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实时荧光定量PCR检测HBVcccDNA临床应用研究
乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)属嗜肝脱氧核糖核酸科(hepadnaviridae),不完全双链DNA病毒,是引起急慢性肝炎的主要病原之一.乙型肝炎病毒与其他DNA病毒相比,不同之处在于它特殊的反转录复制形式,以及特殊的复制中间体共价闭合环DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)的存在.cccDNA是病毒mRNA和前基因组RNA的转录模板,cccDNA的存在是病毒复制的一个重要标志,是病毒感染得以维持的根源,抑制或清除cccDNA是治疗慢性乙型肝炎的关键.
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实时荧光定量RT-PCR检测胃癌细胞中MRP2、MRP3及MRP5 mRNA的表达
与其在正常胃细胞系GES-1的表达没有显著性差异;MRP3、MRP5基因表达量在三种细胞中均有显著性差异.结论 MRP2可能参与了胃癌的内在性耐药,而MRP3、MRP5可能与胃癌的获得性耐药有关,实时荧光定量方法是一种灵敏度高,特异性强,重复性好的定量检测方法.
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高危型人乳头瘤病毒感染状况分析
许多文献报道,几乎所有的宫颈癌病例标本中都有人乳头瘤病毒(HPV),持续高危型HPV感染增加宫颈癌发生的风险[1~3]。但是HPV体外培养要求高,免疫学方法和细胞学方法也不适合基层医院,而基层医院是直接接触患者的地方,寻求经济有效的方法解决问题成为必需。 HPV DNA检测经济高效,作为筛查的基本手段已成为预防宫颈癌新途径,用来鉴别宫颈癌前病变和早期宫颈癌。为了解我院就诊患者的感染情况,我们对1365份宫颈脱落细胞标本采用实时荧光定量PCR进行筛查,现将结果报道如下。
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支气管哮喘患者与健康对照转录因子T-bet、GATA-3表达的比较
目的 比较哮喘患者及健康对照外周血CD4+T细胞转录因子T-bet、GATA-3表达水平.方法 选取新疆医科大学第六附属医院门诊及住院哮喘患者100例;同期健康志愿者100例;获取的外周血标本中的CD4+T淋巴细胞,是采用免疫磁珠法分离提取获得;而T-bet、GATA-3转录因子mRNA表达水平,其检测用SYBR Green I实时荧光定量法.结果 T-bet基因mRNA表达含量在哮喘组中为(6.90±2.25),对照组中为(6.74±2.16).与对照组相比,哮喘组表达含量较高,但差异无统计学意义(P>0.05).GATA-3基因mRNA在哮喘中相对表达量为(4.22±2.03),健康对照组中相对表达量(3.15±2.22).与对照组相比,哮喘组GATA-3mRNA明显较高,两组差异具有统计学意义(P<0.05).结论 支气管哮喘组Th2细胞转录因子GATA-3mRNA高表达,转录因子T-bet/GATA-3 mRNA的平衡破坏,进一步影响支气管哮喘的发生发展.
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实时荧光定量PCR技术研究进展及应用
1 研究进展二十多年前,美国Perkin-Elmer Cetus公司人类遗传研究室Mullis等发明了聚合酶链反应(PCR)技术,这成为20世纪生物医学领域革命性创举与里程碑,使人们梦寐以求的体外无限扩增核酸片段的愿望成为现实.几年后,世界生物实验室中,PCR技术占据了统治地位,并成为分子生物领域的关键技术.大昔特异性PCR产物的生成使许多新的DNA分析方法的使用成为可能,这些分析方法包括下游修饰或互补性产物分析技术.
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瘦素在高-中分化结直肠癌癌组织及癌旁组织中的表达规律
目的:观察高-中分化结直肠癌癌组织及癌旁组织中瘦素蛋白和mRNA的表达规律。方法:选择24例结直肠高-中分化腺癌组织标本,分为结直肠癌组、横向癌旁组、纵向癌旁组及正常结直肠组,应用免疫组织化学染色及SYBR GreenⅠ实时定量PCR方法,检测各组标本中瘦素蛋白和mRNA的相对表达水平。结果:免疫组化结果显示结直肠癌组瘦素表达的MOD值为0.42±0.03,显著高于横向癌旁组的0.28±0.02和纵向癌旁组的0.26±0.04。 SYBR GreenⅠ实时定量PCR结果显示结直肠癌组瘦素mRNA表达水平为3.41±0.21,显著高于横向癌旁组的1.65±0.16和纵向癌旁组的1.63±0.14。横向癌旁组与纵向癌旁组瘦素mRNA的表达水平差异无显著性。结论:高-中分化结直肠癌组织中的瘦素蛋白及mRNA表达水平较结直肠正常组织及癌旁组织表达水平显著升高,提示瘦素与结直肠癌发生发展密切相关。
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90例SARS患者含漱液内冠状病毒定量与临床转归的相关研究
目的通过对SARS患者含漱液内冠状病毒定量与临床转归的相关性的初步研究,以期能建立起客观的SARS重症救治早期预警指标.方法对2003年4~5月在本院诊断的90例SARS成年患者,77例SARS密切接触者进行含漱液的实时荧光定量(RT-PCR)方法检测SARS病毒定量,将其结果与临床转归进行对比分析.结果77例SARS密切接触者含漱液中病毒检测均为阴性,90例SARS病人病程第5~11天含漱液内病毒检测48例为阳性,且21例病毒定量>1.0×102copies/ml者中的9人出现ARDS,6人死亡,与病毒定量阴性或病毒定量<1.0×102copies/ml者比较仅各1例发展至ARDS,1例死亡,具有显著性差异.结论含漱液用于检测SARS病毒核酸对于早期诊断和未发病者的监测有着重要的意义.含漱液内SARS病毒定量高者有可能成为"超级传播者".SARS患者的含漱液内冠状病毒定量愈高提示疾病愈可能是重型,应加强监护,及早治疗,以期提高治愈率,降低病死率,是客观的SARS重症救治早期预警指标,应引起重视.
关键词: 严重急性呼吸道综合征 SARS病毒 实时荧光定量 含漱液 -
长链非编码RNA-HOTAIR与乳腺癌腋窝淋巴结转移相关性研究
目的:探索长链非编码RNA-HOTAIR在乳腺癌及前哨淋巴结、腋窝淋巴结中的表达情况,分析与乳腺癌其他指标的相关关系,以指导治疗并预测预后。方法:收集2013年6月-2013年12月乳腺癌住院手术患者10例,均行前哨淋巴结活检术,取乳腺肿块组织、癌旁组织及前哨淋巴结(SLN)、腋窝淋巴结(ALN)。术后均经病理证实为浸润性导管癌。四组标本组织采用实时荧光定量RT-PCR检测HOTAIR的表达情况,结合临床病理结果,采用t检验、等级相关等统计方法分析各指标之间的关系。结果:(1)HOTAIR基因在各组中的表达,SLN组(9.33±1.23),ALN组(6.90±2.00),两者比较差异有统计学意义(t=3.401,P=0.004);癌组织组(8.81±1.27),癌旁组织组(7.00±1.11),两者比较差异有统计学意义(t=3.389,P=0.003);SLN组与癌旁组织组比较差异有统计学意义(t=4.441,P<0.001)。(2)HOTAIR表达情况与临床病理指标关系密切,与淋巴结转移率、ki-67蛋白表达呈正相关,相关系数分别为0.67和0.82,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:HOTAIR基因在乳腺癌前哨淋巴结以及癌组织中有异常高表达,其促进细胞增殖、侵袭转移的功能显著,提供乳腺癌基因靶向治疗的新位点。
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核糖体蛋白基因RPS13与RPS26在部分非霍奇金淋巴瘤中表达的定量研究
近来研究表明,核糖体蛋白基因(RPG)的异常与肿瘤的发生、发展相关.我们研究发现RPG家族成员RPS13和RPS26在人鼻型NK/T细胞淋巴瘤中表达明显下调.本研究运用实时荧光定量PCR方法对一组不同组织学类型的非霍奇金淋巴瘤样本中RPS13和RPS26基因表达进行检测,旨在了解其在上述各肿瘤中的表达情况及其意义.
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子痫前期胎盘组织中人类白细胞抗原G的表达及其临床意义
子痫前期是妊娠期特有疾病,其发病机理仍未阐明.人类白细胞抗原G(HLA-G)属非经典性人类白细胞抗原Ⅰ类基因,在母胎免疫耐受上起重要作用.本研究采用实时荧光定量RT-PCR和Western印迹,分别在mRNA和蛋白水平比较了正常妊娠与重度子痫前期患者胎盘组织中HLA-G 的表达,探讨HLA-G在子痫前期病理生理过程中的作用及其临床意义.
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酒精性肝病患者肠道中6种重要菌群的定量分析
目的 对酒精性肝病患者肠道中大肠杆菌、粪球菌、乳杆菌、双歧杆菌、拟杆茵及柔嫩梭茵的含量变化进行定量分析,并就其与肝损伤的相互关系进行初步探讨.方法 全自动生化分析仪检测健康人及酒精性肝病患者血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)及谷氨转肽酶(GGT)活力;ELISA实验检测血浆中肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素6(IL-6)、D乳酸(DAO)、二氨氧化酶(D-LA)和肠型脂肪酸结合蛋白(FABP2)水平;荧光实时定量PCR技术对粪便中上述6种重要茵群进行定量分析.结果 随着肝功能损害程度的加剧、饮酒史及饮酒量的增加,酒精性肝病患者血清ALT、AST、GGT活力,及血浆TNF-α、IL-6、DAO、D-LA和FABP2水平均较健康人群组及各自对应组有不同程度升高(P<0.05).粪便中双歧杆菌和拟杆菌含量均明显降低(P<0.05),而大肠杆菌、粪球菌、乳杆菌和柔嫩梭茵含量有所改变,但未见显著性差异(P>0.05).结论 肠道微生态失调在酒精性肝病发生发展过程中发挥重要作用,其作用机制可能与酗酒导致肠道中双歧杆菌和拟杆菌等肠道菌群生长受到抑制有关.
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肺腺癌单细胞基因突变检测的细胞回收液的影响研究
目的 研究不同的单细胞回收液对肺癌单细胞突变检测的影响,为后续的肿瘤基因异质性检测和研究奠定基础.方法 以肺癌细胞系A549细胞为研究对象,采用微流控芯片技术,将肺癌A549细胞进行分离;将A549单细胞分别回收于达氏修正依氏培养液(DMEM)、磷酸盐缓冲溶液(PBS)和0.9%氯化钠溶液(生理盐水)中,每组30个单细胞;分别加入裂解液进行单细胞裂解,用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)对单细胞进行KRAS(G12S)基因突变检测,比较3种溶液体系对测定结果的影响.结果 采用微流控芯片进行单细胞分离和回收,只要有单个细胞越过阀门,就能够被成功分离回收,回收效率能够达到100%.采用0.9%氯化钠溶液筛分出的单细胞KRAS(G12S)突变检测检出率高,能够达到90%,平均Ct值低;采用DMEM筛分出的单细胞KRAS(G12S)突变检测检出率低,平均Ct值高.结论 采用0.9%氯化钠溶液进行单细胞分离、回收,实时荧光定量PCR扩增效率高,检测效果好,适合用于癌症单细胞水平突变检测.
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T淋巴母细胞淋巴瘤石蜡包埋组织中HOX11L2基因的表达及其临床意义
目的探讨在石蜡包埋T淋巴母细胞淋巴瘤(T-lymphoblastic lymphoma,T-LBL)组织中检测目的基因HOX11L2表达的可行性及其意义.方法采用RT-PCR及实时荧光定量PCR(RQPCR)方法,对54例T-LBL石蜡包埋标本进行HOX11L2mRNA检测.结果54例中有7例(13.0%)检测到HOX11L2mRNA表达.被检出的7例均为儿童青少年,中位年龄9(5~15)岁,均有前纵隔占位病变,其中5例Ki67增值指数(PI)≥80%,2例病变累及中枢神经系统.HOX11L2表达组与未表达组在发病年龄、Ki67 PI及有无纵隔肿块的差异具有统计学意义(P值均<0.05);与未表达组相比,HOX11L2表达组的生存期较短(中位生存时间分别为11.5和7.0个月),两组差异具有统计学意义(P<0.05);两组性别、初诊时临床分期、中枢神经系统以及骨髓受累与否差异无统计学意义.结论应用RT-PCR或RQ-PCR方法在石蜡包埋组织中检测目的基因的表达是可行的.HOX11L2mRNA表达高发于儿童,可能与部分儿童T-LBL的发生以及预后不良有关.
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伊马替尼治疗高嗜酸粒细胞综合征FIP1 L1-PDGFRA融合基因变化的动态监测
高嗜酸粒细胞综合征(Hypereosinophilic syndrome,HES)是一种原因不明的以嗜酸粒细胞持续增高伴有多脏器受累的综合征.新近资料显示56%~75%的HES患者FIP1L1-PDGFRA融合基因异常[1,2].我们采用实时荧光定量RT-PCR法对1例接受伊马替尼治疗的HES患者进行治疗前后FIP1L1-PDGFRA融合基因的分析,从分子水平评价伊马替尼治疗HES的效果.
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急性髓系白血病患者骨髓细胞Ang2 mRNA表达水平及其临床意义
血管生成素2(angiopoietin2,Ang2)为内皮细胞特异性生长因子之一,近年来研究发现其表达水平与急性髓系白血病(AML)预后密切相关[1-4].我们通过实时荧光定量PCR方法对57例初诊AML患者骨髓单个核细胞(MNC)中的Ang2 mRNA表达水平进行检测,并分析其与临床的关系.
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荧光定量逆转录-聚合酶链反应检测β地中海贫血患者β与γ珠蛋白mRNA表达水平
实时荧光定量PCR方法(FQ-PCR)克服了已有的定量PCR方法的缺点,特异性强,定量准确[1].我们应用实时荧光定量RT-PCR(FQ-RT-PCR)方法对β地中海贫血(β地贫)患者β与γ珠蛋白mRNA水平进行检测,现将结果报告如下.
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实时荧光定量RT-PCR检测TGF-β1 mRNA表达
利用荧光TaqMan技术(5′核酸外切酶活性)和一种可以实时检测荧光信号的仪器(ABI Prism 7700序列检测系统),在PCR反应完全封闭的情况下可实时检测PCR扩增的动力学变化,能够对标本扩增过程中的起始拷贝数快速、准确地定量,极大地克服了原有PCR技术存在的不足,已逐步成为PCR更新换代的新技术[1,2].目前常规检测β1转化生长因子(TGF-β1)表达多采用竞争RT-PCR及内源性参比基因RT-PCR,它们都属于PCR终点法检测,很难对起始模板数准确定量.我们利用实时荧光定量RT-PCR技术建立了检测TGF-β1 mRNA表达的方法.
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实时荧光定量聚合酶链反应对结核性胸膜炎的诊断价值
目的 探讨实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)技术检测胸腔积液结核分枝杆菌DNA对结核性胸膜炎的诊断价值.方法 对88例结核性胸膜炎患者和32例恶性胸腔积液标本行实时荧光定量PCR检测结核分枝杆菌DNA.结果 88例患者胸腔积液实时荧光定量PCR检测阳性36例(40.91%),32例恶性胸腔积液实时荧光定量PCR检测阳性1例(3.13%).2组阳性率比较,差异有统计学意义(P<0.01).结论 胸腔积液实时荧光PCR检测对结核性胸膜炎早期诊断有重要仍价值.
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实时荧光定量PCR技术研究及其在医学领域的应用
实时荧光定量PCR (real-time quantitative PCR,FQ-PCR)是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR过程,后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法.本文综述了FQ-PCR技术的原理特点及其在医学领域中的应用和研究进展.
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坤泰胶囊对环磷酰胺致卵巢储备功能低下大鼠卵巢GDF-9、Egr-1的影响
目的:观察预防性应用坤泰胶囊对环磷酰胺致卵巢储备功能低下大鼠血清性激素FSH、LH、E2、AMH水平的影响以及对卵巢GDF-9(生长分化因子9)、Egr-1(早期生长反应基因)基因及蛋白表达的影响,探讨坤泰胶囊对环磷酰胺致卵巢储备功能低下大鼠的治疗作用及作用机制.方法:将60只12周龄SD雌性大鼠随机分为空白组、环磷酰胺模型组(模型组)、坤泰胶囊组(分设高中低剂量)、结合雌激素组.空白组正常喂养;模型组用环磷酰胺腹腔注射法建立卵巢储备功能低下大鼠模型[1];各给药组于造模同时分别给予不同剂量的坤泰胶囊及结合雌激素片灌胃.实验期间观察大鼠行为学改变,行阴道涂片观察大鼠动情周期的变化;采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测大鼠血清性激素AMH及FSH、LH、E2水平变化;光镜下观察卵巢形态与卵泡数;实时荧光定量(RT-PCR)检测大鼠卵巢GDF-9、Egr-1mRNA表达水平的变化;免疫组化法检测大鼠卵巢GDF-9、Egr-1蛋白表达水平的变化.结果:坤泰胶囊能够降低模型大鼠体内性激素FSH、LH的水平,升高E2及AMH水平,并且能够增加大鼠卵巢中GDF-9、EGR-1蛋白及mRNA表达,修复大鼠受损的卵巢组织结构,改善卵巢血供,减少卵泡闭锁,提高成熟卵泡存在数量,改善大鼠动情周期及行为学变化.结论:预防性应用坤泰胶囊,可有效提升卵巢敏感性,治疗效果与西药结合雌激素片无明显差异.