Weep和pcDNA3.1(-)-core瞬时转染HepG2细胞,以转染pCAT3basic的HepG2细胞为阴性对照,48 h后收获细胞.应用酶联免疫黏附方法(ELISA)检测细胞中氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性,以了解HCV核心蛋白对Wee1基因启动子的反式激活作用.结果:构建的表达载体pcDNA3.1(-)-core和报告载体pCAT3-Weep经过序列分析和酶切鉴定正确.pCAT3-Weep和pcDNA3.1(-)-core瞬时转染的HepG2细胞的CAT表达活性是CAT3空载体的3.4倍,pCAT3-Weep的2.3倍.结论:丙型肝炎病毒核心蛋白可反式激活Wee1基因启动子,进而上调细胞周期调节基因Wee1的表达.
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丙型肝炎病毒核心蛋白上调NIP3基因表达研究
目的:了解丙型肝炎病毒核心蛋白和NIP3基因的表达的关系,研究HCV核心蛋白在HCV致病的分子生物学机制中的作用.方法:聚合酶链反应(PCR)扩增NIP3基因启动子,以T-A克隆法,将NIPP基因片段连入载体pGEM-T.获得的质粒pT-NIPP,和报告质粒pCAT3-basic分别用SacI和Bg1Ⅱ双酶切后构建报告载体pCAT3-NIPP,分别以重组报告载体pCAT3-NIPP和pcDNA3.1(-)-core应用FuGENE 6转染试剂瞬时转染NIH3T3细胞,以转染pCAT3 basic的HepG2细胞为阴性对照,48 h后收获细胞.应用酶联免疫黏附方法(ELISA)检测细胞中氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性,以了解HCV核心蛋白对NIP3基因启动子的反式激活作用.结果:构建的表达载体pcDNA3.1(-)-core和报告载体pCAT3-NIPP经过序列分析和酶切鉴定正确.pCAT3-NIPP和pcDNA3.1(-)-core瞬时转染的NIH3T3细胞中的CAT表达活性为pCAT3-NIPP的1.9倍,是pCAT3 basic的3.6倍,明显升高.结论:丙型肝炎病毒核心蛋白可反式激活NIP3基因启动子,进而上调NIP3基因的表达.
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丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3上调硫氧还蛋白还原酶1基因的表达
目的:探讨丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS3对硫氧还蛋白还原酶1(TXNRD1)启动子转录的激活作用.方法:以HCV非结构蛋白NS3反式调节基因的基因表达谱芯片结果为基础,利用生物信息学技术确定TXNRDl的启动子区域(TXNRDlp),聚合酶链反应(PCR)扩增TXNRDlp,克隆至真核报告载体pCAT3-Basic中,构建pCAT3-TXNRD1p报告载体;以该质粒转染肝癌细胞系HepG2细胞系,用酶联免疫黏附法(ELISA)检测氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性;并与pcDNA3.1(-)-NS3共转染HepG2细胞系,用ELISA法检测CAT的表达活性.结果:成功获得TXNRDl启动子的正确克隆.CAT3-TXNRDlp和pcDNA3.1(-)-NS3瞬时转染的HepG2细胞的CAT表达活性是pCAT3-Basic空载体的9倍,pCAT3-TXNRDlp的2.0倍,进一步验证了利用基因表达谱技术研究HCV NS3蛋白反式激活作用的结果.结论:TXNRD1启动子有顺式激活下游基因的活性;HCV的NS3蛋白具有对TXNRD1的反式激活作用.
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羧肽酶N调节乙型肝炎病毒核心启动子表达活性的研究
目的:乙型肝炎病毒(HBV)的感染,不仅引起急、慢性病毒性肝炎,而且与肝纤维化、肝细胞癌的发生发展密切相关.为深入研究HBV调节表达的机制,我们应用噬菌体展示技术,以HBV核心启动子DNA片段为固相支持物,筛选肝细胞cDNA文库,获得HBV核心启动子的肝细胞结合蛋白-羧肽酶N(CPN).CPN是一种从多肽和蛋白质C端氨基酸残基分离的血浆金属蛋白酶,他在调节激肽和过敏毒素的生物活性上起关键作用.CPN是分子量280 kD的四聚体,包含两个50KD酶性亚单位和两个83 kD调节亚单位.核心启动子产生两个3.5kb RNA:前-核心和前基因组RNA.前-核心RNA编码前-核心蛋白和e抗原,前基因组RNA不仅作为mRNA编码核心蛋白和聚合酶蛋白,而且与病毒蛋白一起包埋入核衣壳,作为模板逆转录.前基因组RNA的表达调控在病毒复制周期中起着关键作用.核心启动子分为两部分:基本核心启动子和核心上游调节元件(CURS),其上游为负性调节元件(NER,1616-1621 nt).CPD在体内与HBV核心启动子结合的作用还不清楚,我们分别构建HBV核心启动子及羧肽酶N的重组载体,通过脂质体转染NIH 3T3细胞,研究CPN对核心启动子的调节表达.方法:根据HBV核心启动子及羧肽酶N的序列设计引物,在核心启动子的引物两端引入MIu Ⅰ和Nhe Ⅰ的酶切位点,在羧肽酶N的引物两端引入EcoR Ⅰ和BamHⅠ的酶切位点.用聚合酶链反应(PCR)的方法分别扩增HBV核心启动子和羧肽酶N基因,克隆到pGEM-Teasy载体上.核心启动子经MIu Ⅰ和Nhe Ⅰ双酶切回收连接到同样酶切的pCAT载体上,羧肽酶N经EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切回收连接到同样酶切的pcDNA3.1(-)质粒上,构建HBV核心启动子的报告载体及羧肽酶N的真核表达载体,脂质体法瞬时转染NIH 3T3细胞.结果:HBV核心启动子和羧肽酶N(CPN)的PCR产物经1%琼脂糖电泳鉴定与预期大小符合,分别为206 bp和580 bp.重组载体经双酶切鉴定后,证明HBV核心启动子的报告载体及羧肽酶N(CPN)的真核表达载体构建成功.脂质体法瞬时转染NIH 3T3细胞48 h后,用ELISA法检测β-gal的表达,显示核心启动子在羧肽酶N(CPN)的影响下,其活性有大约5-6倍的增加.通过体内实验证明羧肽酶N(CPN)可以上调HBV核心启动子的表达.结论:HBV核心启动子结合蛋白羧肽酶N(CPN)与HBV核心启动子共转染细胞,明显调节HBV核心启动子的表达,为进一步研究HBV复制的分子生物学机制提供了新的理论基础.
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丙型肝炎病毒NS5A蛋白上调NS3TP6基因启动子表达活性的研究
目的:探讨丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)对NS3TP6启动子转录的激活作用.方法:以我实验室前期研究中得到的HCV NS5A/NS3的基因表达谱芯片结果为基础,利用生物信息学技术确定NS3TP6的启动子区域(NS3TP6-p),聚合酶链反应(PCR)扩增NS3TP6-p,克隆至真核报告载体pCAT3中,构建pCAT3-NS3TP6-p报告载体;以该质粒转染肝癌细胞系HepG2细胞系,用酶联免疫黏附法(ELISA)检测氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性;并与pcDNA3.1(-)-NS5A共转染HepG2细胞系,用ELISA法检测CAT的表达活性.结果:限制性内切酶消化和序列分析结果表明,构建的NS3TP6-p指导的报告基因表达载体pCAT3-NS3TP6-p正确无误.pCAT3-NS3TP6-p在HepG2细胞中能够启动CAT的表达;共转染实验中pCAT3-NS3TP6-p+pcDNA3.1(-)-NS5A组CAT的表达活性是pCAT3-NS3TP6-p单独转染试验的1.87倍.结论:我室克隆的NS3TP6启动子有指导下游基因转录表达的活性;HCV的NS5A蛋白具有对NS3TP6基因启动子的转录具有反式激活作用.本实验进一步验证了我室利用基因表达谱技术研究HCV NS5A蛋白反式激活作用的结果,为进一步阐明丙型肝炎病毒非结构蛋白5A的反式激活作用及免疫调节机制提供了新的依据.
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人SMYD3基因启动子荧光素酶报告载体的构建与分析
目的:克隆5'长度不同的SMYD3基因启动子序列并进行活性鉴定.方法:采用PCR方法克隆出SMYD3基因转录起始位点上游不同长度的基因片段,构建T载体并利用酶切与测序进行鉴定;将该基因亚克隆至pGL3-Basic荧光报告基因载体上;瞬时转染Hep3B细胞后用双荧光报告检测系统检测不同片段的荧光活性.结果:T载体酶切与测序结果正确,成功构建了pGL3-Basic+370～1 400 bp荧光报告载体并利用双荧光素酶报告基因检测系统分析了重组质粒的荧光活性.结论:pGL3-Basic+370～1 400 bp重组质粒转染组与阳性对照组相比并未表现出显著的荧光活性,本研究认为SMYD3基因的启动子核心区域位于-1 334 bp的上游.
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人PDLIM4基因启动子报告基因载体的构建及其在人类肿瘤细胞中的表达
目的 构建人PDLIM4基因启动子荧光素酶报告基因重组质粒pGL3-promoter,检测其在不同肿瘤细胞中的表达.方法 据Genebank中人PDLIM4基因启动子序列分别设计上下游引物,扩增其启动子片段,并插入到pGL3-Basic报告基因载体,分别得到含有3kb和1.2kb的PDLIM4基因启动子的两个报告基因质粒pGL3-PD-LIM4-3kb和pGL3-PDLIM4-1.2kb.序列为1.2kb的启动子利用Erase-a-base试剂盒,经外切酶Ⅲ从5'端逐步酶切得到5个含不同长度启动子序列的报告基因载体:pGL3-PDLIM4-1.2D1、pGL3-PDLIM4-1.2D2、pGL3-PDLIM4-1.2D3、pGL3-PDLIM4-1.2D4、pGL3-PDLIM4-1.2D5.将构建的报告基因载体分别瞬时转染以下细胞株:Heh、MDA-MB231、KB、PC-3、LNCaP,检测其荧光素酶表达活性.结果 所构建质粒经酶切、测序鉴定,其片段长度及序列均正确.转染结果显示,长片段的3kb和1.2kb启动子序列在所测试的细胞株中均有表达,但在人激素非依赖前列腺癌PC-3细胞株、人激素依赖前列腺癌LINCaP细胞株中表达较低.而不同长度的启动子报告基因质粒转染PC-3、LNCaP的结果显示,pGL3-PDLIM4-1.2kb表达活性强,pGL3-PDLIM4-970bp表达活性弱.结论 成功构建了7个分别含有不同长度的PDLIM4启动子报告基因载体,其在不同的肿瘤细胞株中均有不同程度的表达,而在前列腺癌细胞中表达较低.
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肝细胞癌高表达基因TPT1真核报告表达载体的构建及鉴定
目的构建TPT1真核报告表达载体pEGFP-N3TPT1,为进一步研究其功能奠定基础.方法通过PCR和酶切的方法获取具有黏性末端的TPT1基因的全长开放读码框,将其定向连入真核表达载体pEGFP-N3绿色荧光报告基因的氨基侧,构成pEGFP-N3TPT1的真核报告表达载体,通过酶切和测序鉴定TPT1的正确插入.结果酶切和测序均证实TPT1正确插入了真核报告表达载体pEGFP-N3TPT1中.结论成功构建了TPT1的真核报告表达载体pEGFP-N3TPT1.
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CXCR4启动子报告载体的构建
目的：构建并鉴定含人 CXCR4基因启动子的荧光素酶的报告载体。方法采用克隆人 CXCR4基因启动子的序列，构建报告载体 PgL4.17-CXCR4，以其转染 Jurkat 细胞，然后测定荧光素酶的活性。结果扩增得到的 CXCR4启动子序列与克隆人 PgL4.17-CXCR4的 CXCR4启动子序列和 GenBank 报道的一致。实验组荧光素酶的表达活性是874809.0200±39510.6246，与空白组的465.9000±26.2501和对照组的37981.9800±2384.3412总体比较差异有统计学意义（F =4678.919，P <0.001）。结论按照本实验方案，含人 CXCR4基因启动子的荧光素酶的 PgL4.17-CXCR4报告载体被成功构建。
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人核心结合因子基因P2启动子区报告基因载体的构建及鉴定
目的 构建含核心结合因子(RUNX2)基因P2启动子区的荧光素酶报告基因载体,在人主动脉瓣瓣膜间质细胞中检测其活性,并观察骨形态发生蛋白-7(BMP-7)对RUNX2启动子活性的影响.方法 以人基因组DNA为模板,利用聚合酶链反应(PCR)技术扩增人RUNX2基因P2启动子区域,扩增产物经Kpn Ⅰ和Nhe Ⅰ双酶切后插入到pGL3-Basic中,重组质粒pGL3-RUNX2-P2经测序正确后转染人主动脉瓣瓣膜间质细胞,并以BMP-7处理细胞,检测荧光素酶活性变化.结果 将RUNX2基因P2启动子区域1.5 kbp大小基因片段克隆入pGL3-Basic中,测序结果表明序列正确.转染pGL3-RUNX2-P2的瓣膜间质细胞中荧光素酶活性较转染空载体pGL3-Basic组明显增加(0.273±0.032比0.028±0.005,P＜0.05).BMP-7可增强RUNX2启动活性(0.474±0.059比0.273±0.032,P＜0.05).结论 成功构建含有人RUNX2基因P2启动子区的荧光素酶报告基因载体,BMP-7可通过增强RUNX2启动子活性调控其表达.
关键词： 人特异性核转录因子基因 骨形态发生蛋白-7 荧光素酶 报告载体 -
应用Gibson Assembly法快速构建人组蛋白甲基化转移酶启动子荧光素酶报告载体
目的：快速构建人组蛋白甲基转移酶(enhancer of zeste homolog 2，EZH2)启动子荧光素酶报告载体并验证其活性。方法：因EZH2启动子富含GC，故应用Gibson Assembly方法设计分两段扩增，然后将片段一步法连入pGL3-Basic质粒，构建荧光素酶报告载体，进行酶切鉴定。与pRL-TK内参照质粒共转染C4-2细胞，双荧光素酶分析法检测启动子的活性。结果：经酶切鉴定证实成功构建了EZH2启动子报告载体，双荧光索酶报告基因检测结果显示构建的报告载体具有启动子活性。结论：快速成功构建了具有启动子活性的EZH2启动子荧光素酶报告载体，为进一步研究前列腺癌中EZH2表达调控机制提供必要的实验材料。
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小鼠Omi／HtrA2基因启动子萤光素酶报告载体的构建及转录活性分析
目的：通过构建小鼠Omi／HtrA2基因启动子萤光素酶报告载体并进行转录活性分析，深入研究小鼠Omi／HtrA2转录调控发生的机制。方法：本实验构建覆盖小鼠Omi／HtrA2基因5’侧翼区（－1205 bp～＋93 bp）区域的一系列启动子萤光素酶报告基因载体，将其转染至小鼠成纤维细胞NIH3T3、大鼠心肌细胞H9c2和人胚肾细胞HEK293，并进行萤光素酶活性检测。结果：小鼠Omi／HtrA2启动子在－1205 bp～－838 bp和－146 bp～＋93 bp区域活性高，生物信息学分析这些启动子区域可能存在HSF1、SP1、AP、p53等转录因子结合位点。结论：初步证实－1205 bp～－838 bp和－146 bp～＋93 bp区域为CFL2启动子的活性区域。
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pCDM8-GFP报告载体的构建及鉴定
实验资料 pDM8-PBL cDNA文库由Jackson博士惠赠,pEGFP-N3真核表达载体购自Clontech公司.Not I、Hind Ⅲ和T4 DNA连接酶购自大连宝生物公司.COS7细胞为本室冻存.pCDM8-GFP载体的构建方法参照文献.提取pCDM8-X(X表示载体中插入的未知cDNA片段)和pEGFP-N3质粒,分别用Not I和Hind Ⅲ进行双酶切,回收酶切片段,用T4连接酶进行连接,转化感受态宿主菌.挑单菌落培养,提取质粒用Not I和Hind Ⅲ双酶切进行阳性克隆鉴定.提取重组pCDM8-GFP载体,用DEAE-dextran方法转染COS7细胞后,继续培养48 h,然后于荧光显微镜下进行观察,并照像.从连接产物转化宿主菌中提取质粒DNA,经Not I和Hind Ⅲ双酶切后,发现重组载体pCDM8-GFP在大小约700 bp处有一条带,与GFP cDNA片段的大小一致(图1).pCDM8-GFP报告载体在COS7细胞中的表达 pCDM8-GFP转染COS7细胞培养48 h后,在荧光显微镜下观察到具有很强绿色荧光的细胞(图2),表明GFP在COS7细胞中得到表达.
