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免疫胶体金在标记超薄切片中抗原的几点体会
金标法是利用胶体金在碱性环境中带负电的性质,使其与抗体相吸引,从而将抗体标记.我们在使用免疫胶体金标记超薄切片抗原的实验中深深地体会到,要提高标记阳性的成功率,某些因素将在实验中起到很重要的作用.1、材料和方法1.1材料 20例通过光镜、免疫荧光、电镜诊断为IgA肾病的肾活检组织的环氧树脂包埋块.1.2方法取肾活检组织,经0.05%戊二醛,1%多聚甲醛(二甲砷酸钠缓冲液配制)固定3-4h,1%OsO4后固定2h,梯度丙酮脱水,Epon812包埋,60℃聚合12h,制备超薄切片(50-70nm),粘贴于带有formar膜的镊网上.以下实验在湿盒内进行:10%H2O2蚀刻30min,双蒸水冲洗;正常羊血清30m in;0.05M TBS冲洗;一抗((1:10)4℃冰箱内孵育20h,加室温2h; 0.05M Tris冲洗;正常羊血清孵育15min;0.05M Tris冲洗,0. 02M Tris(其中含0.1%BSA 0.05%NaN3pH8.2)冲洗;二抗 (1:20),室温孵育2h;0.02M Tris冲洗,0.05M Tris冲洗, 0.05M Tris加Tritonx-100浸洗,3次每次10min,双蒸水冲洗 ;1%戊二醛固定15min,双蒸水冲洗;铅铀双重染色,电镜观察.2、结果金颗粒主要集中于肾小管上皮细胞的胞质,有的沉积在线粒体内,或刷状缘其间 .详细内容见(用金标法检测细胞因子在人IgAN肾细胞内的位点及意义)金晓明等一文.3、体会和注意事项3.1 戊二醛的浓度直接影响抗原的保存.我们经过多次实验,戊二醛浓度在0.05%, 多聚甲醛1%时,固定时间不少于3小时,组织大小在1-2mm3,组织结构保存良好 ,同时对抗原影响也不大.3.2 抗体的稀释液采用0.05M Tris,0.15M NaCL,pH7.0,含 0.05%聚乙二醛(PEG)和0.05%NaN3.其中PEG可以使金颗粒分散, 提高蛋白质间的结合力,有利于一抗与二抗的结合,血清和BSA作为稀释液时都没有PE G效果好.一抗与二抗的稀释比例根据所标记抗原的情况而定.3.3 Triton x-100加入到0.05M Tris缓冲液中作为冲洗液,可以提高胶体金的穿透力,同时Triton x-100又是一种表面活性剂,在2抗标记后用含有0.05Triton x-100的Tris缓冲液浸洗30min,可以清除一部分非特异性反应的胶体金,使切片中组织形态清晰,提高样品的反差,而过量浓度的Tri ton和过长时间的浸洗会破坏组织中的膜结构.3.4 在实验中采用网架装载铜网,一次可以同时孵育几张到几十张超薄切片,同时不用担心在孵育过程中切片的正反面,又可避免镊子夹破支持膜和切片,节省每一实验步骤中的操作时间.网架是用铜网装载盒制成的,钻漏铜网盒,按所需的大小锯成小网架.清洗时用浓盐酸浸泡几分钟后冲洗,放在无水乙醇中保存,待下次使用前晾干.
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VEGF在精索静脉曲张大鼠睾丸和附睾中表达的研究
血管内皮生长因子(VEGF)是新生血管形成的主要调控者之一.VEGF不但作用与内皮细胞 ,而且也作用于非内皮细胞,它可能对男性生殖具有调节作用.精索静脉曲张(VC)是男性不育的一个主要原因,VC的睾丸流体动力学和血管系统有所改变,睾丸和附睾中VEG F的表达是否会有改变,VEGF在精索静脉曲张性不育中是否起作用等至今未见报道.本研究通过免疫组织化学方法对正常大鼠和VC大鼠睾丸和附睾中VEGF的定位及变化作了研究.材料和方法:建立青春期大鼠左侧精索静脉曲张动物模型,并进行了验证.取曲张组及对照组大鼠双侧睾丸和附睾,用Bourn′s液固定24hr(4℃),脱水 ,石蜡包埋.切片5-6μm,常规脱蜡至水.分别作HE染色和免疫组织化学染色.免疫组织化学染色:1.用1mM EDTA(pH8.0)煮沸切片10min、室温冷却 20min以修复抗原.2.用3%H2O2室温10min,封闭内源性过氧化物酶 ,用0.01M PBS(pH7.4)洗4次,10min/次.3.正常血清室温封闭 20hr.4.用0.01mg/ml多克隆兔抗人重组体VEGF165抗体4℃孵育2 4hr,阴性对照切片用不含一抗的PBS缓冲液孵育,PBS洗4次.5.用生物素标记羊抗兔IgG(二抗)室温孵育2小时,洗同上.6.用抗生物蛋白链菌素过氧化物酶室温孵育30min,洗同上.7.DAB显色5-6min,PBS洗同上,双蒸水洗.8.常规脱水,透明,封片.2.结果:VEGF免疫组织化学阳性反应呈棕褐色,在正常组和VC组大鼠的睾丸和附睾中均有表达.免疫组织化学反应具明显的特异性,在阴性对照组中,VEGF反应为阴性.正常组大鼠睾丸的VEGF蛋白定位于间质细胞和支持细胞,在一定发育阶段生精细胞中也有明显的VEGF免疫反应活性,而且在曲细精管不同区段的生精细胞组合中其表达有明显的差异.在正常大鼠附睾中,我们首次发现在附睾管的始段、头部、体部和尾部,以及输精管上皮中 ,VEGF阳性的细胞数和活性有明显的差别.VEGF主要定位于附睾管上皮主细胞,在基细胞和一些大的晕细胞(巨噬细胞)中也可见到.在一些管周的肌样细胞中也有VEGF阳性反应.在附睾管固有层内,毛细血管和小血管的内皮为VEGF阴性,而一些血管的管周肌细胞中为阳性.精索静脉曲张大鼠的睾丸和附睾中,VEGF的免疫反应活性有明显改变,曲张时间不同, 其表现也有差异,左右侧睾丸和附睾的VEGF免疫反应强弱也不同.
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近交系小耳猪肾、小肠组织中α-Gal抗原分布的研究
随着器官移植工作的广泛开展,同种供体远远不能满足临床治疗的要求.目前科学研究正积极寻找可供人体器官移植的异种供体,以满足临床需要,而猪被认为是理想的异种供体之一.但猪-人异种移植的主要障碍是供体器官或组织中的异种抗原(α-半乳糖抗原, α-galactose residues,α-Gal)引起的超急性排斥反应.研究猪组织器官内α-Gal的分布情况,对猪进行基因改造,以达到猪-人异种器官移植的目的具有重大意义.本实验选用两种方法对猪肾、小肠内α-Gal抗原分布进行研究,以筛选更敏感的α-Gal检测方法.实验选用近交系中国西双版纳小耳猪(近交系数为0.9 0以上)的肾、小肠(12指肠、空肠、回肠)标本,甲醛固定,常规石蜡制片,片厚6μm. 以16、8、4μg/ml三种浓度的生物素标记的BSI-B4作为亲和物,切片孵育3 0分钟(37℃)、24和48小时(4℃),分别与SP(工作浓度1:10)、SABC 结合,DAB呈色后观察.结果为:1.SABC方法:三种不同浓度的BSI-B4在肾近曲小管上皮细胞、小肠绒毛上皮细胞及固有膜内淋巴细胞的胞浆内均有棕黄色反应,以8 μg/ml BSI-B4孵育24小时的结果为优,4μg/ml的浓度,4℃孵育48 小时,亦可获得与8μg/ml相似的结果,而16μg/ml的浓度则有较深的背底.2 .SP方法:16μg/ml BSI-B4孵育24小时(4℃)的结果与SABC法的8 μg/ml相似,但阳性反应稍弱且背底较深;8、4μg/ml两种工作浓度孵育24小时甚至更久,肾及小肠标本均显示阴性结果.因此,通过实验得出SABC法的敏感性要优于SP法.在对不同组织或器官进行α-Gal抗原分布检测的研究中,应首选SABC方法,既可获得较准确的抗原定位又可节省试剂.
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粉防己碱对炎症白细胞第二信使物质的作用
目的:研究粉防己碱(Tet)对炎症白细胞第二信使物质cAMP、[Ca2+]i及IP 3的作用.方法:收集大鼠角叉菜胶性胸膜炎渗出液中炎症白细胞,采用竞争性蛋白结合分析、放射免疫分析、酶放射化学分析和荧光比色法,分别测定Tet对炎症白细胞cAMP生成量、腺苷酸环化酶(AC)活性、磷酸二酯酯(PDE)活性和胞浆内游离钙浓度([Ca2+]i)及炎症白细胞IP3生成的作用.结果:Tet 10,20,40,80mg/kg于致炎前30min ip,可剂量依赖地抑制炎症白细胞渗出, 同时剂量依赖地增加炎症白细胞cAMP浓度.Tet抑制炎症白细胞渗出的作用与增加白细胞cAM P浓度的作用密切相关(r=0.98,P<0.05).Tet 12.5,25,50,100μmol/L与炎症白细胞37℃孵育15min亦能浓度依赖地增加cAMP浓度,同时升高炎症白细胞AC活性,但降低[Ca2 +]i在存在Ca2+及CaM时,Tet 12.5～100μmol/L与炎症白细胞在37℃孵育20mi n可浓度依赖地抑制PDE活性.但在不含Ca2+及CaM时,Tet对PDE活性无明显影响.T et 12.5～100μmol/L亦可浓度依赖地促进肌醇磷脂水醇,降低PMA和内毒素引起的IP3增加.结论:Tet对炎症白细胞第二信使物质的作用表现为增加cAMP的生成,降低炎症白细胞[Ca 2+]i和减少IP3含量.
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生物传感器技术在筛选赤芍中抗内毒素有效部位的应用
目的:以细菌内毒素为靶点,应用生物传感器技术,优选出赤芍中抗内毒素有效成份的提取方法.方法:将LPS包被于生物传感器的疏水性样品池为固定相,三种方法(水浸法、醇提法、石油醚法)提取的赤芍样品为流动相,通过生物传感器测定样品与LPS的亲合力;同时进一步测定不同样品与0.25EU/ml内毒素混合孵育后,内毒素亲合力的变化.结果:水浸法提取的赤芍样品与内毒素具有较高的亲合力,与内毒素孵育后仍有一定的亲合力,提示含有较高的与LPS结合的有效成份,醇提法与LPS的亲合力相对较小,石油醚提取样品基本上与LPS没有亲合力.生物传感器技术测定的结果与传统的鲎试剂法测定结果一致,1:40稀释的赤芍水浸液能够中和78.1%以上的内毒素.结论:赤芍水浸法能够提取到更多的与内毒素结合成分;以LPS为靶点,应用生物传感器技术,筛选拮抗内毒素的成分,与传统的鲎试剂法比较,具有快速、高效、直观、无干扰等优点.
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杀菌性/通透性增加蛋白模拟肽(BNEP)体内外中和内毒素的实验研究
目的:观察杀菌性/通透性增加蛋白模拟肽(BNEP)在体内、体外中和内毒素的能力.方法:1. BNEP与LPS结合的亲和力的测定:应用生物传感器测定BNEP与LPS及LPS的活性中心Lipid A结合的亲和力.2.体外中和作用:将不同浓度的BNEP、多粘菌素B与定量的LPS 37℃孵育30min,分别应用生物传感器及动态比浊法鲎试验检测孵育后混合溶液中的LPS残余量.3. 体内中作用:NIH小鼠15只随机分为生理盐水(NS)、LPS、BNEP组,每组5只.通过尾静脉给药,LPS组:E.coli O55.B5按10mg/kg+等量生理盐水;BNEP组:按BNEP 10mg/kg+LPS 10mg/kg;NS组按100ul/10g给生理盐水,60min后眶动脉取血,应用鲎试验动态比浊法测定LPS水平.结果:BNEP与LPS及Lipid A具有高亲合力结合能力,其KD值分别为4.88e-08M及2.18e-08M;在体外约8ug/ml的BNEP可中和2ng/ml的LPS;在体内BNEP可显著降低动物循环血中的LPS水平.结论:BNEP具有较强的中和内毒素作用.
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EB病毒IgG介导溶血性贫血的噬红细胞现象
患者16岁男孩,10天前诊断为感染性单核细胞增多症,近来黄疸和木纳进行性加重入院.实验室检查:血红蛋白49 g/L,总白细胞计数34×109,血小板计数296×109/L.外周血片显示成白红细胞增多、明显的中性白细胞噬红细胞现象(见图1).在C3d/C3b存在时直接抗球蛋白试验阳性,在IgG存在时为阴性.血清与患者自身红细胞呈全凝集反应,37C凝集素效价为32,4 C不发生反应,血清与5 mmol/L DTT孵育后反应消失.虽然在多-兰二氏试验试管中含有病人血清和37 C孵育时发现轻微溶血,但未显示双相溶血素.EB病毒嗜异细胞抗体试验阳性.患者接受红细胞输注、内固醇激素、大剂量静注IgG、血浆置换和美罗华治疗,临床效果良好.
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血小板的细菌污染:可防止恶性事件的异常表现
1单位富血小板血浆(PRP)在22±2℃血小板振动孵育箱保存的第1天时呈充气样外观,见图1(污染血小板的外观,左图为正面观察,右图为侧面观察).
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HBsAg ELISA试剂的振动态孵育观察
目前,酶联免疫吸附实验(ELSIA)是采供血机构筛查血液应用广的一种方法.在我国,随着ELISA试剂的更新换代和不断发展,其检测的灵敏度和特异性都有了一定程度的提高,但同发达国家相比,还有一定的差距.笔者在实际工作中发现振动态孵育可提高ELISA试剂的灵敏度、增加其稳定性、克服边缘效应等特性.笔者以HBsAg ELISA试剂为例,比较了其分别处于静止态孵育和振动态孵育(抗原-抗体结合)的实验结果.
关键词： HBsAg/ELISA 振动态 静止态 孵育 -
丙酮酸钠林格氏液体外孵育对CPB患者血液流变学的影响
目的 观察丙酮酸钠林格氏液对体外循环(CPB)患者转机不同时间点血液孵育后血液流变学的影响.方法 随机选择择期在CPB下行主动脉瓣或二尖瓣置换的患者13例.分别于CPB转机前(T1)经桡动脉采血3 mL;转机10 min(T2)、60 min (T3)和停机60 min(T4)采血21 mL.分别各时点取3 mL血液测孵育前基础值.B后各时点血液平均分成6份,每两份相同地加入丙酮酸钠林格氏液、乳酸钠林格氏液与生理盐水各1 mL,在37℃下,分别孵育30、60 min后测血液流变学指标.结果 CPB转机后主要血液流变学指标均明显高于转机前水平.丙酮酸孵育后反映红细胞聚集性的指标和反映红细胞脆性的指标均有不同程度的降低.结论 ①CPB转机对心内直视手术患者的血液流变学有不良影响;②丙酮酸钠林格氏液体外孵育CPB患者血液后对血液流变学有改善作用;③乳酸钠林格氏液体外孵育对血液流变学无改善作用.
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VITROS 750比色孵育盘抓片器不到位原因及处理
VITROS 750是美国生产的全自动干化学生化分析仪,当发生故障时仪器能够提示可能出现的原因及处理方法,但不是所有的故障仪器都能提示,要根据具体情况分析.我们在使用VITROS 750时,比色孵育盘抓片器(CMPICKER)很少出现故障,当出现比色孵育盘抓片器不到位(CM REFLECTOEMTER*CM PICKER*not in position)报警时,仪器提示以下三个原因及处理方法.
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VITROS 750电解质孵育盘电磁阀不移动的原因及处理
VITROS 750是美国生产的全自动干化学生化分析仪,随着使用年限的增加,仪器常出现电解质孵育盘电磁阀不移动(PM INCUBATOR * SOLENOID * did not move)报警,仪器不能进入工作状态,无法进行电解质测定.
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ELISA-STAR全自动酶标分析仪工作计划表编辑应用
ELISA-STAR是瑞士HAMILTON公司生产的96孔酶标板全自动分析处理系统,它集合了标本和控制品加注、试剂加注、微板孵育、微板洗涤、条码读取和比色结果判读功能于一体,是新一代的全自动酶免分析一体机,但分析仪实验项目的工作进度、完成整个实验所需时间的安排完全依赖于工作计划表,由计划表充分体现出来.
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PHA对LAK细胞诱导激活的研究
淋巴因子激活的杀伤细胞(Lymphokine-activated kilIer，简称LAK)，1980年Yorn等将人或动物的淋巴细胞与白细胞介素-2(IL-2)共同孵育3～4d后，发现孵育后的淋巴细胞能溶解杀伤肿瘤细胞而对正常细胞无影响，具有这种杀伤的现象称为LAK现象．首先由Rosenberg开展LAK……
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《亚洲男性学杂志》部分摘要
促性腺激素作用多态性的临床意义Ilpo T. HuhtaniemiDepartment of Physiology, University of Turku, Kiinamyllynkatu 10, 20520 Turku, Finland,and Department of Obstetrics and Gynaecology, University of Aberdeen, Aberdeen AB 25 2ZD, Scotland, UK近期研究表明,促性腺激素分子结构的多态性使其在不同生理和病理条件下具有不同功能.不同促性腺激素分子糖基化状态的可变性所致之微观不均一性,是循环血中促性腺激素分子结构多态性的原因之一.促性腺激素的糖基部分对其发挥固有的生物活性甚为重要,这可以通过测定其生物活性与免疫反应性之比(B/I)而获知.我们用改进的体外生物鉴定和免疫测定方法来重新评价此现象,结果显示,促性腺激素(尤其是LH)的固有生物学活性似乎比过去假定的更为稳定.从前所证明的许多差异,有些甚至在特定临床情况下认为具有诊断价值,结果乃方法学伪像.本文第一部分总结了我们近年来在LH的B/I比率方面与男性特殊关联的一些发现.第二部分则描述了新近在LHβ-亚单位基因中发现的一种普遍多态性.变异体LHβ等位基因包含两个点突变,这使LH产生两个氨基酸改变以及一个额外糖基化位点.LH变异体在自然界普遍存在,不同人种的携带率从0到52%不等.LH变异体与野生型LH在功能上是有区别的,无论男女,其携带者似乎生殖功能存在轻度异常者较为多见.临床医生应该注意到此项LH变异形式(所有免疫测定都无法检出),它可能是有些患者LH检测得到异常结果的原因. 关键词:FSH;LH;生物检测;免疫检测;突变;多态性;糖基化长期服用大剂量对乙酰氨基酚削弱雄性大鼠的生殖能力W.D. Ratnasooriya, J. R. A.C. JayakodyDepartment of Zoology, University of Colombo, Colombo 3, Sri Lanka.目的:评价对乙酰氨基酚在雄性大鼠中的抗生殖效应.方法:雄鼠每日口服500 mg/kg或1000mg/kg对乙酰氨基酚,连续30 d.与雌鼠合笼,评价其性行为及生育力.结果:治疗2 h后,性行为不受影响,但30 d后,两个剂量均导致雄鼠性欲(用乘骑、插入和射精率来评价)、性活力(乘骑数、插入数和交配效率)或性表现(交配间隔)的显著损伤.在交配实验中,生育力(受孕数,生育指数,着床率和着床数)显著降低.所有效应均为可逆.这种抗生殖效果不是由于一般毒性所引起,而是由于精子减少所致之着床前失落的增加,以及正常或高活性精子活力的降低和精子生殖潜力的降低.结论:长期应用大剂量对乙酰氨基酚可以引起雄大鼠生殖能力下降. 关键词:对乙酰氨基酚;生育力;性行为;寡精症;着床前失落;获能;精子活力ICSI技术在严重男性不育症中应用的细胞遗传学及男科学研究现状G. Haidl1, B. Peschka2, G. Schwanitz2, M. Montag3, K. van der Ven3, H. van der Ven31. Dept. of Dermatology and Andrology; 2. Inst. of Human Genetics,3. Dept. of Gynecological Endocrinology and Reproductive Medicine, University of Bonn, 53105, Bonn, Germany目的:研讨细胞遗传畸变是否与特定的精子和激素异常有关.方法:研究了305对不育夫妇,所有男性均进行全面的男科检查,包括体检、激素测定、HIV检测及精液分析.用标准方法和孵育的外周血淋巴细胞,对夫妇双方进行细胞遗传学分析.结果:在305对夫妇中,10名男性(3.2%)及10名女性(3.2%)表现出染色体组成异常,包括易位(n＝7),Robertsonian易位(n＝3),倒置(n＝3),其它结构异常(n＝4)以及性染色体异常(n＝3).多数病人除精子数量减少外,顶体缺陷的精子比例亦有增加.结论:染色体异常可能是不育夫妇受精和受孕率低的原因之一. 关键词:男性不育;胞浆内精子注射;染色体异常胚层细胞电穿融合形成鸡杂合体S. Aritomi, N. FujiharaDivision of Animal Resource Science, Faculty of Agriculture,Kyushu University Graduate School, Fukuoka 812-8581, Japan目的:通过电穿孔法融合胚层细胞并转移至受体胚胎,从而建立形成体细胞和胚细胞杂合小鸡的技术,并希望能产生睾丸样组织和带有特异性W-染色体基因的精子.方法:取新鲜的、能孵化且未孵育过的白色来亨鸡蛋和红色罗德岛鸡蛋若干,从中分离出X期囊胚层细胞,用电穿孔法融合之.将处理过的细胞悬液转移到恢复介质中(含10%牛胎血清的Delbecco's modified Eagle介质),然后注入至未孵育过的受体胚胎细胞(X期)的胚下腔中.结果:177个注射融合胚层细胞的受体胚胎中,6个(3.4%)成功孵育.在其羽毛的黑色素细胞中检测到体细胞杂合体.其中1鸡(16.7%)观察到源于供体细胞的羽毛特征.孵育后21 d,5个胚胎中的2个进行了聚合酶链反应以分析各组织中W-染色体的特异性DNA.一鸡在胃中找到该DNA,另一只在两侧性腺及其它组织而不是胃中存在该DNA.结论:含有电融合胚层细胞的受体胚胎可以更加成功地产生体细胞和胚细胞杂合鸡. 关键词:鸡胚层;电穿孔法;杂合体
