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酶解血粉功能特性的研究
目的:本文对酶水解血粉进行了研究,对工艺进行了探讨,达到充分利用的目的 .方法:通过甲醛滴定法和凯氏定氮法研究了酶浓度、底物浓度、PH值、反应时间、反应温度对血粉水解度的影响,结果:通过实验得出了佳工艺条件为:底物浓度为6%,反应时间为4h ,加酶量为1.5 ml,pH为7.0,反应温度为65℃.结论:佳条件下水解后的血粉添加到肉制品中,可以增加营养价值.
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蛋白酶活力及血浆蛋白在肉制品中的应用
目的:提高血浆蛋白利用率,方法:正交实验和血粉水解液添加到火腿中口感、色泽、组织结构综合评分,结论:将在佳条件下水解后的血粉添加到肉制品中,可以增加营养价值,改善产品组织结构和口感.结果:添加10ml水解液于火腿中来代替4g瘦肉效果佳.
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盆腔器官脱垂患者主韧带和阴道前壁组织中钙蛋白酶2及钙蛋白酶抑制蛋白的表达及其意义
女性盆底功能障碍性疾病( pelvic floor dysfunction,PFD)是各种病因导致的盆底支持组织薄弱,进而盆腔脏器移位,连锁引发其他盆腔脏器的位置和功能发生异常的一类疾病.主要包括盆腔器官脱垂(pelvic organ prolapse,POP)及压力性尿失禁( stress urinary incontinence,SUI).POP的发生是一个多因素、多阶段的复杂过程,发病机制尚小清楚.目前研究认为,POP的发生与盆底支持组织结构功能完整性的破坏密切相关[1].钙蛋白酶( calpain)是人体组织中普遍存在的中性蛋白酶,并和各类细胞骨架蛋白的降解密切相关,在肌纤维、胶原以及其他细胞外基质的降解过程中也发挥着重要作用,其功能受影响将导致支持组织失去弹性,盆底松弛、PFD相继发生.在病理状态下,细胞中常常伴有Ca2+体内平衡失衡的情况,并伴随有钙蛋白酶底物的蛋白质水解.其中钙蛋白酶2则可能在病理情况下才能被激活,导致疾病发生.钙蛋白酶抑制蛋白( calpastatin)是细胞内专一抑制钙蛋白酶活性的蛋白质,该蛋白是迄今为止发现的惟一的特异性钙蛋白酶家族抑制剂,与钙蛋白酶共存,起负调节作用.钙蛋白酶抑制蛋白调节钙蛋白酶活化所致的蛋白降解,它可以识别钙蛋白酶与钙结合引起的构象变化,并与之结合,在各种组织中均可表达,可能与盆底组织的重塑有内在联系,构成女性POP的发病基础.本研究通过测定子宫脱垂患者主韧带、阴道前壁组织中钙蛋白酶2、钙蛋白酶抑制蛋白的表达情况,探讨两者与POP的关系.
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晶状体中钙蛋白酶的研究
钙蛋白酶(calpains)是一种广泛存在于包括晶状体在内的人全身各脏器组织中的钙离子浓度依赖性中性蛋白酶.在人的晶状体中m-钙蛋白酶的表达占主导地位,同时存在内源性抑制剂--钙蛋白酶抑制剂(calpastatin).各种原因引起的钙离子浓度的升高可激活钙蛋白酶,使晶状体内的晶状体蛋白、细胞骨架蛋白和膜蛋白等多种蛋白质发生水解,从而导致白内障形成.钙蛋白酶的抑制剂可不同程度地抑制蛋白的水解作用,从而降低高钙引起的晶状体透明度的丧失,可为白内障的药物预防和治疗提供新的方法.
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Calpain和Caspase在白内障形成中的作用及二者的关系
Calpain是一类钙离子浓度依赖性中性蛋白酶，Caspase是一类同源半胱氨酸蛋白酶，通过对二者的研究发现，它们均参与白内障的形成，起重要的作用。本文在综述了Calpain和caspase两类蛋白酶的基本特点以及它们在白内障发生形成中所起作用的基础上，首次归纳了两类蛋白酶之间存在的关系，为进一步研究白内障发病机制，进而预防白内障的发生和非手术治疗提供参考和思路。
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酪蛋白抗凝血肽的制备及其体外抗凝血、溶栓作用研究
目的 研究抗凝血肽的制备、分离方法及其体外抗凝血、溶栓效果.方法 用木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶对酪蛋白进行4酶混合水解制备抗凝血肽,以固定化凝血酶对抗凝血肽进行萃取,用新西兰兔进行体外抗凝血、溶栓实验.结果 实验确定的抗凝血肽制备条件为酪蛋白质量浓度15％,水解每克酪蛋白的木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶用量分别为1 500、2 400、1000、1250U,水解温度50℃,pH 7.0,水解时间4h.固定化凝血酶萃取抗凝血肽的初始浓度6ATU/mL,萃取温度30℃,pH 5.0,萃取时间30 min.反萃取温度30℃,pH 7.6,反萃取时间40 min.抗凝血肽经高效体积排阻色谱分析,主要成分分子大小与马尿酰-组氨酰-亮氨酸相当.体外抗凝血时间超72 h,溶栓时间24 h.结论 酪蛋白抗凝血肽主要成分为3肽,体外抗凝血及溶栓实验效果良好.
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中性蛋白酶和胰酶分离阴道黏膜上皮细胞的对比研究
目的:建立新的阴道黏膜上皮细胞分离方法,体外培养阴道黏膜细胞供进一步研究.方法:利用中性蛋白酶(dispase)和胰酶分离人阴道黏膜上皮细胞,并通过形态学、角蛋白13(CK13)染色、细胞产量和克隆形成率等比较分离效果.结果:dispase组的细胞产量及克隆形成率更高.形态学和CK13染色均可见胰酶的分离作用并不完整,细胞大部分仍附于固有层.而dispase组基底细胞则完整地分离开.结论:酶消化法能成功分离阴道黏膜细胞,在体外生长良好,而dispase分离效果更好.
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基质金属蛋白酶与神经系统疾病
基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)属Zn2+依赖的中性蛋白酶,与分离整和素金属蛋白酶(a disintegrin and metalloproteinase,ADAMs),分离整和素金属蛋白酶血栓收缩蛋白(a disintegrin and metalloproteinase thrombospondin,ADAMTs)共同组成金属蛋白酶(metalloproteinases,MPs)超家族.MMPs既参与正常生理过程如伤口愈合、妊娠分娩等,也参与病理损伤过程如恶性肿瘤细胞扩散、风湿性关节炎、动脉粥样硬化和神经系统炎症反应等.它在中枢神经系统(central nervous system,CNS)疾病的炎症反应中有很强的破坏作用,通过攻击脑血管的基底膜和破坏血-脑屏障(blood-brain barrier,BBB),导致脑出血和脑水肿,并对神经元有不同程度的毒性作用.
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肥大细胞的中性蛋白酶
中性蛋白酶是人类和动物肥大细胞中重要的蛋白成分.因其具有高度的选择性及敏感性,中性蛋白酶不但成为肥大细胞有别于其他细胞类型,而且成为鉴别肥大细胞亚群的重要标志.作为肥大细胞中的主要介质之一,中性蛋白酶在肥大细胞生物化学与功能异质性方面扮演了重要的角色.因此,对肥大细胞中性蛋白酶的认识已成为更好的理解肥大细胞生物学与病理生物学的重要步骤.
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比较两种酶消化法对真皮成纤维细胞的影响
背景:目前真皮成纤维细胞研究应用广泛、需求量大、分离方法多,但是用于细胞分离培养的酶消化法尚未有对比研究.目的:比较两种酶消化方法分离的真皮成纤维细胞的细胞产量、形态、迁移、增殖4个方面的差异.方法:分别使用中性蛋白酶+胶原酶或胰蛋白酶分离消化真皮成纤维细胞,并进行细胞计数,原代培养并观察细胞形态学差异,采用细胞划痕实验观察细胞迁移能力并使用CCK-8检测细胞增殖活力.结果与结论:①采用中性蛋白酶+胶原酶消化的成纤维细胞在接种后六七天后融合,通过胰蛋白酶消化分离的成纤维细胞在八九天后融合,两种酶消化法都可获得真皮成纤维细胞;②与胰蛋白酶消化组相比,中性蛋白酶+胶原酶消化组的细胞产量显著增加;③划痕实验结果显示,胰蛋白酶消化的真皮成纤维细胞迁移速度较中性蛋白酶+胶原酶消化的细胞显著减慢;④两种酶消化方法分离的真皮成纤维细胞生长曲线均显示细胞数与培养时间呈正相关关系,在第3,4和5天,中性蛋白酶+胶原酶组的成纤维细胞的吸光度均显着高于胰蛋白酶组细胞的吸光度;⑤结果表明,与胰蛋白酶消化相比,用中性蛋白酶+胶原酶消化的细胞产量、迁移、增殖能力均更高;提示中性蛋白酶+胶原酶消化法优于胰蛋白酶消化法.
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新生大鼠缺氧缺血性脑损伤神经细胞凋亡及卡配因抑制剂-3对其的影响
卡配因(Calpain)是一种Ca2+依赖性中性蛋白酶,广泛存在于包括脑组织在内的各种组织中,静息状态下Calpain主要以无活性的酶原形式存在,当胞内Ca2+浓度增高时被激活,并参与脑缺血等多种疾病的发生.近年来研究表明,脑缺血时神经细胞的凋亡也与Calpain有关,而Calpain抑制剂可显著减少凋亡的发生,减轻脑损伤.目前Calpain抑制剂对新生儿缺氧缺血性脑损伤(hypoxic ischemic brain damage,HIBD)神经元凋亡的影响尚未见报道.
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中性蛋白酶的单甲氧基聚乙二醇修饰
目的 利用单甲氧基聚乙二醇(mPEG)化学修饰中性蛋白酶,并考察修饰酶的酶学性质.方法 采用氰脲酰氯对mPE5000进行活化,再对中性蛋白酶进行化学修饰,制得mPEG-中性蛋白酶,并比较中性蛋白酶在修饰前后的红外光谱和酶学性质.结果 中性蛋白酶的修饰率为41.7%;红外光谱分析表明,修饰酶红外光谱图的多处特征峰有较大的改变;其适温度和适pH值未发生变化,但修饰酶的热稳定性显著提高.结论 确定了经mPEG化学修饰中性蛋白酶的适温度和适pH值,获得的修饰酶热稳定性高于天然酶.
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炭疽中性蛋白酶部分片段的重组表达、纯化及免疫效果研究
构建表达炭疽杆菌中性蛋白酶基因部分片段N蛋白(位于248～532氨基酸),并对其免疫效果进行研究;设计引物采用PCR法自炭疽杆菌扩增中性蛋白酶部分片段N,T-A克隆后构建原核表达质粒pET28a(+)-N,通过Western blot检测重组蛋白的免疫原性.以Al(OH)3为佐剂皮下注射免疫BALB/c小鼠,用ELISA方法测血清总IgG水平,MTT比色法测定脾T淋巴细胞增殖,采用流式分选法对脾T淋巴细胞亚群分类;Western blot显示重组蛋白具有免疫原性,rN免疫BALB/c小鼠后,ELISA检测到免疫鼠体内有特异性抗体产生;T淋巴细胞亚群试验表明,重组N蛋白以诱发Th2型免疫反应为主;MTT试验表明,rN蛋白对小鼠脾细胞在体外有促进生长和增殖能力,说明该重组蛋白具有生物学活性.纯化的rN可诱导高水平的抗体反应,为进一步的功能研究奠定了基础.
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利用中性蛋白酶消化法扩增毛囊干细胞的实验研究
目的 完善毛囊干细胞的体外培养扩增体系.方法 接种毛囊干细胞于滋养层细胞上,利用中性蛋白酶分离毛囊干细胞和滋养层细胞传代,进行鉴定并计算扩增数目.结果 经中性蛋白酶传代后,毛囊干细胞生长良好,可连续培养至15代;第12代(P12)毛囊干细胞免疫细胞化学检测均表达K15、β1-整合素及p63,原代(P0)至P12毛囊干细胞均表达K15 mRNA.以Pl0计算,细胞数量为1.2×1036,约250m2,满足构建的需要.结论 通过滋养层接种毛囊干细胞结合中性蛋白酶消化法传代,可大量扩增毛囊干细胞.
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SPSS正交设计提取林蛙油多糖
目的 研究中性蛋白酶水解提取林蛙油多糖的佳工艺参数.方法 以料水比、中性蛋白酶浓度、水解时间和水解温度为考察因素,提取液中多糖含量为指标,通过SPSS软件设计L9(34)正交试验,并用SPSS进行数据处理.结果 通过正交实验,得出中性蛋白酶提取林蛙油多糖工艺条件为料水比1∶100、加酶量为5%、水解时间1 h、水解温度50℃.结论 运用SPSS软件设计L9(34)正交表并进行数据处理,大大方便了实验结果处理,使实验方便科学,得出中性蛋白酶水解提取林蛙油多糖的工艺.
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小鼠原代胸腺上皮细胞分离方法的比较与优化
目的 比较几种小鼠原代胸腺上皮细胞(TEC)分离方法的效果,筛选简单、高效、实用的分离方法.方法 将小鼠胸腺组织根据所用的消化分离方法分为以下几组:胶原酶Ⅰ组 (Collagenase Ⅰ, Col IE组, 1 mg/ml)、DispaseⅡ组 (DisⅡ组, 3 mg/ml)、Col IE+低浓度DisⅡ组 (Col IE/Dis Ⅱ-L组, 0.75 mg/ml)、Col IE+中浓度DisⅡ组 (Col IE/Dis Ⅱ-M组, 1.5 mg/ml)、Col IE+高浓度DisⅡ组(Col IE/DisⅡ-H组, 3 mg/ml).优选出适消化方法后,将所得单细胞悬液分成Percoll实验组以及Percoll对照组.采用血细胞计数板进行总细胞数计数,台盼蓝染色法观察细胞的活性;使用流式细胞术检测胸腺基质细胞(TSC)以及TEC的比例.结果 与单独使用DisⅡ与Col IE相比,Col IE与不同浓度Dis Ⅱ联合使用均能加快胸腺组织消化(P<0.01),获取单个胸腺的总细胞数较多,尤以中、高浓度DisⅡ与Col IE联合消化效果更佳(P<0.05或P<0.01).与单独使用酶消化组相比,Col IE与中、高浓度DisI联合消化均可不同程度地增加获取TSC和TEC的比例(P<0.01).与Percoll对照组相比,Percoll密度梯度离心进一步提高获取TSC和TEC的比例(P<0.05).此外,各种消化分离方法均可获得高活细胞率的细胞.结论 Col IE与DisⅡ联合消化,结合Percoll密度梯度离心可获取数量多、活性高的小鼠原代TEC.
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一株产中性蛋白酶海洋细菌的筛选与初步鉴定
目的 从海洋环境及生物中筛选高产蛋白酶菌株,初步研究其生长特性及酶学特性,为进一步研究开发提供依据.方法 将从青岛黄海海域的鱼类、贝类、海水、海泥等样品中分离的细菌,用奶粉平板法和Folin-酚法筛选蛋白酶酶活性较高的菌株,测定该菌株的佳产酶条件并初步检测其酶学特点,通过形态学、分子生物学鉴定,初步确定种属.结果 菌株为革兰阴性杆菌,好氧,无芽孢,无荚膜,有鞭毛.奶粉平板上的菌落直径1-2 mm,圆形乳白色、光滑、边缘整齐、半透明.根据16S rDNA序列测定和系统发育树分析,初步鉴定该菌为Aranicola protealyticus.该菌生长温度15-37℃,适生长温度25℃.生长pH 5.5-9.0,适pH 7.5.生长氯化钠浓度0-6%,适浓度1%;所产蛋白酶的适酶活性温度40℃,适pH 7.5.结论 菌株XF-1环境适应性较好,为中度嗜冷细菌.所产蛋白酶为中性蛋白酶.
关键词： Aranicola proteolyticus 嗜冷细胞 中性蛋白酶 海洋 筛选 -
基质金属蛋白酶-9与脑梗死
基质金属蛋白酶(MMPs)是一组含锌的能降解细胞外基质(ECM)的中性蛋白酶的基因家族,现已发现20多种,根据蛋白质结构可分为5个大类,即基质溶解酶、胶原酶、明胶酶、膜型酶和其它不能分类的基质酶,MMPs能降解几乎所有的细胞外基质,具有很重要的生理功能和病理作用.生理条件下,参与胚胎发生、正常组织重塑、创伤愈合和血管发生,在病理条件下,参与纤维变性、关节炎等的病理改变及肿瘤的生长、迁移、侵袭和转移等[1,2].MMPs家族还参与神经系统疾病如多发性硬化、脑外伤、脊髓损伤、脑炎、脑膜炎、脑血管病变等的病理发生.MMPs以酶原的形式合成,去除前肽后激活,而且一种MMPs激活可使别的MMPs激活,形成瀑布效应,MMPs之间的精细调节对维持ECM内环境的稳定至关重要.MMPs在体内与其特异性抑制剂-基质金属蛋白酶组织抑制因子(TIMPs)同步表达,二者以1∶1的形式构成复合体[3].
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正常宫颈上皮细胞原代培养体系的改良
目的:探索一种高效、可重复的正常宫颈上皮细胞原代培养方法.方法:取60例正常宫颈组织,分成2组,分别采用Ⅱ型中性蛋白酶联合0.25 g/mL胰蛋白酶-EDTA(中性蛋白酶联合法)及Ⅰ型胶原酶消化分离后进行原代培养,比较两种分离效果;观察采用中性蛋白酶联合法消化不同时间对分离效果的影响.观察添加体积分数5%FBS dK-SFM培养基与单纯dK-SFM培养基培养原代宫颈上皮细胞的生长曲线差异,并用形态学、广谱角蛋白免疫细胞化学染色鉴定细胞来源.结果:正常宫颈上皮细胞原代培养总成功率为40%.中性蛋白酶联合法成功率、分离所得细胞密度、原代细胞融合时间及细胞纯度均高于Ⅰ型胶原酶消化法(P<0.05).中性蛋白酶消化20 h的分离效果优于消化16和24 h(P<0.05).体积分数5%FBS dK-SFM培养基原代培养的宫颈上皮细胞增殖活性高于单纯dK-SFM培养基(P<0.05).细胞生长状况良好,可在体外传代至5~6代,并可冻存与复苏,免疫细胞化学染色显示广谱角蛋白表达阳性.结论:Ⅱ型中性蛋白酶联合0.25 g/mL胰蛋白酶-EDTA分离法和体积分数5% FBS dK-SFM培养基培养原代正常宫颈上皮细胞,高效、可重复性好.
关键词： 原代培养 宫颈上皮细胞 中性蛋白酶 角质细胞无血清培养基 -
酶法提取蛹虫草中虫草素的研究
目的 研究UPLC浏定虫草素的方法及酶法提取蛹虫草中虫草素的工艺条件.方法 对酶种类、酶用量、酶解温度、酶解时间、酶解pH值进行考察,确定佳提取工艺.结果 中性蛋白酶提取蛹虫草中虫草的佳工艺为:酶用量1.5%,酶解温度50℃,酶解pH值5.5,酶解时间60 min.结论 该工艺条件下,虫草素提取得率为0.732%,与未加酶的热水浸提相比,虫草素提取得率增加6.2倍.
