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组织工程与组织器官缺损修复
创伤、肿瘤等原因造成的组织、器官缺损和功能障碍是危害人类健康的重要原因,而缺损组织、器官的修复和功能重建也是目前临床外科面临的主要难题.大面积的缺损通常都需要采用自体或异体组织、器官移植进行修复,自体移植存在着"以创伤修复创伤"的遗憾,而异体移植中供体来源不足、免疫排斥是主要的缺陷.组织工程学(tissue engineering)的提出、建立和发展,为解决这一难题提供了新的途径,它的基本原理是将少量种子细胞经体外扩增后与生物材料复合,构建出新的组织或器官,用于替代和修复病变、缺损的组织器官,重建生理功能.
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人脐血造血干/祖细胞的生物反应器大规模扩增及移植实验
目的 利用生物反应器大规模扩增人脐血造血干/祖细胞,并通过动物移植实验检验该方法的有效性.方法 采集抗凝脐血10份,分离出单个核细胞(MNC),分别进行生物反应器扩增培养和静态扩增培养.检测扩增前后细胞表面CD34、CD38、CD133、CD184和CD62L分子的表达,并进行造血干/祖细胞集落的培养.取非肥胖糖尿病重症联合免疫缺陷小鼠,以X射线照射后,分为4组,其中MNC组小鼠注射未经扩增培养的MNC;静态扩增组小鼠注射经过静态扩增培养的细胞;反应器扩增组小鼠注射经过生物反应器扩增培养的细胞;空白对照组小鼠注射生理盐水.移植后6周处死存活小鼠,收集骨髓细胞,检测其中CD45+、CD3+、CD19+和CD33+细胞的含量以及人特异的Cart-Ⅰ和Alu基因的表达.结果 生物反应器扩增前MNC为(1.2～2.8)×108个,扩增后为(3.7～12.6)×108个,扩增后的细胞数明显高于静态扩增培养者(P<0.01).经生物反应器扩增后所形成的红系集落形成单位、粒-巨噬细胞集落形成单位数明显高于经静态扩增者(P<0.05).移植6周后,空白对照组小鼠均死亡,MNC组存活率为35%,静态扩增组存活率为30%,反应器扩增组存活率为62.9%,后者明显高于前二者(P<0.05).各组存活小鼠骨髓细胞中均检测到Alu基因和Cart-Ⅰ基因的表达以及人源CD33+、CD45+、CD3+及CD19+细胞.结论 利用生物反应器可大规模扩增人脐血造血干/祖细胞,所得细胞能植入小鼠体内,并能获得造血功能重建.
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混合型生物人工肝的体外功能
目的 设计一种新型混合型生物人工肝(HBAL)并通过对模拟肝衰竭血清的净化作用评价其疗效,探讨其临床应用的可行性.方法 选用中国人肝细胞株-1(CL-1)作为肝细胞供体,在微重力环境下,肝细胞微载体共培养方法培养至第5天,细胞总量约4.0×109个,细胞密度约为4.0×1010/L,在无菌环境下灌人自制生物反应器中,制成生物部分,非生物部分采用血液灌流+胆红素吸附,生物部分和非生物部分通过两套聚乙烯胶管构成一个封闭的环路,监测模拟肝衰竭血清中未结合胆红素、鹅去氧胆酸,胆酸、血氨经过HBAL循环后浓度的变化以及生物反应器中肝细胞功能、形态及肝细胞活性的变化.结果 整个治疗过程中循环前24h内,模拟肝衰竭血清中未结合胆红素(UBD)、鹅去氧胆酸(CDCD),胆酸(CA)和血氨(AA)的浓度分别从(335.3±6.0)、(395.0±5.6)、(155.7±4.5)、(39.0±2.6)μmol/L下降至(106.0±10.9)、(131.8±28.7)、(42.2±7.3)、(3.5±1.0)μmol/L,与0h比较差异有统计学意义(P=0.041),24h后浓度下降趋于平稳;循环48h后,CL-1细胞功能发生变化,生物反应器中模拟肝衰竭血清中的谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)分别从(25.9±4.2)IU/L、(22.0±3.6) IU/L、(0.28±0.09) μmol/L升高至(31.0±2.6) IU/L、(31.6±8.0)IU/L、(0.41 ±0.12) μ.mol/L,与0h比较差异有统计学意义(P=0.027);并且整个反应器中肝细胞的数量和活力在循环48 h后也呈现显著性下降(P=0.044).结论 (1)构建了一种新型灌流型生物反应器,该生物反应器中的CL-1细胞能够保持较高的活性和良好的功能.(2)新型混合生物型人肝可以显著降低模拟肝衰竭血清中的未结合胆红素、鹅去氧胆酸,胆酸、血氨的浓度,具有清除这些毒性物质的功能,提示其具有明显的肝功能支持作用.
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生物反应器内构建组织工程心脏瓣膜
目的 去细胞瓣膜上种植人主动脉瓣膜间质细胞,生物反应器内构建组织工程心脏瓣膜.方法 PEG交联去细胞瓣,GRGDSPC多肽共价修饰.RGD-PEG-去细胞瓣上种植人主动脉瓣膜间质细胞,缝制于生物反应器内.接种2、4、8h后,细胞计数观察细胞黏附情况.体外培养10d后行形态学观察和DNA含量测定.结果 免疫荧光检测显示,GRGDSPC多肽与PEG-去细胞瓣有效共价接枝.接种2、4、8h后,RGD-PEG-去细胞瓣组和单纯去细胞瓣组细胞计数分别为:(4.98±0.46)×107/L比(3.35 ±0.15)×107/L,(5.71 ±0.29)× 104 个/ml比(3.55±0.18)×107/L,(5.97±0.45)×107/L比(3.62±0.18) ×107/L,P＜0.05.RGD-PEG-去细胞瓣组较单纯去细胞瓣组DNA含量明显增高,(25.98±2.45)μg/瓣叶比(19.61±1.94)μg瓣叶,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 生物反应器内,GRGDSPC接枝的PEG-去细胞瓣复合支架,可促进种子细胞的黏附,改善瓣膜支架生物学性能.
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基于纳米支架材料的新型多层平板型生物反应器的构建
4～60 μmol/h.培养过程中,仅有少量的酶(AST、LDH)漏出.结论 初步构建的新型多层平板型生物反应器,符合生物人工肝基本的要求.其内培养的细胞能保持良好的活性,并具有相应的功能.
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应用生物反应器体外构建组织工程化血管平滑肌层
目的探讨生物反应器内构建具有一定强度的组织工程化血管的可行性.方法将体外培养扩增的猪血管平滑肌细胞接种于聚羟基乙酸(PGA)上,形成细胞-材料复合物,将其置于生物反应器内培养.实验组(n=5)为动态力学刺激培养(搏动频率:75次/分;扩张量:＜5%);对照组(n=5)为静态培养.3周后行大体观察及组织学检测.结果血管样组织直径5 mm,长10mm,厚1 mm.实验组具有良好的弹性,管腔圆;平滑肌纤维与弹力纤维较多,排列有层次.对照组弹性欠佳,管腔塌陷;平滑肌纤维与弹力纤维较少且排列紊乱.结论应用生物反应器可构建具有良好弹性的血管平滑肌层组织.
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搏动性剪切力对犬骨髓间充质干细胞分化的影响
本实验旨在观察犬骨髓间充质干细胞(MSCs)在搏动性剪切力作用下的细胞分化[1]. 一、材料与方法 1.实验动物:北京地区健康成年(3～4岁龄)雄性杂种犬3条(体质量15 g). 2.犬MSCs用流式细胞仪进行鉴定:选用CD45、CD105、CD34和CD90作为表型鉴定指标. 3.剪切力实验:将MSC滴加到支架腔内,连接到生物反应器上,剪切力(τ)的计算公式为τ＝4μQ/πr3.起始剪切力为1 dyne/cm2,2 d内逐渐增加至15dyne/cm2,然后在15 dyne/cm2的剪切力条件下再培养2 d,将静态培养的MSCs设为对照.
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混合型生物人工肝治疗急性肝衰犬的研究
我们在成功构建生物反应器,完成体外灌流实验基础上[1],建立混合型生物人工肝支持系统(HBLS),对急性肝衰犬模型进行实验性治疗,以测试其效能.
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微载体培养L02人肝细胞应用于生物人工肝的初步研究
L02人肝细胞株组织学来源为人正常肝组织,具备一定正常肝细胞的生物功能.我们将高密度微载体培养的L02人肝细胞聚集体加入中空纤维生物反应器,构建简易体外生物人工肝装置并进行初步的应用研究.一、材料与方法1.材料:L02人肝细胞株购于中国科学院上海细胞生物学研究所;Cytodex3微载体为Pharmasia公司产品;聚羟乙基异丁烯酸(Poly-HEMA)及DMEM、HamsF12培养基均为Sigma公司产品.
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生物人工肝辅助支持系统的研制现状及展望
肝脏是人体内大的代谢器官,具有生物合成、生物转化及生物降解等复杂的功能,急性肝功能衰竭及肝脏先天性代谢性疾病等终末性肝病的预后甚差[1].生物人工肝辅助支持系统(BAL )辅助治疗使患者渡过危险期或使患肝完全再生是终末性肝脏疾患理想治疗手段[2].生物反应器(BRC )是BAL核心成分,患者血浆在体外通过附着大量有代谢活性肝细胞的网状结构的BRC进行循环,以给肝功能衰竭患者提供代谢支持.目前急性肝衰的确切病因及其主要并发症-肝性脑病发生机制尚不十分清楚,BRC所必须具有的功能不十分明了,维持BRC内肝细胞正常功能是BAL取得理想疗效的关键[2].
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人工肝生物反应器的研究现状
体外人工肝支持系统(简称人工肝)是国外近年来发展起来为肝衰竭患者提供体外肝功能支持的装置,这一技术的出现与发展为肝衰竭的治疗开辟了新途径.在各类人工肝装置中,以体外培养肝细胞作为生物成分的新型生物人工肝被认为是有前途的,己在动物实验及临床应用中取得了较好的疗效[1].其基本原理是将体外培养增殖的肝细胞(人肝细胞、哺乳动物肝细胞或肝细胞株)置于体外循环装置(生物反应器)中,患者血液(血浆)流过生物反应器时,通过容器内的纤维素半透膜或直接与肝细胞进行物质交换,从而达到人工肝支持的目的.
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肝癌体外培养三维模型的建立
目的 构建能模拟癌细胞从黏附、侵袭到肝内癌巢形成过程的肝癌肝侵袭转移体外实验模型.方法 将肝癌细胞MHCC97H与肝组织片层置于RWV生物反应器进行三维混合培养,收集不同培养时间的混合类组织标本,检测其病理改变及侵袭转移关联基因表达.结果 转移关联基因的表达随病理侵袭进程的不同(癌细胞黏附、侵袭、癌巢形成)而呈不同模式[初期:基质金属蛋白酶(MMP)-9,t=-5.847,P＜0.01;钙黏蛋白(CDH1),t=3.199,P＜0.05;,MMP-7和CD44,相对表达均＞2.中期:MMP-2,t=-10.295,P＜0.01;趋化因子受体(CXCR4)和骨桥蛋白(SPP1),相对表达＞2和＞1.7.后期:CXCL12,和=-4.412,P＜0.05].结论 该模型较好地模拟了肝癌肝侵袭转移的病理全过程,有助于侵袭转移病理阶段的认识及"过程"关键蛋白筛查.
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用旋转生物反应器体外再造骨组织的实验研究
目的:将骨髓基质干细胞接种于聚乙醇酸支架中,在旋转生物反应器内进行动态培养,观察骨组织的形成情况.方法:分离、培养、扩增猪骨髓基质干细胞,细胞长满后用地塞米松诱导,收集细胞,按5×107/mL的浓度50 μL接种于聚乙醇酸支架中,静态培养5 d后,移入旋转生物反应器内进行动态培养,2月取材,通过大体标本、组织学检查观察新骨的形成情况,以静态培养作为对照.结果:细胞接种后1 d,即可以贴附于材料表面,显微镜下观察,细胞在材料表面伸展良好.连续培养2个月,形成质地坚硬的组织;组织学检查可见新形成的骨样组织,厚度约100 μm,而对照组中在材料表面有纤维组织形成.结论:旋转生物反应器内进行动态培养是体外再造骨组织的有效手段.
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转基因动物制药
论述转基因动物的概念及其与克隆动物的区别；阐明转基因动物怎样生产药物，介绍乳腺生物反应器；分析转基因动物制药的优点：设备简单，不耗能，无环境污染；生产药物品种多，产量高，质量好；生产周期短；成本低。展望转基因动物制药的发展前景及无限商机。
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去细胞组织工程心脏瓣膜再细胞化的研究进展
心脏瓣膜疾病已经成为严重威胁人类健康的疾病之一.瓣膜置换手术作为治疗心脏瓣膜疾病的重要手段已在临床上广泛应用多年,据估计每年有超过20万患者接受主动脉瓣置换手术[1-2] .目前临床上所用人工瓣膜均存在明显缺陷,机械瓣置换者需要终身抗凝治疗,具有出血栓塞等风险[3];而生物瓣耐久性差,因远期存在钙化、衰败等变化,平均使用周期仅约10 ~ 15 年[4-5] .近些年研究较多的组织工程瓣膜,有望解决目前瓣膜替代物存在的问题,使植入瓣膜具有自我修复、生长的能力,这对于一些儿童患者更显得尤为重要.
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灌注式RCCS生物反应器CFD模拟分析微载体旋转对细胞氧供的影响
目的:探讨利用微重力旋转细胞培养系统(RCCS)生物反应器仿真模拟分析微载体旋转对细胞氧供的影响.方法:联立不可压缩牛顿流体连续性方程和动量守恒方程、微载体内以及流动空间中氧的传递和反应方程,设置参数并求解;以Gambit建立RCCS网格模型,并用Fluent软件在欧拉多相模式下进行生物反应器数值模拟及流体力学分析.结果:以微载体直径及RCCS旋转速度作为自变量,基于欧拉-欧拉多相模型和氧运输公式成功建立RCCS数值分析模型.微载体直径和旋转速度均影响细胞培养效率,直径200、300、400 μm的微载体旋转速度分别为10、12、14 r/min;旋转1h后直径600μm的微载体RCCS中间区平均氧浓度增加85％.结论:CFD可以定量模拟分析影响微载体及氧供的相关因素,为优化培养条件提供参数.
关键词： 微重力旋转培养系统( RCCS) 生物反应器 CFD软件 -
转基因植物口服疫苗的安全性问题所引发的思考
目前人们使用的疫苗主要是通过微生物发酵和动物细胞组织培养获得.由于其生产工序繁琐、成本高、价格昂贵,故而在需要疫苗的第三世界国家推广应用困难很大.1990年世界卫生组织(WHO)提出了"儿童疫苗计划(Children/s Vaccine Intiative Goals,CVI)",鼓励运用新技术,研究、开发和生产成本低、不用冷藏、易于使用的防病疫苗.恰值此时,以植物作为外源蛋白的生物反应器用于生产医药取得了一系列的成果.因此,当用转基因植物生产疫苗的思路被提出之后,转基因植物口服疫苗(edible vaccines produced in plants)的研究也开始蓬勃发展起来.
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动物细胞生物反应器培养在我国生物制药领域的应用前景
动物细胞培养在当今生物制品中越来越重要,动物细胞的大规模培养技术已是生产生物制品的主流趋势,而动物细胞大规模培养的主要设备就是生物反应器.下面就生物反应嚣在我国生物制药领域动物细胞的培养现状及应用前景做一综述.
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重组人β-防御素-2基因在昆虫细胞的转染表达
目的:BEVS(Baculovirus expression vector system)杆状病毒表达系统是近年涌现的适用范围广、表达效率高的真核表达系统之一.本研究旨在探索应用该系统高效表达hBD-2的可行性及技术路线.方法:(1)利用引物hBD2p6和hBD2p9经PCR扩增,从原质粒的pcDNA3.1/Myc-His(+)/hBD-2中扩增出带有翻译起始密码ATG和终止密码TGA的完整重组hBD-2/His基因片段,通过双酶切,使该片段两端分别带有ScaI和KpnI两种限制性内切酶粘性末端;将此外源性片段插入转移质粒pAcGHLT-A的多克隆位点中的ScaI和KpnI位点上,使其处在多角蛋白基因强启动子的控制之下.(2)经重组pAcGHLT-A/hBD-2/His转移载体和AcNPV DNA共转染Sf21细胞,并在细胞内进行同源重组,形成重组病毒rAcNPVhBD-2/His.于共染后第5 d,收集各组细胞的培养上清,用终点稀释分析法检测共转染效率.经过多轮感染上清反复感染Sf21细胞和终点稀释分析法验证,获得高滴度的重组病毒.(3)用特异性抗-His抗体,经Western blot检测细胞及上清hBD-2/His的表达情况.结果:经酶切鉴定和测序分析证实:C端带Myc和6个多聚组氨酸双重标志的重组hBD-2已正确地插入BEVS系统的转移载体中,构建成重组转移载体pAcGHLT-A/hBD-2/His.经过多轮感染上清反复感染Sf21细胞及终点稀释分析法验证,高滴度的重组病毒rAcNPVhBD-2/His已被获得.Western blot检测结果提示Sf21细胞已表达和分泌6xHis-GST-hBD-2-6xHis融合蛋白.结论:本研究结果支持利用BEVS杆状病毒-昆虫表达系统作为高效表达重组hBD-2生物反应器的设想.
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一体化灌注法体外构建活化人工骨的实验研究
目的 探讨一体化灌注法——灌注接种-灌注培养体外构建活化人工骨的效果. 方法 以多孔β-磷酸三钙(β-TCP)支架为载体,采用自行设计的灌注式生物反应器进行人胚成骨细胞的PSPC,并设静态接种-静态培养(sssc)和静态接种-灌注培养(SSPC)为对照组,通过葡萄糖日耗量、细胞活力测定、扫描电镜(SEM)、组织学观察与形态计量分析等检测方法,比较3种构建方法的细胞增殖和分布情况. 结果 培养2、4、6、8d,3组细胞葡萄糖日耗量均随培养时间的延长而增加,SSPC组和PSPC组均明显高于SSSC组,差异有统计学意义(P＜0.05),培养6d内PSPC组明显高于SSPC组,差异有统计学意义(P＜0.05),培养8d时两组葡萄糖日耗量差异无统计学意义(P＞0.05).SSPC组(1.597±0.103)和PSPC组(1.668±0.129)细胞活力差异无统计学意义(P＞0.05),但均明显高于SSSC组(0.347±0.034),差异有统计学意义(P＜0.05).SEM及组织学观察显示SSSC组细胞仅分布在支架周缘,而SSPC组和PSPC组细胞在支架内部及周边均有分布,SSPC组、PSPC组细胞占孑L率(18.66％±4.41％、19.34％±3.55％)均明显高于SSSC组(4.07％±1.78％),差异有统计学意义(p＜0.05). 结论 一体化灌注法体外构建活化人工骨的效果优于传统的静态方法；与静态接种-灌注培养相比,一体化灌注法可显著促进培养初期细胞增殖从而加快组织构建速度.
