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细胞移植修复关节软骨缺损的研究进展
关节软骨具有耐用性和维持自身的能力,但成熟软骨对抗外伤和各种疾病的能力是脆弱的,极易引起损伤,加之软骨组织自身修复能力很差,这些损伤往往不能修复,而引起疼痛、运动障碍影响人们的生活和健康.要使修复或再生的软骨能满意的执行功能,恢复滑膜关节正常的无痛运动,新形成的组织在结构、组成、机械性能和持久耐用方面必须和正常关节软骨相似.目前恢复损伤关节软骨的方法有两类:刺激关节软骨自身修复和组织细胞移植.前者包括,清创术和灌洗法、软骨下骨钻孔术、微骨折、截骨术等,这些方法可以减轻疼痛、肿胀等临床症状,但刺激产生的是纤维软骨,缺少正常透明软骨生化和生物机械性能;后者包括软骨移植、骨膜/软骨膜移植、软骨细胞及间充质细胞移植等,不但减轻了症状,而且可以形成透明样软骨修复组织[1].本文就细胞移植修复关节软骨缺损的研究进展进行了综述.
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三种不同方式构建组织工程软骨修复犬膝关节骨软骨缺损对比的实验研究
[目的]通过对比三种不同方式构建的骨软骨复合体修复比格犬膝关节骨软骨缺损的修复情况,探讨构建组织工程化软骨的佳可行性方案.[方法]本研究分别采用体外单体培养、分体培养、生物反应器内分体培养体内构建三种方式构建骨软骨复合体,模仿马赛克移植术植入比格犬膝关节骨软骨缺损处,通过大体观察、组织学分析观察其修复情况.[结果]术后3个月,3种方式构建的骨软骨复合体均不同程度修复了犬关节软骨缺损,采用生物反应器内分体培养体内构建方式修复骨软骨缺损效果优于前两种方式.[结论]灌注型生物反应器使软骨和成骨细胞在三维载体内存活并增殖,提高细胞在载体内的复合效率,软骨修复情况优于前两种方法.
关键词： 骨软骨缺损 β-磷酸三钙(β-TCP) 生物反应器 骨软骨复合体 软骨修复 -
细胞复合β-磷酸三钙生物陶瓷修复软骨缺损的实验研究
[目的]通过将骨髓间充质干细胞(MCSc)诱导的具有软骨细胞、成骨细胞表型的细胞接种到三维多孔β-磷酸三钙(β-TCP)生物陶瓷支架材料上,体外构建骨软骨复合体,探讨以β-TCP为载体建造组织工程化软骨修复骨软骨缺损的可行性.[方法]将β-TCP多孔陶瓷加工成圆柱状,并将其作为构建人工软骨的细胞支架.在支架材料上分别接种从犬骨髓干细胞培养成的具有软骨细胞、成骨细胞表型的细胞,将细胞-支架复合体共同培养1周后.移植到犬关节软骨缺损处.植入后12、16周末取材,进行大体观察、组织学及组织化学等观察.[结果]复合体体内移植后,在犬关节软骨缺损处有新生软骨形成,形成的软骨基本保持了支架材料原有形态.[结论]β-TCP多孔陶瓷可作为支架材料,复合细胞后具有修复软骨缺损的作用.
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真皮多能干细胞复合聚乳酸支架修复关节软骨全层缺损的实验研究
[目的]探讨真皮多能干细胞在软骨缺损修复中的可行性,为扩大软骨缺损修复中种子细胞的选择提供实验依据.[方法]以新生青紫蓝兔为研究对象,机械法直接分离得到真皮组织,采用酶消化法获取细胞,利用干细胞贴壁粘附生长的特性获取高克隆细胞群,并进行传代培养.使细胞浓度达到1×106/ml与聚乳酸支架材料共培养一周后植入兔膝关节软骨全层缺损处,用3～5个月龄青紫蓝兔30只,60个关节,随机分为真皮多能干细胞/聚乳酸支架材料、聚乳酸支架材料、空白对照三组,每组20个关节,于术后12周空气栓塞处死实验兔,对修复组织进行取材,行HE、甲苯胺蓝染色,根据软骨缺损修复情况进行大体、组织学评分,并进行统计学分析,比较各组的评分差异是否具有统计学意义.[结果]大体及组织学观察显示,真皮干细胞/支架材料实验组修复组织表面光滑、呈透明样,与周围软骨及软骨下骨整合良好,而聚乳酸支架材料组有少许透明样软骨,主要以纤维软骨修复,空白对照组则表面有缺损,以纤维软骨修复.大体及组织学观察后进行统计学评分分析,显示A组修复效果优、优于B、C组(P＜0.05),B组优于C组(P＜0.05)[结论]真皮多能干细胞修复关节软骨缺损效果明显,恢复正常关节软骨结构,可作为组织工程化软骨种子细胞之一.
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TGF-β3真核表达载体转染骨髓基质干细胞促进其向软骨分化的实验研究
[目的]构建生长转化因子(TGF-β3)含绿色加强绿色荧光蛋白的真核表达质粒pIRES2-EGFP-TGF-β3,然后用该质粒转染骨髓基质干细胞(Marrow stromal cells,MSCs)并促进MSCs向软骨方向分化.[方法]用RT-PCR法从大鼠的胚胎组织中提取TGF-β3的DNA全长,首先连接到pMDl8-T载体,扩增、纯化后经测序公司测序确定插入目的基因序列的正确性,然后再用带有EcoRI、PstI内切酶的引物,从pMD18-T将TGF-β3的全长再次扩增出来,后将带有酶切位点的TGF-β3的全长插入到真核质粒pIRES2-EGFP中,构建真核表达载体pIRES2-EGFP-TGF-β3.体外培养大鼠MSCs,应用阳性脂质体将pIRES2-EGFP-TGF-β3转染到MSCs中,24 h后在荧光显微镜下观察蛋白的表达,流式检测MSCs的转染效率;Westen Blot检测TGF-β3蛋白的表达;之后进行MSCs细胞球团培养,分别于第7、14、21、28 d检测软骨基质胶原Ⅱ,胶原Ⅹ和Aggrecan的表达,同时用甲苯胺蓝检测蛋白聚糖(proteoglycan)的表达.[结果]测序结果和酶切鉴定结果表明成功的构建了pIRES2-EGFP-TGF-β3质粒,转染MSCs之后,转染的效率达30%.Westen Blot结果表明TGF-β3获得了成功的表达,在接下来的细胞球团培养过程中,转染后MSCs被成功诱导向软骨分化.
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自体BMSCs复合改建脱细胞真皮基质体内构建组织工程软骨的实验研究
[目的]目的:探讨BMSCs复合脱细胞真皮基质(ADM)三维多孔支架体内构建组织工程软骨的可行性.[方法]首先对支架材料进行大体及扫描电镜观察,分别测定支架的孔隙直径、孔隙率、降解率;其次,分离培养兔骨髓基质细胞(BMSCs),采用扫描电镜及MTT法检测BMSCs在支架材料上的生长、增殖情况;后取3个月龄清洁级新西兰大白兔27只,雌性,体质量(2.4±0.2) kg,随机分为3组,即A组:空白对照组(仅髁部造缺损),B组:单纯ADM覆盖,C组:ADM+ BMSCs,细胞支架复合物体外培养1周后植入兔股骨髁软骨缺损处,分别在4、8、12周后对标本进行组织学、免疫化学检测及ICRS评分.[结果]测量示支架孔隙直径为(101.2±9.3) um,孔隙率为88.6％±2.7％,降解率2周为(13.83±7.12)％,4周为(25.66±8.19)％.MTT法显示细胞在支架上生长良好,与对照组相比,吸光度值差异无统计学意义(P＞0.05),提示支架相容性良好,无细胞毒性.经过长12周培养后取材进行组织学、免疫化学检测,结果显示ADM +BMSCs组软骨缺损获得了更为满意的修复效果:关节表面平坦光滑,与周围组织未见明显界限;组织学染色证实软骨基质分泌旺盛并有典型软骨细胞形成,组织结构类似正常关节软骨,ADM +BMSCs组术后第4、8、12周ICRS评分均高于其他两组,差异具有统计学意义(P＜0.05).[结论] ADM孔隙均匀,组织相容性好,适于细胞粘附及长期生长,是一种适用于软骨组织工程的良好载体.BMSCs-ADM支架复合体在体内成功构建组织工程软骨,可进一步用于软骨组织工程研究.
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关节镜下关节清理扩创微骨折术后配合运动疗法治疗中老年膝骨关节炎临床疗效观察
膝骨关节炎是常见的退行性疾病,可造成关节疼痛、功能障碍,严重影响中老年人群的生活质量,膝关节骨性关节炎的病理核心是软骨缺损.因此通过关节镜下关节清理扩创微骨折(microfracture)技术修复膝关节软骨缺损.修复后软骨由纤维软骨所替代已被组织学证实[1].
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睾酮对膝关节骨关节炎去势雄兔的软骨修复作用
目的 探讨睾酮对膝关节骨关节炎(KOA)睾丸切除(去势)雄兔的软骨修复作用.方法 将18只雄兔采用改良Hulth法建立右侧KOA模型并去势,8周时随机处死6只,确认模型建立成功.将剩余12只兔随机分为观察组和对照组,每组6只.观察组每隔2周肌注十一酸睾酮6 mg/kg,对照组同时肌注等量生理盐水,共8周(4次).分组处理第8、12、16周,采用电化学发光免疫分析法检测血清睾酮;分组处理第16周末处死,取出右股骨髁,肉眼观察标本大体情况,采用免疫组化法检测软骨组织胰岛素样生长因子1(IGF-1)表达,并进行关节软骨Mankin′s评分.结果 两组第8周血清睾酮水平比较差异无统计学意义(P>0.05),观察组第12、16周血清睾酮水平均明显高于对照组(P均<0.05).对照组右膝关节明显肿大,关节软骨面变薄、粗糙,软骨表面色泽变暗,溃疡较深,边缘骨赘形成明显.观察组右膝关节肿大程度轻于对照组,软骨表面有光泽,可见小溃疡和不规则裂隙.观察组软骨组织IGF-1阳性表达率高于对照组,Mankin′s评分低于对照组(P均<0.05).结论 睾酮可促进KOA去势雄兔的软骨修复;其机制可能与促进IGF-1表达有关.
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TGF-β3、DBM联合诱导BMSC修复软骨缺损的实验观察
将兔骨髓基质干细胞(BMSC)和脱钙骨基质(DBM)在体外混合培养21 d后分组,实验组中加入生长转化因子β3(TGF-β3),对照组中不加TGF-β3.分别于7、14、21 d取出DBM块,RT-PCR检测Ⅱ型原骨胶原[COL(Ⅱ)]、X型原骨胶原[COL(X)]和蛋白聚糖(Aggrecan)的表达量;第21天取出的DBM晾干后称重,计算净增长重量.将培养7 d的DBM植入兔的软骨缺损模型中,分别于3、6、9周时处死取材,进行观察.实验组的软骨增加量约为对照组的7倍,COL(Ⅱ)、COL(X)和Aggrecan也明显增加,实验组的软骨修复效果明显好于对照组.认为TGF-β3联合DBM能极大促进BMSC向软骨分化的能力,并显著提高软骨修复能力.
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骨髓基质干细胞和基因强化组织工程修复软骨的实验研究
由于目前应用的移植软骨细胞体外扩增能力较弱,且取材不便,易对供体部位造成损伤,限制了临床应用.因此,寻找能在体外控制性生长的种子细胞成为近年软骨组织工程研究的热点[1].本文就骨髓基质干细胞和基因强化组织工程在软骨修复中的研究进展概述如下.
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开放楔形胫骨高位截骨术后膝关节软骨修复的影响因素研究进展
膝关节骨性关节炎(KOA)是老年患者常见的关节疾病,近年来有年轻化的趋势.随着KOA阶梯性治疗的普及和发展,开放楔形胫骨高位截骨术(OWHTO)已经广泛应用于KOA的临床治疗.KOA经OWHTO治疗虽然具有较高的生存率,但膝关节软骨修复程度不尽相同.术后下肢力线的精确调整可以有效缓解膝关节内侧压力,促进软骨修复;术前关节软骨不同的损伤程度会带来不同的修复结果;另外,股骨内侧髁与胫骨内侧平台的不同解剖、BMI以及膝关节炎症因子水平等均为影响OWHTO术后膝软骨修复的重要原因.因此,认识OWHTO术后膝关节软骨修复的影响因素对完善手术方式并取得更好临床效果有重要意义.
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KGN修复软骨、促进腱-骨愈合作用的研究进展
交叉韧带断裂、肩袖损伤等肌腱损伤是常见的运动损伤,腱-骨连接结构愈合是其治疗关键,但其愈合困难是目前临床一大难题.促进腱-骨愈合是修复肌腱损伤、防止再撕裂的关键,但是目前还没有能有效、持续促进肌腱损伤修复术后腱-骨连接结构恢复的方法.应用各种来源的干细胞及细胞因子等生物治疗方法在促进腱-骨愈合方面受到了广泛关注,其中骨髓间充质干细胞(BMSCs)是研究的热点.小分子化合物Kartogenin(KGN)被发现能够显著诱导BMSCs向软骨分化,具有极强的促进软骨形成和腱-骨愈合作用,且与药物释放系统整合后能更好的发挥效能.本文就KGN修复软骨、促进腱-骨愈合方面的研究作一综述,为临床上促进软骨修复、提高腱-骨损伤的治疗效果提供新思路.
关键词： kartogenin 腱-骨愈合 骨髓间充质干细胞 软骨修复 肌腱损伤 -
一氧化氮对软骨代射的影响
自1991年Stadler[1]首先报道兔关节软骨细胞在细胞因子作用下能产生一氧化氮(nitric oxide NO)以来,人们开始研究NO与关节软骨之间的相互关系.NO是一种新发现的反应性极强的自由基,兼有第二信使的作用,可介导和调节多种生理病理过程.作为关节软骨损伤和基质合成抑制的介质,NO在骨性关节炎(osteoarthritis OA)发病中的作用日益受到重视.研究表明,炎性细胞因子白细胞介素-1β(IL-β)、细菌脂多糖(LPS)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等可增加软骨细胞诱导型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase iNOS)mRNA表达,使NO释放量和一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase NOS)活性增加,进而升高基质胶原酶、金属蛋白酶活性,造成软骨损伤[2].因而,针对关节炎症的致病因子及促进因素加以治疗,阻碍甚至逆转其病变,促进软骨修复将是一种更理想的治疗方法.自1993年Stefanovic阐述NO在关节软骨损伤退变中的作用以来,一系列研究证实NOS抑制剂的应用有助于软骨代谢的恢复.目前认为,抑制iNOSmRNA的表达,以减少NO过量释放是保护关节软骨潜在有效的途径.
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用培养的自体关节软骨细胞移植修复关节软骨缺损
关节软骨大部分是由软骨基质构成,没有血管、淋巴管、神经,也缺乏细胞成分.密度低的软骨细胞高度分化,周围被软骨基质包围,几乎不能分裂,随着年龄的增加,分裂数目会减少.因此,关节软骨缺乏修复能力,关节软骨损伤后也不能用透明软骨修复.近来,开展的镶嵌成形术(mosaic plasty)或采用培养的自体软骨细胞移植等新疗法,引起注目.但其能否被当作一般的治疗方法而被人们所接受,需要看今后的效果.本文就培养的自体软骨细胞移植进行说明.
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骨髓间充质干细胞与软骨修复研究进展
随着细胞学、分子生物学等基础医学的飞速发展和应用,近年来干细胞研究取得了重大进展,并于1999年及2000年连续两次被美国科学杂志评为世界十大科学成果之一,已经成为生命科学领域研究的热点.
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脂肪干细胞联合筋膜干细胞修复大鼠骨性关节炎
目的 探讨联合使用脂肪间充质干细胞和筋膜间充质干细胞治疗大鼠骨性关节炎的效果.方法 从大鼠腹股沟处脂肪垫分离脂肪间充质干细胞、后肢骨骼肌筋膜分离筋膜间充质干细胞,经鉴定后扩增培养,两种细胞按不同比例混合,分为A组(1∶0)、B组(5∶1)、C组(1∶1)、D组(1∶5)、E组(0∶1),F(0∶0)组,总数为1×106,注射进由碘乙酸诱导的大鼠骨性关节炎关节腔内.干细胞注射治疗12周后获取各组大鼠后肢膝关节标本,分别进行大体和病理组织学评估.结果 分离的脂肪间充质干细胞、筋膜间充质干细胞CD29、CD71、CD90阳性表达,CD45阴性表达;均可以进行多向诱导分化;当两种细胞按1:1混合治疗时大体观得分:A组(4.25±0.96)、B组(4.83±1.11)、D组(4.41±0.90)、E组(4.91±0.79)、F组(5.75±1.21)均高于C组(2.92±0.79,P=0.010)、病理组织学评分A组(8.16±1.46)、B组(7.41±1.78)、D组(8.08±1.44)、E组(8.83±1.47)、F组(15.58±2.77)均高于C组(5.83±1.85,P=0.010).结论 脂肪间充质干细胞联合筋膜间充质干细胞关节混合比例为1∶1时,软骨修复效果佳.
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三明治法构建兔间充质干细胞-脱细胞真皮基质定向分化成软骨培养的研究
目的 探索天然的脱细胞真皮基质(ADM)的制备方法；观察ADM的孑孔隙率和生物力学特性；探讨间充质干细胞(MSCs)结合ADM支架材料的生物学特性.方法 选用新西兰兔的皮肤作为原料,切取厚度为500 μm的真皮层,切成1.5 cm×1.5 cm的正方形小块,采用化学、物理和生物综合技术制备ADM支架材料,并对其进行孔隙率和生物力学检测.采用三明治法将MSCs与ADM复合培养并定向诱导分化成软骨,然后分别进行扫描电镜观察、激光扫描共聚焦显微镜观察和成软骨分化检测等分析比较.结果 ADM的孔隙率为80.26％.ADM的拉伸强度为4.52 Mpa.将sC-MSCs种植在ADM上,经过21 d的体外培养,硫酸糖胺聚糖(sGAG)的平均值为(4.6±0.9)μg/mg,与第3天的sGAG值(1.1±0.2)μg/mg比较,差异有统计学意义(P＜0.05).Ⅱ型胶原的含量第21天也比第3天增加[(6.2 ±0.9)μg/mg比(2.4 ±0.6)μg/mg],差异有统计学意义(P＜0.05).扫描电镜观察和激光扫描共聚焦显微镜观察结果显示,ADM为MSCs的增殖和分化提供了充足的空间,MSCs种植在ADM支架中分布均匀,并且长期存活,具有良好的生物细胞相容性.结论 ADM支架材料未发现有细胞毒性,同时具有较为合适的孔隙率,更利于植入细胞的黏附与增殖；在处理过程中,能保持ADM的生物力学性能.用三明治法构建MSCs-ADM具有良好的成软骨定向分化的能力.
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转化生长因子-β1转染兔骨髓基质细胞修复软骨缺损
目的 观察转化生长因子-β1(TGF-β1)基因转染兔骨髓基质细胞(MSCs)复合海藻酸钠凝胶修复兔关节软骨缺损的效果.方法 取兔龄4周龄的新西兰兔骨髓,体外分离纯化培养得到MSCs.选用24只成年新西兰兔,随机分为4组,在两侧股骨髁非负重区造成全层软骨缺损模型,A组(实验组)植入TGF-β1转染的MSCs+藻酸钙,B组(对照组Ⅰ)植入空质粒转染的MSCs+藻酸钙,C组(对照组Ⅱ)植入不含MSCs的藻酸钙,D组(对照组Ⅲ)旷置.于移植后12周取材,观察软骨缺损修复及组织学评价.结果 实验组修复组织基本光滑,有大量Ⅱ型胶原蛋白表达,3个对照组修复组织Ⅱ型胶原蛋白表达量少,仍有明显缺损.实验组与3个对照组12周时O' Driscoll,Keeley and Salter组织形态学评分分别为:实验组为(17.000±1.758)分,对照组Ⅰ为(7.830±1.528)分,对照组Ⅱ为(6.580±1.379)分,对照组Ⅲ为(3.170±1.267)分,组间单因素方差分析比较结果显示,实验组分别与3个对照组两两比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 TGF-β1转染兔MSCs修复软骨缺损效果优于其他对照组.
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血管内皮生长因子对兔软骨修复的影响
已证实血管内皮生长因子(VEGF)可以促进血管的增殖,本实验旨在探讨通过VEGF增加损伤区域的血运,观察其是否可以促进软骨的修复.一、材料与方法24只新西兰大白兔,随机分为2组.静脉麻醉、消毒后,取膝关节外侧入路,暴露股骨滑车负重区的软骨面,制作直径4 mm、深2 mm的全层软骨损伤的模型.实验组关节内注射30 μg VEGF-A混合0.2 ml生理盐水;对照组注射0.5 ml生理盐水.术后3、6和12周随机选取实验组和对照组的4只兔处死,切取标本,进行组织学观察.
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组织工程化骨与软骨复合体构建研究中动物模型的选择
软骨缺乏血管和神经的营养作用,因此受损伤后其再生修复能力很低,现有的修复方法如钻孔术、微骨折术、骨膜以及软骨移植术等虽已取得一定疗效,但均不能满足临床需要,缺损和退变软骨的修复问题仍然是目前临床研究的热点和难点[1].组织工程技术的飞速发展为软骨修复提供了全新的思路和技术方法,与此前单纯组织工程化软骨的构建比较,进行组织工程化骨与软骨复合体的构建与应用研究,由于其具有软骨下骨质的锚定和支撑作用,结合牢固且不易塌陷,而且由于有骨质向表面的营养作用,愈合速度更快、效果更好,可望取得更为良好的修复效果.而其中动物实验是必不可少的关键技术环节[2].
