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感觉和运动神经源性雪旺细胞与神经元共培养神经生长因子mRNA的表达
临床上修复神经缺损使用自体神经移植体时，神经感觉功能恢复较运动功能好，这可能与移植神经取自感觉神经有关，这种神经特异性再生的机制目前认为有多种机制参与［1］，而神经损伤后初雪旺细胞是远段神经的唯一成分，而且雪旺细胞被证实可以分泌包括神经生长因子(NGF)在内的多种神经营养因子［2］，因此我们以感觉和运动神经来源的雪旺细胞为研究对象，以NGF为指标，研究两种雪旺细胞与神经元共培养后NGF mRNA的表达是否有差异，探讨这种差异对神经特异性再生的作用。 一、材料和方法 1.雪旺细胞和神经元的体外培养：感觉性和运动性雪旺细胞、感觉和运动神经元的体外共培养参考文献［3，4］的方法。简要步骤如下：无菌条件下，分别取5 d龄SD乳鼠的背根神经(感觉性雪旺细胞)和股神经肌支(运动性雪旺细胞)，14 d龄SD胚鼠背根神经节(感觉神经元)和脊髓前角(运动神经元)，剪碎成糊状；分别置入离心管中，加入0.125%胰蛋白酶+0.03%Ⅳ型胶原酶(Sigma公司)，消化30～40 min；1 500 r/min离心5 min；用DMEM/F12(Gibco公司)培养基将沉淀混悬成悬液，接种到培养皿中；37 ℃，体积分数为5%CO2细胞培养箱中孵育；雪旺细胞在48 h添加阿糖胞苷(5×10 -8 μg/L)，抑制成纤维细胞，第4天按1×109个/L的密度传代接种到6孔培养板盖玻片上，2 d后接种原代培养神经元细胞，这样就获得感觉性雪旺细胞和感觉神经元、运动性雪旺细胞和运动神经元的共培养。 2.共培养细胞NGF mRNA的表达：NGF mRNA表达的检测采用武汉博士德公司原位杂交检测试剂盒(MK1032型)提供的方法进行。简要步骤如下(以下溶液中均含有0.1%焦炭酸二乙酯)： 4%多聚甲醛固定液30 min；磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤3次；甲醇(含体积分数为0.03%过氧化氢)30 min；PBS洗涤3次；灭菌水洗涤3次；蛋白酶K，37 ℃，10 min；灭菌水洗涤3次；地高辛标记的cDNA探针和无关序列在杂交液内首先经过100 ℃，8 min的变性处理，然后置于碎冰中3 min，滴加到盖玻片上，上面覆以专用盖片(Sigma公司)；37 ℃孵育20 h；2 5 ℃的2×SSC(氯化钠17.4 g，柠檬酸钠8.8 g溶于1 000 ml水中)洗涤2次；37 ℃的0.1 ×SSC洗涤1次；加入封闭液，不洗；加入抗地高辛抗体，34 ℃孵育30 min；TBS(氯化钠30 g，三羟甲基氨基甲烷1.2 g，纯乙酸0.5 ml溶于1 000 ml水中)洗涤；加入酶标二抗， 34 ℃孵育20 min；TBS洗涤；加入显色液，34 ℃显色30 min；灭菌水洗涤，中止反应。显微镜下观察、比较。 二、结果 感觉和运动雪旺细胞与相应神经元混合培养后，第3天分别进行NGF mRNA原位杂交，图1为运动性雪旺细胞NGF mRNA表达染色，图2为感觉性雪旺细胞的表达，图3为空白对照，图中黑褐色染色颗粒的多寡即代表NGF mRNA表达量的多少。由图中可见，感觉性雪旺细胞NG F mRNA的表达颗粒明显较运动性雪旺细胞密集，而运动性雪旺细胞的表达接近于空白对照。
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多个免疫组化指标检测效果的方法探讨
免疫组化技术在医学科学研究中虽已广泛应用,但在实际操作中常会遇到一些技术上的困难和问题,致使免疫组化检测的效果差,特异性阳性结果不高,着色浅,非特异性染色过深等现象.我们经过反复比较摸索出一套可以防止、减少或者消除这些现象和增强其检测效果的办法,现介绍如下.1材料与方法1.1免疫生化试剂SP试剂盒、DAB试剂盒、单克隆抗体购于北京中山生物技术有限公司系美国ZYMED公司的产品1.2标本收集1995～1999年的46例经病理诊断的宫颈癌和38例慢性宫颈炎的活检标本.
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牛膝醇提物对Aβ42聚集的抑制作用
目的:观察牛膝醇提物(Nx-E)对Aβ42聚集的抑制作用.方法:Aβ42单独或和Nx-E在37℃,5%CO2培养箱中孵育后,采用硫磺素T(Th-T)荧光分析以及透射电镜观察Aβ42的聚集程度.结果:1 μg*μl-1Aβ42孵育7 d后荧光强度明显升高,电镜观察发现Aβ42以淀粉样纤维结构为主,呈针状聚集;低、中、高三个剂量(7.5、15、30μg*μl-1)的Nx-E与Aβ42共同孵育7 d后,中、高剂量Nx-E与Aβ42的共同孵育产物荧光强度比Aβ42单独孵育明显减弱;形态学观察纤维样结构减少,无定形结构增加,存在大量散在的颗粒.结论:1 μg*μl-1Aβ42孵育7 d已"老化";15和30 μg*μl-1的Nx-E能在一定程度上抑制Aβ42聚集.
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姜黄素体外抑制Aβ42聚集和毒性作用及结合老年斑的研究
目的 为了研究姜黄素对β-淀粉样多肽42 (Aβ42)聚集和神经毒性的影响,以及姜黄素对阿尔茨海默病(AD)患者脑组织中老年斑的结合情况.方法 通过硫磺素T(Th-T)荧光分析Aβ42蛋白体外聚集特点和姜黄素对Aβ42聚集的抑制作用;应用培养的SK-N-SH细胞、MTT法观察不同孵育时间的Aβ42神经毒性以及姜黄素对神经毒性的影响;利用姜黄素自发荧光特性观察其对AD病人海马组织石蜡切片中老年斑的结合作用.结果 Th-T荧光分析结果显示随着孵育时间的延长,Aβ42的荧光强度逐渐加强,在6d时荧光强度明显增加(P＜0.01),加入姜黄素(20μmol/L)能够显著降低Aβ42的荧光值;孵育时间超过0.5d的Aβ42对SK-N-SH细胞均可产生毒性作用,细胞存活率、细胞突起和长度均减小.而经姜黄素(20 μmol/L)治疗后,SK-N SH细胞存活率明显升高,细胞突起增多、变长;姜黄素还能够特异性标记AD病人海马组织中Aβ40/42抗体免疫阳性和免疫阴性老年斑.结论 姜黄素能够有效抑制Aβ42体外聚集,并减小其神经毒性.在AD病人海马组织切片上,姜黄素能够特异性结合AD病人脑中沉积的老年斑,具有比抗体更广泛的老年斑结合能力.上述结果提示姜黄素有可能成为阻止AD发生和阻断疾病进展的治疗性药物.
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N-乙酰半胱氨酸对LPS诱导离体兔肺动脉反应性改变的影响
目的:内毒素的活性成分脂多糖(LPS)所致动物肺损伤常伴有肺动脉高压(PAH).LPS是否通过抑制肺动脉内皮依赖性舒张作用而促进PAH的形成,目前还不清楚.Bernard等报道N-乙酰半胱氨酸(N-Acetylcysteine, NAC)可改善内毒素所致的肺损伤.本研究旨在离体水平观察NAC对LPS引起的肺血管反应性改变有何影响,并探讨其细胞保护作用.方法:制备离体兔肺动脉环.①对照组,培养基中加入生理盐水溶剂;②LPS组,培养基中加入LPS 4 μg/mL;③LPS+NAC组,培养基中含LPS 4 μg/mL及NAC 0.5 mmol/L; ④NAC组,培养基中含NAC 0.5 mmol/L.各组孵育3 h、7 h,观察肺动脉环对新福林(PE)的收缩反应及对乙酰胆碱(Ach)的内皮依赖性舒张反应.光镜下观察血管形态结构改变.数据用均数±标准差(±s)表示,差异显著性检验行多样本均数的t检验,P＜0.05为有显著性差异.结果:①LPS孵育3 h、7 h时肺动脉环对Ach(10-6 mol/L)的内皮依赖性舒张百分比分别为60.70%±12.7%、60.76%±9.85%,显著低于同时间点的对照组84.04%±6.37%、76.80%±2.69%(均为P＜0.05),Ach剂量反应曲线(10-8～10-5 mol/L)右移.与LPS组相比,NAC和LPS共同孵育3 h、7 h肺动脉对Ach(10-6 mol/L)的舒张百分比均增高,分别为75.41%±9.98%、77.84%±10.48%,(均为P＜0.05),Ach剂量反应曲线(10-8～10-5 mol/L)左移.LPS孵育3 h、7 h均不影响肺动脉环对PE的收缩反应.②光镜下可见:LPS组内皮细胞肿胀、脱落,内皮下弹力纤维有断裂,平滑肌细胞水肿.NAC可减轻血管壁各层的形态学改变.结论:①LPS可导致离体兔肺动脉内皮依赖性舒张反应减弱,这可能是内毒素肺损伤时肺动脉高压的原因之一;②NAC可调整肺动脉的张力,使LPS所致的肺动脉内皮依赖性舒张反应减弱得以恢复,并可减轻LPS引起的血管内皮及平滑肌细胞损伤,从而发挥其细胞保护作用.
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氯高铁血红素诱导HO-1基因在乳鼠心肌细胞中的表达及其细胞保护作用
目的:观察血红素加氧酶-1(heme oxygenase, HO-1)的底物氯高铁血红素诱导培养的乳鼠心肌细胞HO-1基因表达的规律,以及该基因的表达对心肌细胞过氧化损伤的作用. 方法:取生后2～3 d的Wistar鼠若干,雌雄不限,摘取心脏,剪碎至1 mm×1 mm×1 mm大小,胰酶消化法分离、培养乳鼠心肌细胞后,以不同浓度的氯高铁血红素孵育1 h;以及在20 μmol/mL浓度下分别孵育不同时间,提取细胞总RNA,以Northern杂交技术观察氯高铁血红素诱导HO-1基因在乳鼠心肌细胞表达的剂量依赖性和时间依赖性.同时以黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶氧自由基发生系统作用于氯高铁血红素诱导的心肌细胞,通过测定细胞的LDH释放量、MDA生成量及细胞存活率以研究HO-1表达后的抗自由基损伤作用.结果:在培养的乳鼠心肌细胞,氯高铁血红素可以诱导HO-1表达,两者之间存在着浓度依赖性和时间依赖性关系;而且该基因的表达增高能够增强乳鼠心肌细胞抗氧自由基损伤的能力,表现为与对照组相比,细胞的LDH释放量、MDA生成量明显降低及细胞存活率明显增加.这种保护作用可以被HO-1的特异性抑制剂部分阻断,说明HO-1基因表达具有一定程度的抗心肌细胞过氧化损伤的作用.
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ISO通过ADPRC、PI3K－Akt和FOXO3a上调MMP－9促进血管平滑肌细胞增殖与迁移
目的：探讨ISO引起的VSMC增殖与迁移的分子机制。方法：将培养的大鼠VSMC随机分为5组：（1）对照组，加0．9％NaCl；（2）ISO组，加ISO （10－7 mol／L）；（3）ISO＋β－受体阻断剂组，加ISO同时给心得安（PROP，10－6 mol／L）；（4）ISO＋AD－PRC抑制剂组，加ISO同时给ADPRC抑制剂2，2－二羟基偶氮苯（DHAB，10－6 mol／L）；（5）ISO＋Akt抑制剂组，加ISO同时给Akt抑制剂LY294002（LY，10－6 mol／L）。孵育24 h后，采用细胞划痕实验和检测α－SMA判断VSMC的增殖与迁移。采用Western blot检测ADPRC表达及Akt、FOXO3a、phospho－FOXO3a、MMP－9等分子的变化。结果：与对照组相比，ISO组细胞增殖、迁移明显，ADPRC表达升高，Akt、FOXO3a、phospho－FOXO3a 和MMP－9明显上调；与ISO组相比，ISO＋PROP组、ISO＋DHAB组和ISO＋LY组细胞增殖与迁移程度均明显降低，Akt、FOXO3a、phospho－FOXO3a 和MMP－9明显下降，表明PROP、DHAB或LY294002分别通过阻断ADPRC表达、抑制ADPRC活性或阻断下游信号通路减轻ISO引起的VSMC增殖与迁移。结论：ISO引起ADPRC表达增多，后者通过PI3K－Akt磷酸化FOXO3a，上调MMP－9促进VSMC的增殖与迁移。
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同型半胱氨酸抑制缺氧诱导猪冠状动脉痉挛的机制研究
目的：持续缺氧可通过激活PI3K／Akt／Rho激酶信号通路引发冠状动脉痉挛，同型半胱氨酸（ Hcy）的血浆浓度升高是心血管疾病的一个重要危险因素，本研究旨在探讨Hcy对缺氧诱导猪冠状动脉痉挛的影响及其可能机制。方法：离体血管环灌流实验测定猪离体冠状动脉的张力变化；免疫印迹检测磷酸化与总的MLC、Akt和MYPT1蛋白表达水平。结果：持续缺氧15 min以上可引起猪冠状动脉的持续收缩，预孵育Hcy（0．1～1 mmol／L）30 min，可以浓度依赖性地抑制缺氧诱导的冠脉收缩；而预孵育相同浓度的Hcy对该收缩无影响。缺氧15 min时冠状动脉p－MLC （ Ser19）蛋白水平显著降低，持续缺氧60 min时p－MLC （Ser19）水平较缺氧15 min时升高。预孵育Hcy（1 mmol／L）30 min，对缺氧15 min引起的p－MLC（Ser19）蛋白水平降低无影响，但抑制了缺氧60 min时p－MLC（Ser19）的升高。预孵育Hcy（1 mmol／L）30 min对持续缺氧引起p－Akt（Ser473）的变化影响不大。结论：Hcy可能通过激活Rho激酶改善缺氧诱导猪冠状动脉非内皮依赖的收缩。
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NO、CO在LPS诱导的离体兔肺动脉舒张反应下降中的作用
目的:探讨脂多糖(LPS)所致离体肺动脉反应性张力变化与肺动脉内源性一氧化氮( NO)、一氧化碳(CO)的关系.方法:制备离体兔肺动脉环.①对照组,培养基中加入生理盐水溶剂;②LPS组,培养基中加入LPS 4 μg/mL.两组孵育7 h,检测肺动脉环对10-6 mol/L新福林(PE)的收缩反应及对l0-6 mol/L乙酰胆碱(ACh)的内皮依赖性舒张反应,以及一氧化氮合酶(NOS) 抑制剂氨基胍(AG)和N+-硝基-L-精氨酸(L-NNA),血红素氧合酶-l(HO-1)抑制剂锌卟啉原(ZnPP)预孵育20 min后,肺动脉环对PE及ACh反应性的改变.结果:①LP S孵育7 h时肺动脉环对ACh的内皮依赖性舒张百分比显著低于对照组(P＜0.05),而不影响肺动脉环对PE的收缩反应;②两组用10-4 mol/L AG、10-5 mol/L ZnPP预孵育20 min后,LPS组对 ACh的舒张百分比显著降低,对PE的收缩值显著增加(均P值＜0.01),对照组对ACh的舒张百分比均无显著改变. 10-4 mol/L-NNA预孵育20 min后,两组对ACh反应均表现收缩,对PE的收缩反应较孵育前(对照)均显著增加(P＜0.01),而与AG孵育后的PE收缩值比较,LPS组无显著差异,对照组显著增加.讨论:内皮源性NO在血管张力的调控上起重要作用,ACh为内皮依赖及受体依赖性舒血管物质,内皮源性NO介导其舒张反应.实验结果表明,LPS孵育后,肺动脉内皮依赖性舒张反应显著降低,对PE收缩反应无明显变化,提示LPS可能直接损伤了肺动脉内皮细胞功能, 如抑制cNOS活性,妨碍NO生成与释放;AG预孵育后LPS组对PE收缩显著增强,提示,LPS可引起iNOS诱生;ZnPP预孵育后LPS组收缩反应显著增强,ACh舒张百分比下降,溶剂对照组收缩反应也增强,但ACh舒张百分比与孵育前比较无显著差异.提示:CO参与生理和病理情况下的血管张力的调控.结论:①LPS可导致离体兔肺动脉内皮依赖性舒张反应减弱;②LPS对肺血管的损伤作用与NO有关,提示LPS可使内皮cNOS活性下降,CO在LPS损伤中起一定的作用,但其与NO的关系有待于进一步探讨.
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外源性一氧化氮对肺动脉血管平滑肌细胞血红素氧化酶-1/一氧化碳的影响
目的: 观察外源性一氧化氮(NO)供体-SIN-l(3-morpholinosydnonimine,SIN-1)对肺动脉血管平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cell,PASMC)血红素氧化酶:1(heme oxy genase-l,HO-1)/一氧化碳(CO)信号系统的影响.方法: 采用贴块法培养大鼠PASMC.分别以终浓度为0.1 mmol、0.5 mmol和1.0 mmol的SIN-l与PASMC孵育4 h,以1.0 mmol的SIN -1分别孵育1 h、2 h、4 h、8 h和16 h.应用RT-PCR检测HO-l mRNA表达,应用免疫组化法检测HO-l和AP-l两个亚单位c-f os和c-jun的表达,测定培养基中CO水平.结果:0.1 mmol、0.5 mm ol和1.0 mmol的SIN-1孵育4 h、1.0 mmol的SIN-l孵育1 h、2 h、4 h、8 h和16 h使PASM C HO-1 mRNA和蛋白表达、培养基中CO水平呈时间和剂量依赖性增加,1.0 mmol的SIN-l使PASMC AP-1蛋白表达在8 h内显著增强.讨论: 目前,CO和NO之间的相互关系已成为新的研究热点,二者之间的协调关系对于维持机体正常的血管张力及充足的血液供应具有重要的生理及病理生理意义.本实验通过对不同浓度NO供体-SIN-1作用不同时间后PASMC的CO和HO-l变化的观察,发现NO可呈剂量及时间依赖方式使PASMC的HO-l表达及HO酶活性增强、CO产生增多,表明NO是PASMC HO-l表达的强诱生剂.通过对PASMC AP-l的两个亚单位c-fos和c-jun的免疫组化检测显示,给予NO供体后其阳性染色明显增强,提示AP -l可能参与了NO对HO-1基因调控的信号转导过程.结论: 外源性NO可使P ASMC HO-1表达以及CO的产生增多,核因子AP-1可能参与了NO对HO-l调控的信号转导过程.
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八肽胆囊收缩素抑制脂多糖诱导的大鼠肺间质巨噬细胞NF-κB活性
目的:内毒素血症时单核-巨噬细胞释放过量炎症介质是导致休克甚至多器官衰竭的主要病理学基础.肺组织中存在3种巨噬细胞:肺泡巨噬细胞(alveolar macrophage,AM)、肺间质巨噬细胞(interstitial macrophage,IM)和肺血管内巨噬细胞.近来研究表明,内毒素血症时IM较AM更早受到LPS攻击,其吞噬功能、对补体的趋化作用及产生氧自由基的能力明显强于AM,在肺组织炎症反应中起重要作用.因此,有效控制肺IM的过度激活将对减轻肺组织炎症反应起到积极的保护作用.我们以往的研究表明八肽胆囊收缩素(cholecystokinin oct apeptide,CCK-8)具有明显的抗内毒素休克(endotoxic shock,ES)作用,可减轻ES大鼠肺、肝、肾组织炎症反应,抑制肺组织核转录因子κB(nuclear transcription factor kappa B,NF-κB)活性.原位PCR及免疫组织化学实验显示肺巨噬细胞有CCK受体表达,因此推测C CK-8可能通过与其受体相互作用来干预LPS激活肺巨噬细胞的过程.为深入探讨CCK-8抗ES 作用的分子机制,本研究以体外培养的大鼠肺IM为对象,观察CCK-8对脂多糖(lipopolysac charide,LPS)作用下NF-κB活性的影响.方法:分离大鼠肺IM,加入LPS ( 10 mg/L)、CCK(10-8、10-7、10-6 mol/L)、CCK受体拮抗剂丙谷胺(2 mg/L)及溶剂单独或共同孵育2 h.用电泳迁移率变动分析技术(electrophoretic motility shift assay,EMSA),检测肺IM NF-κB 活性,用免疫组织化学技术观察p65、p50在肺IM中的表达及分布.结果:(1) CCK-8(10-8、10-7、10-6 mol/L)可明显抑制LPS诱导的肺IM NF- κB活性,并呈明显的剂量依赖性,用丙谷胺预孵育肺IM可拮抗CCK-8的作用;(2)LPS作用2 h,肺IMp65、p50核内表达明显增加,而CCK-8预孵育肺IM则可显著减少p65、p50核移位.结论:CCK-8可抑制LPS诱导的肺I M NF-κB活性,该作用是由CCK受体介导的,在减轻ES时肺组织炎症反应中具有重要意义.
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复方SZ滴眼液抑制晶状体上皮细胞凋亡及其信号转导机制的实验研究
目的:探讨复方SZ滴眼液(Co-SZ)抑制H2O2诱导的晶状体上皮细胞(LEC)凋亡的作用及信号转导机制.为将Co-SZ作为防治白内障的有效药物提供科学的实验依据.方法:1、将H2O2与Co-SZ和SD大鼠晶状体共同孵育后:(1)TUNEL法检测LEC凋亡率.(2)透射电镜观察LEC凋亡形成.2、H2O2与Co-SZ和体外培养的牛LEC共同孵育后:(1)四甲基偶氮唑蓝法(MTT)检测不同浓度的Co-SZ抑制LEC活性的作用.(2)流式细胞仪(FCM)检测LEC细胞核内DNA含量.(3)荧光分光光度法检测LEC内游离Ca2+浓度.(4)放射免疫分析法检测LEC内环化腺苷酸(cAMP)和环化鸟苷酸(cGMP)浓度.
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尾加压素II介导卵圆细胞增殖的机制探讨
目的：探讨尾加压素II（ UII）对肝脏干细胞即卵圆细胞内活性氧（ ROS）的影响及其参与UII促细胞增殖的机制探讨。方法：通过流式细胞术，应用DCFH－DA探针检测UII孵育卵圆细胞WB－F344后，胞内ROS水平变化。通过Western blot方法检测胞内NADPH氧化酶亚基、细胞周期蛋白E、细胞周期蛋白依赖性激酶2及信号通路蛋白ERK表达水平。采用流式细胞术方式分析UII对于细胞周期的影响。应用BrdU掺入法检测细胞增殖情况。结果：UII刺激卵圆细胞可引起胞内ROS水平增加，同时NADPH氧化酶亚基表达上调。给予NADPH氧化酶抑制剂apocynin预处理后，明显改善UII介导的ERK磷酸化水平升高。此外，UII孵育组细胞周期比例S期明显高于G1期，而apocynin预处理组S期比例较UII刺激组有所降低，且细胞增殖检测结果显示apocynin预处理可使UII介导的促细胞增殖效应受到明显抑制。结论：UII可通过上调细胞内NADPH氧化酶介导ROS增加，继而促进ERK激活以及加速细胞从G1期进入S期，参与UII促细胞增殖作用。
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血浆硝酸盐水平作为血管内皮一氧化氮合成的生化指标
目的体外实验表明血管内皮细胞能合成一氧化氮(Nitric oxide,NO),而反映活体NO合成的直接生物化学证据,尚未见报道.因此,本文研究了体外NO气体与鼠动脉血孵育和活体鼠腹腔注射乙酰胆碱(Acetylcholine, Ach)对血浆硝酸盐水平影响.
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雷公藤多甙对肾小球系膜细胞细胞因子生成的影响
雷公藤多甙(TW)对大鼠肾小球系膜细胞(GMC)具有抑制增殖的作用[1],但TW对GMC细胞因子生成的影响尚未见报道.我们利用小鼠GMC体外培养技术,除采用直接加药方法外,还采用多氯联苯诱导的大鼠肝匀浆(S9)-多种功能氧化酶代替体内的代谢活化系统与药物共同孵育后[2],加入细胞培养体系中.在模拟体内药理效应的前提下,观察TW对GMC细胞因子生成的影响.
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多发性硬化患者淋巴细胞Fas和FasL的表达
赵忠新黄坚庄建华邵福源实验科张玲珍报道选择31例符合Poser诊断标准的多发性硬化(MS)患者及20例正常人为对照组为研究对象.MS复发期23例,男10例,女13例,年龄16～53岁,平均(34.1±9.2)岁;缓解期8例,男3例,女5例,年18～41岁,平均(30.9±7.7)岁.MS和对照组除外标准:其他自身免疫性疾病、肿瘤、近期感染、组织损伤、3个月内应用免疫抑制剂.用流式细胞仪检测血和脑脊液(CSF)Fas和FasL的表达,Fas用直接法;全血或CSF 100μL,分别加入FITC标记的Fas单抗,孵育30min;FasL用间接法:全血或CSF 100μL分别加入FasL单抗,孵育30min后,PE标记的二抗孵育30min,经溶红细胞、稀释和固定后,24 h内上流式细胞仪分析.操作中根据不同白细胞前向和侧向光散射的不同可区分淋巴、单核和中性粒细胞.每个样本分析5000个细胞,结果以阳性细胞的百分率表示.
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035 快速检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的培养基
目前,耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)是医院感染中常见、严重的多重耐药菌株.MRSA的检测是控制医院感染的重要手段.传统培养基的NaCl浓度较高(8.5%),使多数MRSA起始的生长速度受抑、需孵育48h,且可抑制部分MRSA的生长.本文作者介绍用一种固体筛选培养基(MAMSA)快速(20h)检测MRSA.
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细胞培养实验课教学体会
细胞培养主要是指细胞在体外条件下的培养技术,亦即在无菌情况下,从动物活体内取出组织,用机械或消化的方法分散成单个细胞悬液,在模拟体内生理环境等特定的体外条件下进行孵育培养,使之生存并生长.细胞培养可分为原代培养和传代培养,其中原代培养是细胞培养中重要的,是传代培养的前提,也是后续实验,如细胞骨架检测,表达蛋白测定,细胞周期检测和细胞表面抗原检测等实验的重要基础.如果原代培养不能成功,则将严重影响整体实验的进度.
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人胸腺细胞与小鼠脾细胞体外共同孵育的MTT比色法测定
为了观察人胸腺细胞与小鼠脾细胞的关系,我们运用了M TT比色法进行体外测定.人胸腺取材于胸外科手术及妇产科手术,年龄在5月-6岁范围内.将胸腺块消毒、剪碎并研磨,尼龙网过滤后进行体外原代细胞培养,T细胞密度与小鼠脾细胞密度均为1x106/ml,培养基为DMEM,添加15%小牛血清、25mM hepes、4mM谷氨酰胺、10μM 2-巯基乙醇、2mM丙酮酸钠、100U/ ml青霉素及100μg/ml链霉素,37℃、5% CO2孵箱孵育1月.60μl 人卵巢癌细胞与60μl人胸腺细胞体外共同孵育作为实验组,60μl DMEM与60 μl人胸腺细胞孵育作为阴性对照.2天后,进行96孔板MTT比色法体外测定T细胞活率 .10μlMTT溶液加入每孔中,将96孔板置于孵箱中,4小时后,100μl 20% SDS加入每孔中,过夜后检测OD值.实验组的OD值(OD＝0.0462,平均1 .3287±0.3538)高于阴性对照组(OD＝0.045,平均0.5270±0 .0582),P＜0.01,说明小鼠脾细胞能促使人T细胞增殖.
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胰岛B细胞、A细胞的快速双染
组织学特殊染色技术及免疫组织化学技术已广泛应用于基础医学和临床医学的科研工作中.本快速染色法即用组织学醛品红染色法和免疫组织化学SP法在同一张切片上对胰岛B细胞和A细胞进行了双重染色,取得较好的效果,现作简单介绍.取大鼠胰腺,Bouin液固定,石蜡包埋,切5μm厚切片.双染步骤如下:第一步,胰岛B细胞的醛品红染色:切片脱蜡到水;入0.25%浓硫酸和0.25%高锰酸钾等量混和液中3min;蒸馏水洗后入5%草酸2min;蒸馏水洗;再经70%酒精后入醛品红染液15min;70%酒精分色后,蒸馏水洗.第二步,胰岛A细胞的免疫组化染色:将经醛品红染色后的切片,入3%甲醇双氧水室温孵育15min;蒸馏水洗后枸橼酸缓冲液(0.01M,pH6.0)(电炉加热煮沸92 ℃～98℃)进行抗原修复10min;PBS浸泡5min后,用正常羊血清室温封闭3 0min;弃去多余羊血清,滴加一抗(抗胰高血糖素抗体,1∶1500),37℃,孵育2hr;PBS室温洗10min后,滴加生物素标记的二抗,37℃,孵育40min ;PBS室温洗10min后,滴加辣根酶标记的链霉卵白素工作液,37℃,孵育40m in;PBS室温洗10min,DAB显色.结果及讨论:此染色方法在同一张切片上所观察到的胰岛B细胞呈蓝紫色,而胰岛A细胞呈棕黄色,两者颜色对比清晰.细胞核不着色.本方法可在一个工作日内完成,即提高了工作效率,又减少了免疫组织化学多重染色中步骤多、时间长,易受外界因素影响的限制,进而降低了非特异性染色.因此,该方法在科研工作中具有一定的应用价值.
