重组尿素酶B亚单位和黏附素双价疫苗对幽门螺杆菌SS1株感染BALB/c小鼠的免疫保护作用

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)是人慢性胃炎和胃溃疡的病原菌,并与胃腺癌和胃淋巴瘤的发生有密切关系.接种疫苗是预防Hp感染和控制Hp感染相关疾病为有效的措施,但目前仍无Hp疫苗上市.Hp尿素酶B亚单位(UreB)和黏附素(HpaA)几乎存在于所有Hp临床菌株表面,高度保守且抗原性强.大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)及其A亚单位的突变体(LTKA63)和霍乱肠毒素B亚单位(CTB)有较强的免疫佐剂作用.

血吸虫重组卡介苗--Sj26GST疫苗的有关毒性研究

由于BCG免疫效果不够理想,以及结核分枝杆菌耐药性的产生,促使人们开始研制新的结核病疫苗.利用BCG独特的安全性和免疫佐剂作用和日本血吸虫中相对分子量为26×103的谷光甘肽S转移酶(Sj26GST)的良好免疫原性,已经构建出了一种重组卡介苗--Sj26GST(rBG-Sj26GST).我们就这种疫苗对小鼠的毒性进行了研究,从而为疫苗的安全性提供实验依据.

人参皂甙Rg1对HPV16 L2 E6 E7融合蛋白疫苗的免疫佐剂作用研究

宫颈癌( cervical carcinoma)是威胁女性健康的第二大恶性肿瘤,其危害程度仅次于乳腺癌[1]。据国际癌症中心( In-ternational Agency for Research on Cancer,IARC)统计,全球每年宫颈癌的新发病例约为49.3万,死亡人数约为27.4万。Papovaviridae科的人乳头瘤病毒( human papillomaviruses, HPV)感染是导致宫颈癌发生的重要原因[2],目前已发现它有170多种亚型,而75%以上的宫颈癌患者感染了16、18、31和45型的HPV病毒。国际上正在积极研究防治宫颈癌的疫苗,目前已有3种预防性疫苗问世。 HPV16 L2E6E7融合蛋白疫苗是针对HPV16病毒感染后E6E7癌基因引起的宫颈上皮内瘤样病变的一种治疗性疫苗,目前正在申报国家食品药品监督管理局药审中心( CDE )临床试验(受理号CXSL1200006)。像其他蛋白抗原一样,该疫苗尚存在免疫原性差的缺点。为提高该疫苗的免疫效果,本研究在HPV疫苗中添加人参皂甙Rg1,研究Rg1对HPV疫苗的佐剂作用。

凋亡素在人体消化道肿瘤中的作用

细胞凋亡是细胞在其基因的调控下有序的死亡方式,是生物细胞的一种生理性死亡过程,对于维持整个机体的正常生理过程、保证个体正常发育起着重要作用.一旦细胞的增生和/或凋亡异常,均可导致细胞的恶性转化.凋亡素(VP3)来源于鸡贫血病毒,由366 bp组成,编码121个氨基酸序列的小分子物质,能够特异性诱导肿瘤细胞的凋亡,不依赖于p53,同时Bcl-2不仅不能抑制其活性,而且具有加速VP3诱导凋亡的作用,令人兴奋的是VP3对正常的人和鼠的二倍体细胞无任何毒副作用,其原因在于VP3特异性的核定位及其磷酸化所致.多种载体(细菌或质粒)具有独特的安全性能和/或免疫佐剂作用,经过分子生物学改造以后,能够表达外源基因并具有生物学活性,可以作为VP3释放系统,利用VP3在正常细胞和肿瘤细胞以及转化细胞中定位的不同以及VP3激酶在肿瘤细胞和正常细胞中表达的差异,对癌前病变或易于癌变的细胞进行检测,对预测肿瘤发生的倾向性和肿瘤的治疗具有重要的意义.因此VP3在抗肿瘤方面具有巨大的潜在优势和广阔的应用前景,对VP3进行深入细致的研究可能为恶性肿瘤的治疗开辟一条新的、有效的、安全的途径.

干扰素对M2e-HBc疫苗鼻内免疫的佐剂作用

目的 研究干扰素对鼻腔黏膜免疫M2e-HBc疫苗的佐剂作用.方法 小鼠经鼻腔黏膜免疫,用流感病毒攻击.测定抗体水平和对小鼠的保护.结果 小鼠可产生局部和系统保护性抗体IgA、IgG,对流感病毒的亚致死性攻击产生完全保护.结论 干扰素对M2e-HBc疫苗鼻内免疫具有较强的免疫佐剂作用.

CpG ODN增强乙肝疫苗在老年小鼠中的免疫应答

目的:探讨CpG ODN对老年小鼠的体液和细胞免疫应答的增强作用.方法:选用老年C57BL/6小鼠,将乙肝疫苗和10 μg、20 μg CpG ODN同时或单独肌注到小鼠体内,两周后以同样剂量加强免疫一次,再过3周后摘除眼球取血,用ELISA方法检测抗HBs IgG抗体和IL-12;无菌取脾脏作HE染色,观察脾脏淋巴细胞变化.结果:10 μg和20 μg CpG ODN与疫苗同时注射组产生的抗体绝对量分别是单独注射疫苗组的3倍和4倍;产生的IL-12水平较对照组有明显升高,且20 μg比10 μg CpG组产生的IL-12水平更高.光镜下各组的脾脏淋巴细胞的变化如下:正常老年鼠组脾脏淋巴细胞较正常青年鼠组明显稀少;老年鼠+10 μg CpG组脾脏淋巴细胞较正常老年鼠组有了明显增加,且细胞核也明显增大;20 μg CpG组增加的更加明显.结论:CpG ODN能增强乙肝疫苗在老年小鼠中的体液和细胞免疫应答.

编码膜结合IL-4或IL-12的质粒可明显增强癌胚抗原DNA疫苗的活性

DNA疫苗可诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和体液免疫应答,是抗肿瘤和预防传染病的一种行之有效的方法.已有实验证明,细胞因子具有增强DNA疫苗免疫应答的佐剂作用,但循环性细胞因子会引起一些不良生理反应,所以此项研究试图利用膜结合表达的方式将细胞因子固定在注射部位,达到既能产生免疫佐剂作用,又不引起明显的不良反应.

150 含CpG基序的合成ODN的佐剂作用将b型流感杆菌结合疫苗转变为有效的抗多糖和抗载体多价疫苗

CpG ODN增强免疫抑制小鼠对乙肝疫苗的免疫应答效果

环磷酰胺是肿瘤治疗中常见的烷化剂,严重影响骨髓、胸腺和脾脏的功能导致患者免疫力低下,容易患各种感染性疾病,疫苗接种成功率也很低,因此,寻找有效疫苗佐剂来提高这群人的疫苗接种成功率具有重要的实际意义.近年来,大量的研究显示细菌DNA中存在非甲基化的CpG二核苷酸序列(即CpG基序)能激活免疫系统,诱导天然免疫应答分泌免疫球蛋白和各种细胞因子.人工合成含CpG基序的脱氧寡核苷酸(CpG ODN)与蛋白疫苗同时接种正常小鼠,能提高抗原特异性免疫应答,诱导出高水平保护性抗体.本实验应用CpG ODN与乙肝疫苗同时肌肉注射到免疫抑制小鼠体内,观察其免疫效应,为临床上出现的免疫抑制人群进行有效疫苗接种提供依据.

恶性疟原虫FCCl/HN株环子蛋白基因在BCG中的表达

卡介苗(BCG)由于其广泛应用的安全性和免疫佐剂作用,因而近年来以BCG为载体的重组疫苗研究日益受到重视[1].环子孢子蛋白(circurmporozoim protein,CSP)分子量为40～60kDa.是一种覆盖于子孢子表面的蛋白,是目前已鉴定的子孢子特异性抗原分子,也是疟疾疫苗候选抗原之一[2].本研究将克隆有CSP基因的重组大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒pBCG/CSP通过电穿孔转化法导人BCG,观察其在BCG中的表达情况.

猪白细胞介素4的基因克隆及其在囊尾蚴DNA疫苗中的应用

目的:克隆猪白细胞介素4(IL-4)cDNA,观察其在抗囊尾蚴免疫中的疫苗佐剂作用.方法:通过RT-PCR法获得带有5′AUG侧翼翻译优化突变序列的猪IL-4 cDNA,测序后重组入真核表达载体pcDNA,在体外瞬时表达的基础上与囊尾蚴保护性抗原DNA疫苗联合免疫仔猪.结果:获得的猪IL-4 cDNA序列与文献报道的完全一致,在体外瞬时表达中获得了有生物学活性的猪IL-4.其与囊尾蚴保护性抗原DNA疫苗联合应用可有效提高个体体液免疫应答水平.结论:构建了一高效表达猪IL-4的真核表达质粒,初步实验证实了其在抗囊尾蚴DNA疫苗中的佐剂效应.

减毒沙门氏菌——真核质粒的导入载体

减毒沙门氏菌可侵入到宿主的Peyer氏集结、肠淋巴结、肝、脾等组织细胞，表达异源抗原，不仅激发出宿主针对伤寒杆菌本身的免疫反应，而且激发出针对其所携带抗原的各种免疫反应，包括局部体液免疫、全身体液免疫和细胞免疫反应，尤其是CTL作用。减毒菌本身可起免疫佐剂作用。由于已减毒，终被宿主清除〔1，2〕。减毒沙门氏菌可通过口服或鼻黏膜〔3〕进行接种，因此，接种方式简单，易于大规模的免疫接种。此外，以减毒沙门氏菌为载体的疫苗制备简单、易于储存和运输、抗原不需提纯，所以可显著降低疫苗的制作成本。因此，减毒沙门氏菌是异源抗原免疫的优良载体。但这方面大量的工作都是将异源抗原基因克隆在原核表达载体上，在减毒沙门氏菌原核环境中进行表达。近年来有实验表明，减毒沙门氏菌可将克隆有异源抗原基因的真核表达质粒携带释放入宿主深部淋巴细胞，使异源抗原基因在淋巴细胞的真核环境中进行表达。因此，减毒沙门氏菌有望成为真核质粒的导入载体，成为核酸疫苗的第三种接种方式，且在本质上不同于核酸疫苗的其他两种接种方式，在核酸疫苗研制中具有新的应用前景。

CpG ODN纳米粒增强免疫抑制小鼠对重组乙肝疫苗的免疫应答

目的:探讨CpG ODN壳聚糖纳米粒联合重组乙肝疫苗对免疫抑制小鼠的免疫增强作用.方法:选用环磷酰胺建立免疫抑制模型小鼠.将乙肝疫苗单独或和CpG ODN或CpG ODN纳米粒经后腿胫骨前肌注射到小鼠体内,ELISA方法检测抗HBsAg IgG抗体、IL-12水平;流式细胞仪检测外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群.结果:CpG ODN纳米粒联合疫苗组的CD4+细胞百分数,IL-12水平及抗HBsAg IgG抗体的含量显著高于CpG ODN联合疫苗组(P＜0.05).结论:包裹在壳聚糖纳米粒中的CpG ODN较相同剂量的CpG ODN更能增强免疫抑制小鼠对乙肝疫苗的免疫应答.

问号赖型钩端螺旋体内鞭毛与外膜基因融合DNA疫苗载体的构建

目的:为增强问号赖型钩端螺旋体(017株钩体)内鞭毛抗原(flaB)与外膜抗原(ompL1)的免疫保护作用,克服保护性免疫持续时间短的难题,应用DNA重组技术以pcDNA 3.1为载体构建-表达flaB与ompL1基因的融合DNA疫苗载体,以期注入肌体后能延长保护期,激发机体长期免疫.在pcDNA3.1载体上,ompL1与flaB前后相连,前者较后者先获得递呈,与钩体天然递呈过程相似,并且双嵌合基因可诱导机体产生针对2个不同抗原表位的抗体,从而增加免疫应答能力.pcDNA3.1载体能表达融合蛋白,并且具有CpG motifs,因而可发挥佐剂作用.方法:提取017株钩体基因组DNA,参照钩体特有的高度保守的flaB与ompL1序列,设计二对四条引物:P1、P2、P3、P4.flaB与ompL1已被证实是两个良好的钩体疫苗候选抗原.通过聚合酶链反应(PCR),P1、P2引物扩增017株钩体的ompL1抗原基因;P3、P4引物扩增钩体的flaB抗原基因,分别经双酶切,以pcDNA3.1载体,将ompL1与flaB顺次同时定向嵌入同一pcDNA3.1中,获得重组质粒(ompL1与flaB),并将其转入JM109宿主菌中.在设计引物时,分别在P2、P3引物中,采用多个结构简单又不易形成折叠的甘氨酸作为接头,以维持其空间构象,不影响自然折叠,保持天然活性.结果:经酶切鉴定证实:有一1.8 kb片段插入载体,进一步经酶切证实这一1.8 kb可被酶切为9.6 kb及8.5 kb的片段,与预期的片段大小一致.以嵌合重组质粒DNA为模板,经PCR证实:P1、P2引物扩增出9.6 kb片段;P3,P4引物扩增出一8.5 kb片段.重组质粒经DNA序列检测,其中ompL1与flaB序列与文献报道的完全一致.结论:表达017钩体flaB与ompL1抗原的融合蛋白的DNA疫苗载体构建成功,从而为下一步表达复合功能蛋白,进行钩体免疫保护性研究打下了基础.

CpG寡脱氧核苷酸增强免疫抑制小鼠对乙肝疫苗的免疫应答

目的: 探讨CpG 寡脱氧核苷酸(ODN)增强免疫抑制小鼠对乙肝疫苗的免疫应答效果.方法: 选用环磷酰胺(CTX)所致免疫抑制模型小鼠, 以乙肝疫苗和20 μg CpG ODN联合或单独左胫前肌肌注免疫C57BL/6小鼠.2 wk后以同样剂量加强免疫1次, 再过3 wk后摘除眼球取血, 用ELISA法检测抗-HBs IgG抗体和IL-12的水平.同时, 无菌取脾脏做HE染色, 观察脾脏淋巴细胞的数量和细胞核的变化.结果: CpG ODN与疫苗联合注射组产生的绝对抗体量比单独注射疫苗组提高1倍; 注射组产生IL-12的水平较单独注射疫苗组也有明显升高.光镜下各组脾脏淋巴细胞的变化如下: 正常对照组脾脏可见大量的淋巴细胞; 与正常对照组相比较, CTX组的淋巴细胞明显稀少; 而CTX加CpG组的淋巴细胞数明显增多, 细胞核也明显增大.结论: CpG ODN能增强免疫抑制小鼠对乙肝疫苗的免疫应答.

靶向小衣壳蛋白 L2的具有广泛保护性的VLP 型 HP V疫苗的临床前优化

理想的预防人类乳头瘤病毒（ HPV）疫苗应该具备以下特性，即能够提供广泛的保护性和持久的免疫应答，能够应对所有高危人乳头瘤病毒类型，单一剂量注射后即产生免疫效果，在无需制冷的条件下能够长期保存。基于以上要求，作者已经研制出由噬菌体病毒样颗粒（ VLP s ）组成的HP V候选疫苗，该噬菌体病毒样颗粒具有广泛的HPV16次要衣壳蛋白L2来源的中和表位。免疫接种16L2 VLPs可诱导出高效价、能够引起广泛交叉中和抗体，该中和抗体能够抵抗多种类型的HPV。在该项研究中，作者介绍了两种改进的候选疫苗，以期提高疗效和在发展中国家的临床适用性。首先评估抗原剂量和加强免疫对免疫原性的作用。用含明矾或不含明矾的剂量为2～25μg的16L2-MS2 VLPs免疫小鼠，结果显示，各种剂量下16L2-MS2 VLPs均具有高度的免疫原性，且小浓度明矾具有佐剂作用。虽说加强免疫可以提高抗体效价，实际上单一免疫接种也能够引起持续时间较长的强烈抗体应答。作者也研制出一种用于提高疫苗稳定性的方法。使用喷雾干粉设备，以多糖和氨基酸的结合物作为蛋白质的稳定剂，制造出L2 VLP s的干粉型疫苗。喷雾干燥型的L2 VLP s并不影响VLP s再建物的完整性和免疫原性。喷雾干燥型的VLP s在室温下稳定，37℃可以保存一个月以上，且该VLPs具有高免疫原性。总之，这些增强改进措施的目的在于，促进实现下一代以VLP 为基础的HP V 疫苗的制备，强调美国和全球在疫苗经济负担能力方面的差异，并且对疫苗在农村或偏远地区人群中的普及性进行评估。