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资源有限地区HIV/AIDS疾病进展监测及抗病毒治疗疗效评价的替代指标
外周血CD4+T淋巴细胞计数和血浆病毒载量是监测HIV/AIDS疾病进展及评价高效抗逆转录病毒治疗(HAART)疗效的两项关键指标.目前公认的主流检测手段包括:经流式细胞术检测CD4+T淋巴细胞计数,采用实时荧光定量PCR技术分析血浆HIV RNA.这两种方法均要求专门仪器及配套试剂,价格昂贵,对操作者要求也较高,难以在资源有限地区广泛应用.因此,寻找适合我国国情的技术简便、费用相对低廉、结果可靠的替代指标具有重要的现实意义.
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实时荧光定量PCR检测肝癌患者外周血甲胎蛋白mRNA水平
在生理状态下,甲胎蛋白(AFP)基因主要由胎肝细胞表达产生,出生后该基因表达迅速受到抑制.肝细胞大量坏死或发生原发性肝癌时,AFP基因再次激活[1].我们采用以Taqman技术为基础的实时荧光定量PCR技术,检测各型肝癌患者外周血细胞中AFP mRNA水平,分析外周血中是否存在肝癌细胞,并判断该方法检测肝癌细胞血液转移的可行性.
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RUNX3基因在膀胱移行细胞癌组织中转录水平的定量研究
我们应用实时荧光定量RT~PCR技术检测膀胱移行细胞癌(BTCC)组织标本中RUNX3基因的mRNA表达水平,探讨其临床意义.
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先天性巨结肠层粘连蛋白基因与RET基因表达的关系
我们通过实时荧光定量PCR技术对先天性巨结肠(Hirschsprung's disease,HD)病儿层粘连蛋白基因与RET基因的表达以及它们的相关性进行了研究,现将结果报告如下.
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铜绿假单胞菌群体感应系统调控生物膜形成与AmpC基因表达的研究
目的 研究铜绿假单胞菌(PAE)标准菌株PAO-1与不同的群体感应(QS)系统缺陷菌株的生物膜形态和生物膜状态下产酶基因AmpC的表达差异.方法改良的平板法建立PAE生物膜模型,银染法鉴定生物膜生成,观察PAO-1和不同突变菌株形成生物膜的形态;抗菌药物诱导生物膜菌AmpC基因表达,采用实时荧光定量PCR方法测定PAO1、QS系统缺陷菌株的AmpC基因表达水平.结果 PAO-1和突变菌株PDO100形成的生物膜较厚、层次多、致密,而突变菌株PAO-JP1和PAO-MW1形成的生物膜较少,分布不均匀;在生物膜状态运用抗菌药物诱导,QS系统缺陷菌株PAO-MW1、PAO-JP1的AmpC基因表达水平均较PAO1和缺陷菌株PDO100低,差异有统计学意义(P<0.05).结论 PAE生物膜形成和AmpC基因诱导表达可能与las QS系统发挥的直接或间接调控作用有关,而rhl QS系统较少或是未参与生物膜形成和AmpC基因表达调控.
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尖锐湿疣患者人乳头状瘤病毒基因分型的分布
目的 探讨尖锐湿疣(CA)患者人乳头状瘤病毒(HPV)基因型的分布,为临床诊断和治疗提供依据.方法 采用实时荧光定量聚合酶链反应技术(FQ-PCR),对2012年9月-2013年8月皮肤科门诊的77例CA患者标本,进行HPV感染分型检测.结果 77例CA患者标本中检测HPV阳性63例,阳性率为81.82%;检出13种型别,以低危HPV6/11型为主,未检出HPV45型,其中低危HPV6/11型阳性49例次,阳性率63.64%;高危型HPV阳性40例次,阳性率51.95%,两者比较差异有统计学意义(P<0.05);HPV单一型感染43例,感染率为55.84%,20例存在2~4重混合感染,多重感染率达到25.97%;就诊CA患者以21~30岁为主,其次为30~40岁,该两个年龄段HPV检测阳性率较高,分别为85.29%、89.47%,但与其他年龄段相比,差异无统计学意义,不同性别CA患者HPV检测阳性率,差异无统计学意义;男性患者内参基因Ct范围24.70~37.10(32.30±3.19),女性患者内参基因Ct范围21.74~35.34(28.21±4.33),两者之间比较差异有统计学意义(P<0.05).结论 尖锐湿疣主要基因型感染是低危型HPV6/11,20~40岁人群为易感人群,HPV分型检测在尖锐湿疣的临床诊断和预后方面具有重要意义.
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实时荧光定量PCR检测手足口病肠道病毒71型与柯萨奇病毒16型临床分析
目的:探讨肠道病毒71型(EV71)与柯萨奇病毒 A 16型(Cox A16)实时荧光定量PCR检测在早期诊断手足口病(H FM D )中的意义,为临床治疗提供参考依据。方法对2012年3月-2013年6月157例疑似H FM D患儿的粪便、疱疹液、鼻咽拭子样本进行EV71、Cox A16、肠道病毒(EV )的实时荧光定量PCR检测,根据试剂说明书的标准判定;采用SPSS16.0进行数据分析。结果粪便中EV、EV71、Cox A16的检出率分别为94.09%、42.04%、38.85%,高于鼻咽拭子样本,差异有统计学意义(P<0.05);而粪便与疱疹液中EV、EV71、Cox A16的阳性率相比,差异无统计学意义。结论对 H FM D患儿早期诊断、早期治疗,应该首选粪便标本采用实时荧光定量PCR法检测EV、EV71、Cox A16。
关键词: 手足口病 肠道病毒71型 柯萨奇病毒A 16型 实时荧光定量 聚合酶链反应 -
微小RNA-101在子宫颈鳞癌组织中的表达及其意义
宫颈癌是一种发病率高、能早期预防的常见妇科肿瘤。但在新疆尤其是南疆经济条件较差的地区,由于卫生条件和医疗意识较差,宫颈癌仍然威胁着女性的健康和生命。微小RNA(miRNA)作为肿瘤调节微环境中的重要一员,在多种肿瘤的生长中起到重要的调控作用[1]。本课题组的前期研究应用miRNA微阵列芯片技术筛选出宫颈癌组织中12种存在差异表达的miRNA,其中微小RNA-101( miR-101)的差异表达明显[2]。本研究应用实时荧光定量PCR和锁定核苷酸原位杂交( LNA-ISH)技术检测miR-101在宫颈鳞癌中的表达,探讨其在宫颈鳞癌发生、发展中的作用及意义,以期为宫颈鳞癌的早期诊断提供理论基础和实验依据。
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压力性尿失禁患者阴道壁筋膜组织中Ⅰ型胶原α1多肽mRNA表达水平的研究
压力性尿失禁(stress urinary incontinence, SUI)是一种常见的妇科疾病,发病率随年龄增长而增加,尤以围绝经期妇女发生多,给社会和个人均带来了很大压力和负担[1].近年来,SUI发病的病理生理机制正成为SUI研究的热点.阴道结缔组织在维持尿道压力方面具有重要作用,其胶原的含量和构成影响尿道压力的维持.深入研究SUI的胶原改变及其影响因素对阐明发病机制,寻找新的治疗方案具有重大意义[1,2].本研究采用实时荧光定量PCR技术检测SUI患者阴道壁筋膜组织中Ⅰ型胶原α1多肽mRNA表达水平的变化,现将结果报道如下.
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新生甲减仔鼠心肌甲状腺激素受体mRNA的表达
先天性甲状腺功能减低症 (克汀病)患儿常伴发严重的心脏损害,形成甲减性心脏病[1],说明甲状腺激素缺乏可能影响心肌的正常发育, 目前关于甲状腺激素缺乏对心肌发育影响的相关研究甚少.甲状腺激素通过甲状腺激素受体(thyroid hormone receptors,TR)调节目的基因的转录,从而发挥其正常生理功能,据此本研究采用实时荧光定量PCR(Real time fluorescence quantitation PCR,FQ-PCR)方法定量分析了正常和甲减新生仔鼠心肌中TRmRNA的表达差异.
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原发性肾病患儿肾组织中nephrin和podocin mRNA的表达
2001年6月至2003年12月,我们采用实时荧光定量PCR法,检测了nephrin和podocin在原发性肾病综合征(PNS)患儿肾脏组织中的表达,以了解两者在蛋白尿产生机制中的作用以及与足突融合的关系.
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儿童造血干细胞移植患者的人巨细胞病毒感染
人类巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)属于疱疹病毒β亚科,人感染HCMV后病毒可在体内长期甚至终身潜伏,在免疫受损或抑制时可再次激活,引起临床症状.HCMV是造血干细胞移植(hemopoietic stem celltransplantation,HSCT)患儿术后中期(2~3个月)感染常见的病原,引起较高的发病率和死亡率,严重影响预后[1].因此,密切监测HSCT患儿的HCMV感染,及时准确的诊断和治疗对于HSCT至关重要.本文应用实时荧光定量PCR方法检测血清中HCMV-DNA,对HSCT患儿的HCMV感染进行了监测.
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福建医科大学附属第一医院神经内科关于脊髓性肌萎缩症的研究论文在Archives of Neurology上发表
儿童型脊髓性肌萎缩症(SMA)是一类较常见的常染色体隐性遗传病,目前尚无有效的治疗方法,死亡率及致残率均较高.其致病基因运动神经元生存基因(SMN)存在两种同源性极高的拷贝SMN1、SMN2,90%以上患者存在SMN1基因缺失,可通过判断有无SMN1缺失来进行基因诊断.目前常用的基因诊断及产前诊断方法有连锁分析、限制性片段长度多态性(RFLP)、变性高效液相色谱(DHPLC)、测序及实时荧光定量PCR等,但上述任何一种方法单独应用均不能保证基因诊断及产前诊断绝对可靠,多种方法联合应用则可取长补短,使诊断的准确性大大提高.
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实时荧光定量聚合酶链反应检测腓骨肌萎缩症1A型基因重复
腓骨肌萎缩症(Charcot-Marie-Tooth disease,CMT),是神经系统常见的遗传性疾病之一,根据电生理和病理学研究将其分成两大组:CMT1(脱髓鞘型)和CMT2(神经元型或称轴索型).该病是一组遗传异质性疾病,目前已发现30个基因座位与不同类型的CMT相关,其中有11型已明确了致病基因[1],发病率高的是常染色体显性遗传的CMT1A[2,3].我们已先后建立起短串联重复序列分析(STR)和聚合酶链反应(PCR)酶切法检测特异性融合片段来诊断CMT1A基因重复[4].STR结合银染的方法因有便宜、省时和所需DNA数量少等优点曾被广泛应用,但主要缺点是受杂合率的限制,如果被检测者为纯合子,则无法得出结论[5];再者,实验结果不稳定,银染重复性不理想.而PCR酶切法的阳性率则较低[4,6].因此,为提高基因重复检测的阳性率,并适于在临床应用,我们应用实时荧光定量PCR技术,以SYBRGreen Ⅰ荧光染料为标记物,采用标准曲线的相对定量方法检测了18例CMT1A患者的基因重复,现报道如下.
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不同开花期金银花Hsp70基因相关miRNA的表达研究
植物花期调节是其适应逆境的重要机制,热休克蛋白Hsp70 (heat shock protein 70)家族是抵抗胁迫的主要分子伴侣之一;在花期的基因调控网络中,miRNA可以作为负调控因子参与转录后基因表达调控.本文通过生物信息学方法,从金银花转录组中获得一条Hsp70基因并结合金银花miRNA库获得一条可能靶向Hsp70基因的新型miRNA.分别对获得的Hsp70基因和miRNA进行生物信息学及在不同开花期的表达进行分析.系统进化树显示获得的Hsp70基因与水稻、拟南芥中的Hsp110亚家族聚为一类;miRNA二级结构预测显示其结构稳定,可靠性高;miRNA与Hsp70基因的结合位点图显示miRNA与Hsp70基因碱基互补中存在两个碱基错配;表达分析显示Hsp70基因与miRNA在不同花期中表达量趋势相反,说明miRNA可能调控Hsp70参与金银花的花发育阶段.本研究为金银花花期调控、响应环境胁迫等机制研究提供新的思路.
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119例肝炎患者HBV与HCV重叠感染的调查分析
为了解中国HBV与HCV重叠感染与三种慢性肝病的关系,本文以鹤岗地区患者为对象,选择119例慢性肝病患者用ELISA检测HBsAg和抗-HCV,实时荧光定量PCR仪检测HBV-DNA,并对所得结果进行了分析.现报告如下.
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SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测人c-myc基因方法的建立
目的 构建含有c-myc基因的重组质粒并以其为模板,建立以SYBR GreenⅠ染料为荧光指示剂的实时荧光定量PCR(FQ-PCR)技术检测c-myc的标准曲线,为FQ-PCR准确检测c-myc奠定基础.方法 用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)法从人食管鳞癌组织的总mRNA中反转录扩增c-myc cDNA,将纯化的PCR产物与pGEM-T Easy载体进行连接,转化宿主菌DH-5α,然后挑选阳性克隆重组质粒,分别用PCR扩增、限制性核酸内切酶EcoRⅠ酶切进行鉴定并测序分析.用紫外分光光度计测质粒浓度,计算拷贝数制备FQ-PCR浓度梯度标准品.后对质粒标准品进行FQ-PCR检测.结果 PCR扩增、酶切鉴定及测序分析均证实c-myc重组到pGEM-T Easy 载体上.建立了人c-myc标准曲线,其对数与相应的Ct值(循环阈值)具有良好的相关性,相关系数r2=-0.99~-1,斜率为-3.1~-3.6.结论 所构建的人c-myc质粒标准品应用SYBR GreenⅠ荧光染料技术建立的标准曲线线性关系好,灵敏性和特异性高,准确可靠,此方法可作为FQ-PCR检测c-myc基因的标准方法.
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实时荧光定量 Real-timePCR 和 RT-PCR 技术在流感疫情检测中的作用
目的:实时荧光定量 real-timePcr 和 rt-Pcr 检测技术在流行性感冒检测诊断上的应用探究。方法收集2011年至2013年和田地区哨点医院疑似流感、sa rs 患者的咽拭子标本1350份,应用实时荧光定量 real-timePcr 和 r t-Pc r 检测方法、M d cK 细胞培养法和血凝抑制试验进行病原学和血清学检测。结果1350份哨点医院疑似流感、sails患者的咽拭子标本中用荧光定量 real-timePcr 和-Pcr 检测,阳性98份。阳性率7.3%。其中甲型 H1n1流感阳性62份、B 型流感份阳性25份、季节性 H3阳性11份。结论实时荧光定量 real-timePcr 和-rt-Pcr 方法检测流感病毒能够在3~4 h 内得出结果、且操作方便、特异性强、灵敏度高,值得在流感诊断过程中广泛应用。正确检测和鉴定病毒是必须解决的首要问题,我中心开展了甲型 H1n1流感病毒核酸检测技术的检测工作,目前已建立了甲型 H1n1流感病毒核酸 real-timePcr 和-Pcr 检测技术,并将其及时用于临床样本的检测。
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重组干扰质粒对多药抗性Acc-3细胞Bcl-2基因表达作用实验研究
目的 探讨重组干扰质粒对口腔腺样囊性癌多药抗性细胞株(Acc-3/CDDP)细胞中Bcl-2基因表达的干扰效率.方法 按siRNA设计原则设计针对Bcl-2基因的Oligo DNA,体外化学合成Oligo DNA,Oligo DNA退火、连接、转化、筛选克隆,构建针对Bcl-2基因的表达重组RNA干扰质粒(psiB1、psiB2、psiB3),细胞脂质体转染多药抗性Acc-3/CDDP细胞,Realtime RT-PCR的标准曲线、扩增曲线和熔解曲线的数据收集处理,采用荧光定量RT-PCR方法检测重组干扰质粒对多药抗性Acc-3/CDDP细胞中Bcl-2基因表达的干扰效率.结果 实时荧光定量RT-PCR方法检测psiB1、psiB2、psiB3质粒脂质体转染后Bcl-2基因的表达情况结果显示:psiB1、psiB3相对于对照组无明显干扰效果,psiB2的干扰程度达66.20%.结论 针对Bcl-2基因的表达重组RNA干扰质粒psiB2(CCgggAgATAgTgATgAA)能有效沉默多药抗性Acc-3/CDDP细胞中Bcl-2基因的表达.
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膀胱尿路上皮癌中miRNA-300的差异表达
目的 探讨miRNA - 300在膀胱尿路上皮癌中的差异表达与其生物学行为的关系.方法 常规提取30例膀胱尿路上皮癌及5例正常膀胱黏膜组织中总RNA,应用荧光定量RT - PCR方法检测标本中miRNA - 300的表达情况.结果 与正常膀胱黏膜上皮组织相比,膀胱尿路上皮癌中miRNA - 300表达明显下调(P<0.01).结论 miRNA - 300的差异表达极可能为促进膀胱尿路上皮癌的发生及发展因素之一.
关键词: miRNA - 300 膀胱尿路上皮癌 实时荧光定量