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PM2.5颗粒物引起血管内皮细胞氧化损伤的研究
目的探索PM25颗粒物引起心血管疾病的机制.方法ECV304细胞暴露于不同浓度的PM2.5颗粒物混悬液(50、200、400μg/ml),染毒24小时后运用MTT法测细胞存活率、测定细胞内SOD和GSH含量、并进行流式细胞仪分析凋亡来综合分析.结果随着染毒浓度上升,ECV304细胞存活率逐渐下降,死亡率逐渐上升;染毒浓度为50、200、400μg/ml,细胞内GSH含量(mg/g prot)分别为20.643±2.167、16.774±2.911(P＜0.05)、15.658±3.471(P＜0.01),S0D含量(U/mg prot)为5.878±0.401、5.140±0.448(P＜0.01)、4.817±0.451(P＜0.01).结论PM25可通过氧化损伤途径使血管内皮细胞死亡,导致心血管疾病的发生.
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竹根七中具有血管生成抑制作用有效成分的筛选
目的 研究竹根七中对人脐静脉内皮细胞株(ECV304)生长有抑制作用的有效成分.方法 用溶剂提取法将竹根七分为不同药用部位,以抗血管内皮细胞生长因子(VEGF)抗体为对照,用人脐静脉内皮细胞膜色谱模型筛选,并对筛选结果用MTT实验进行分析,以初步确定其中的有效成分.结果 竹根七的分离成分(ZGQ-C)在其浓度分别为0.625、1.25、2.50、5.00、10.0 μg/mL时,对ECV304的增殖抑制率分别为40.51%、51.11%、63.54%、74.32%、81.26%.半数抑制率在1.00～1.25 μg/mL范围内;同时在显微镜下观察到细胞的形态有明显的改变.结论 ZGQ-C是对ECV304有一定抑制作用的有效成分;人脐静脉内皮细胞膜色谱模型的筛选结果与MTT实验结果之间有较好的相关性.
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弱氧化修饰低密度脂蛋白诱导ECV304组织因子基因表达及银杏内酯B的抑制作用
为研究弱氧化修饰低密度脂蛋白(mmLDL)对ECV304组织因子(TF)蛋白含量和mRNA水平的影响、对胞浆游离钙离子([Ca2+]i)的影响,以及银杏内酯B等的干预作用.采用ELISA法检测细胞内TF蛋白含量,用RT-PCR法检测细胞内TF mRNA水平,用激光共聚焦显微镜观察[Ca2+]i的变化.结果显示,40mg/L mmLDL作用ECV304 4h,能使TF蛋白含量及mRNA水平显著增加,并迅速升高[Ca2+]i.抗氧化剂银杏内酯B及PKC抑制剂Staurosporine可拮抗mmLDL的上述诱导反应.以上结果提示,mmLDL 可诱导ECV304 TF表达,Ca2+与PKC 参与mmLDL诱导ECV304 TF基因表达过程,并且银杏内酯B可抑制mmLDL的此种效应.
关键词： 弱氧化修饰低密度脂蛋白 组织因子 钙 ECV304 银杏内酯B -
凉血活血复方对体外培养HaCaT、ECV304细胞端粒酶活性的影响
目的 观察凉血活血复方水醇粗提液时人永生化表皮细胞株(HaCaT)和人脐静脉血管内皮细胞株(ECV304)端粒酶活性的影响,探讨该复方治疗银屑病可能的作用机制.方法 将不同浓度的凉血活血复方水醇粗提液分别地作用于体外培养的HaCaT和ECV304细胞株,应用端粒重复序列扩增一酶联吸附(TRAP-ELAISA)试剂盒检测两株细胞的端粒酶活性.结果 凉血活血复方分别作用两株细胞48h,细胞端粒酶活性在所测定实验浓度范围内,随浓度的增加时细胞的端粒酶活性的下调作用逐渐增强.各加药组与对照组在统计学上有显著性差异,且各加药组之间差异亦有统计学意义(P＜0.01).结论 凉血活血复方以剂量依赖性抑制端粒酶活性.
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硫酸多糖916对细胞因子和H2O2诱导ECV304细胞产生一氧化氮的影响
目的研究硫酸多糖916(PS916)对TNFa、IL-1β和H2O2诱导ECV304细胞产生一氧化氮(NO)的影响.方法用Griess试剂测定ECV304细胞产生的NO,用MTT法测定细胞的增殖,用荧光法测定NO合酶的活性. 结果 40ng/ml TNFa和40ng/ml IL-1β使ECV304细胞NO产生下降,0.1mmol/L H2O2使NO的产生增加.PS916剂量依赖性增加TNFa、IL-1β诱导的ECV304细胞NO的产生,降低H2O2诱导ECV304细胞产生的NO.TNFa和H2O2抑制ECV304细胞的增殖,而IL-1β对ECV304细胞的增殖没有明显影响.PS916剂量依赖性的抑制TNFa和H2O2的作用,增加存活细胞数.在体外,PS916对细胞的NO合酶无明显的影响.结论 PS916在体外实验中对细胞因子和H2O2引起的ECV304细胞损伤有拮抗作用,对细胞表现出明显的保护作用.
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晚期氧化蛋白产物通过ERK通路促进ECV304细胞基质细胞衍生因子-1α的表达
目的:观察晚期氧化蛋白产物(AOPP)对ECV304细胞基质细胞衍生因子1α(SDF-1α)表达的影响,并探讨其作用机制.方法:牛血清白蛋白(BSA)与次氯酸钠等量混合体外制备AOPP-BSA,不同浓度AOPP-BSA作用后以RT-PCR法检测ECV3O4细胞SDF-1α mRNA的表达,Western-blot法测定SDF-1α以及磷酸化细胞外信号调节激酶(p-ERK)蛋白水平,阻断实验中先以不同浓度的ERK特异性阻断剂U0126与ECV304孵育1h,然后与AOPP-BSA共同孵育24h,酶联免疫吸附法测定上清液中SDF-1α蛋白浓度.结果:AOPP呈浓度依赖性的促进ECV304细胞SDF-1αmRNA表达及蛋白合成增加(P均＜0.01),200μmol/L AOPP-BSA作用15 min后ERK1/2磷酸化水平明显增强(P＜0.01),阻断ERK1/2通路显著抑制AOPP对ECV3O4细胞SDF-1α蛋白合成的促进作用(P＜0.05).结论:AOPP可诱导ECV3O4细胞SDF-1α的表达,ERK1/2通路是介导这一作用的重要途径之一.
关键词： 晚期氧化蛋白产物 基质细胞衍生因子1α ECV304 ERK -
不同细胞饲养层对HL-60白血病细胞株增殖分化的影响
目的:研究不同细胞饲养层对HL-60白血病细胞株增殖的影响.方法:利用人的骨髓基质细胞(BMSC),皮肤成纤维细胞(SFB)及脐静脉内皮细胞株(ECV304)作为细胞饲养层,分别与HL-60白血病细胞株共培养5d,行细胞分类、计数检测HL-60细胞株的增殖分化情况.结果:BMSC及SFB饲养层均能抑制HL-60细胞株的增殖并促进其分化,BMSC略优于SFB饲养层,而ECV304细胞饲养层却无明显的促分化的作用,第五天才出现较弱的抑增殖作用.结论:BMSC及SFB饲养层能有效抑制HL-60癌株,可能是通过细胞与细胞间的接触或细胞因子、因素的近距离调节所致,ECV304该项能力较弱.
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养阴药物血清对内毒素诱导血管内皮细胞凋亡的影响
目的:研究养阴药物血清对内毒素诱导的血管内皮细胞凋亡的影响.方法:用低浓度LPS诱导ECV304凋亡,用中药血清与之作用,采用流式细胞仪检测细胞凋亡.结果:养阴药物血清可以明显抑制血管内皮的凋亡.同模型组比较有统计学意义.结论:养阴药物血清可明显拮抗内毒素诱导的血管内皮细胞的凋亡.
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RNA干扰技术沉默Smad4基因表达对ECV304细胞增殖和迁移的影响
目的:探讨利用RNA干扰技术下调Smad 4基因表达对人脐静脉内皮细胞增殖和迁移能力的影响,初步了解Smad 4在血管生成中的作用.方法:设计并合成靶向人Smad 4基因的小分子干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)片段siRNA1和siRNA2,脂质体介导转染入人脐静脉内皮细胞株ECV304.应用实时定量RT-PCR和Western印迹法检测转染前后Smad4基因表达水平;应用细胞周期分析和羧乙基锗倍半氧化物(6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester,CFSE)-流式细胞仪检测ECV304细胞转染前后细胞增殖能力的变化;通过单层细胞划痕实验观察细胞转染前后迁移能力的变化.结果:从2条siRNA中成功筛选出1条siRNA,干RNA和蛋白水平可明显下调Smad4基因的表达;ECV304细胞转染Smad4的siRNA后,细胞的增殖和迁移能力明显增强.结论:利用RNA干扰技术能够筛选出高效的特异阻断Smad 4基因表达的siRNA;Smad 4基因表达下调能够明显促进血管内皮细胞的增殖和迁移.
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抗人血管内皮生长因子发夹状核酶对人脐静脉内皮细胞ECV304的影响
目的 观察抗人血管内皮生长因子(VEGF)发夹状核酶对人脐静脉内皮细胞ECV304生物学特性的影响.方法 将抗人VEGF发夹状核酶(RZ)基因构建的pcDNA3.1+/RZ转染ECV304细胞,经G418筛选后,用RT-PCR法鉴定RZ基因在ECV304细胞中的转录,用MTT法和流式细胞仪检测转染前后ECV304细胞增殖活力和细胞周期,ELISA法检测细胞上清VEGF的表达水平.结果 RZ基因在ECV304细胞中获得转录,它不改变细胞增殖活力和细胞周期,但能明显下调VEGF的表达.结论 抗人VEGF发夹状核酶能够显著抑制ECV304细胞VEGF的表达,为进一步开展核酶的肿瘤基因治疗提供了实验依据.
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姜黄素抑制ECV304细胞增殖及对基质金属蛋白酶2表达的影响
目的:探讨姜黄素对人脐静脉内皮细胞(ECV304)的作用以及对ECV304表达的基质金属蛋白酶2(MMP-2)的影响.方法:采用MTT法,台盼蓝染色法测定姜黄素对ECV304的量效关系和时效关系,Giemsa染色观察姜黄素对ECV304的抑制作用;通过RT-PCR检测姜黄素作用ECV304后MMP-2 mRNA表达,明胶酶谱法检测MMP-2的活性,免疫组化检测细胞MMP-2表达.结果:姜黄素对ECV304的抑制作用呈浓度依赖性和时间依赖性,Giemsa染色显示浓度为8 μg/mL和10μg/mL的姜黄素可诱导ECV304凋亡,凋亡率分别是21.6%和34.7%;在10 μg/mL姜黄素作用24h下,MMP-2的mRNA显著减少,其分解明胶的活性也显著降低,免疫组化显示与阴性对照组相比内皮细胞MMP-2表达减少.结论:姜黄素能够抑制血管内皮细胞的生长、降低血管内皮细胞MMP-2的表达.
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沙立度胺对ECV304细胞增生的抑制作用研究
目的在体外探讨沙立度胺(thalidomide,反应停)抗血管新生的作用机制.方法MTT法检测反应停对人脐静脉内皮细胞株ECV304细胞增殖的抑制率;RT-PCR检测血管新生相关基因的表达;凝胶电泳迁移率实验(EMSA)检测反应停对NF-κB活化的影响.结果反应停对ECV304细胞增殖的抑制效应与药物浓度呈正相关(r=0.999,P＜0.001),当50μg/ml反应停处理72小时,其抑制率为34%;25μg/ml反应停处理24小时,ECV304细胞VEGF mRNA相对表达量明显低于对照组(0.48±0.14vs0.98±0.18,P=0.005);与对照组相比,IL-8 mRNA相对表达量无明显减少(5.77±0.44vs 5.99±0.52,P＞0.05);αv整合素亚基mRNA相对表达量明显低于对照组(0.47±0.13vs0.82±0.18,P=0.029),而β5整合素亚基mRNA相对表达量与对照组相比,差异无显著性(1.5±0.52vs 1.37±0.81,P＞0.05).当药物浓度为50μg/ml时,NF-κB转录因子活性明显降低,且其对NF-κB活化的抑制与药物浓度有关.结论反应停抑制血管新生可能与其通过直接抑制内皮细胞增殖、下调VEGF和αv整合素亚基表达以及抑制NF-κB的活化等多个环节有关.
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黄芩苷与缺血/再灌ECV304细胞共培养上清对血小板活化功能的影响
目的:研究黄芩苷(Baicalin)与缺血/再灌ECV304细胞上清对血小板早期活化和释放反应的作用.方法:以连二亚硫酸钠造模,建立ECV304细胞缺血/再灌模型,选择黄芩苷适浓度,并采用流式细胞术分析方法,以血小板表面分子活性标志GPⅡb/Ⅲa复合物(PAC-1)及GMP-140(CD62P)表达为指标,进行细胞上清与血小板及致聚剂(ADP)共同作用实验.结果:①缺血/再灌模型是实验的关键,应选用6mmol/L连二亚硫酸钠造模;②黄芩苷影响血小板活化,PAC-1表达从大激活的12.29%下降至4.51%,总激活率从大激活的61.02%下降至29.21%.结论:黄芩苷可能具有抗血小板活化作用,并且以抑制早期激活的GPⅡb/Ⅲa复合物表达为主.
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姜黄素对过氧化氢诱导的血管内皮细胞损伤的双重作用
目的:研究姜黄素(Cur)对过氧化氢(H2O2)诱导的血管内皮细胞ECV304的作用及可能机制;方法:胎盘兰计数法分组观察在不同的时间点加入姜黄素后对H2O2诱导的ECV304细胞氧化损伤的作用.流式细胞仪分析细胞周期及细胞凋亡率的变化,试剂盒检测一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)含量及超歧化物氧化酶(SOD)、谷胱甘肽还原酶(GR)活性的变化.结果:姜黄素0～100 μmol·L-1与H2O2 500 μmol·L-1同时作用5 h,随姜黄素浓度升高细胞存活率升高;25～100 μmol·L-1姜黄素预先作用1 h,再换为H2O2 500 μmol·L-1作用4 h,细胞存活率明显下降;H2O2500 μmol·L-1作用4 h,再加入25～100 μmol·L-1姜黄素作用1 h,细胞存活率也升高.姜黄素对H2O2诱导的细胞凋亡没有明显的影响,但同时作用组、H2O2先作用组S期细胞所占比例升高,姜黄素先作用组S期细胞所占比例下降.同时作用组、H2O2先作用组的SOD、NO、GR水平相对升高,MDA水平下降,姜黄素先作用组的SOD、NO、GR水平相对下降,MDA水平升高.结论:姜黄素对H2O2诱导的血管内皮细胞ECV304有双重效应,即有保护效应也有细胞毒效应,与其作用时间点有关.
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新型磺酰脲类化合物G004对血管内皮细胞的保护作用
目的:探讨新型磺酰脲类化合物G004对血管内皮细胞的保护作用.方法:采用H2O2造ECV304细胞氧化损伤模型,考察G004对细胞活力、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)以及G004对大鼠血浆中活性氧(ROS)的影响;皮下注射盐酸肾上腺素结合冰泳复制大鼠血管内皮细胞损伤模型,检测G004对血小板聚集率、组织纤溶酶原激活剂(t-PA)、组织纤溶酶原激活抑制剂(PAI)、F-6-酮-前列腺素F1α(6-K-PGF1α)、血栓烷B2(TXB2)分泌的影响;股静脉注射组胺复制大鼠血管内皮损伤模型,考察G004对动脉壁摄取伊文思蓝及血浆GMP140含量的影响.结果:G004可明显改善氧化损伤的ECV304细胞形态学变化,提高活细胞比率,降低MDA含量,提高SOD的活力,降低大鼠血浆ROS的含量;G004升高肾上腺素加冰泳刺激的大鼠血浆6-keto-PGF1α、t-PA含量,而且降低TXB2、PAI水平以及血小板聚集率;G004降低组胺所致内皮损伤大鼠的动脉壁伊文思蓝摄取量、降低血浆GMP140的含量,并呈剂量依赖性.结论:G004清除氧自由基,保护血管内皮的完整性,调节受损内皮细胞分泌TXA2、PGI2、t-PA、PAI,抑制GMP140的升高,G004对血管内皮具有较好的保护作用.
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山茱萸佳配伍组分对高糖致ECV304细胞氧化损伤的保护作用
目的 研究山茱萸佳配伍组分(环烯醚萜苷、三萜酸和多糖以2:1:2配伍)对高糖培养的内皮细胞(human umbilical vein endothelium cells,ECV304)氧化应激的影响.方法 体外培养细胞,在细胞板内加入含30 mmol·L-1高糖的10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS) RPMI 1640培养液,加入空白、山茱萸佳配伍组分大剂量、小剂量含药血清.同时设10% FBS RPMI 1640培养液作正常对照,川芎嗪作阳性对照.在37℃、5% CO2饱和湿度培养48 h后,取细胞上清液测定超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA),谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px).应用激光共聚焦显微镜检测进入细胞内2′,7′-二氯荧光黄双乙酸酯(DCFH-DA)荧光强度来反映细胞内ROS含量.结果 高糖组细胞上清液中SOD、GSH-Px活性降低,MDA、ROS含量增加(P<0.01),提示血管内皮细胞受损,抗氧化能力降低.而山茱萸佳配伍组分能提高SOD、GSH-Px活力,降低ROS、MDA含量,与高糖组比较差异有显著性(P<0.05,0.01).结论 山茱萸佳配伍组分能够保护血管内皮细胞,具有防治糖尿病血管病变的作用,其作用机制与抑制氧化应激有关.
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丹参酮ⅡA对TNF-α诱导的ECV304细胞NF-κB、IκB-α表达及粘附分子ICAM-1、VCAM-1mRNA表达的影响
目的 探讨丹参酮ⅡA对血管内皮细胞株ECV304 NF-κB、IκB-α及粘附分子ICAM-1、VCAM-1mRNA表达的影响,以阐明其抗动脉粥样硬化作用及机制.方法 通过建立TNF-α诱导的ECV-304细胞损伤模型,以抗氧化剂吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(PDTC)做为对照, 间接细胞ELISA方法定量检测NF-κB、IκB-α的表达,RT-PCR方法检测各组细胞ICAM-1、VCAM-1 mRNA的表达.结果 TNF-α可增加ECV304细胞转录因子NF-κB的表达,同时降低其抑制因子IκB -α的表达,低浓度的丹参酮ⅡA对TNF-α引起的ECV304细胞NF-κB的表达升高无明显抑制作用,但可增加其IκB -α的表达;高浓度的丹参酮ⅡA可明显抑制NF-κB的表达,同时增加其抑制因子IκB -α的表达.同时丹参酮ⅡA抑制TNF-α诱导的ECV304细胞ICAM-1、VCAM-1 mRNA表达.结论 丹参酮ⅡA可通过抑制转录因子NF-κB的激活及其相关粘附分子ICAM-1、VCAM-1 mRNA表达,这有利于抑制动脉粥样硬化过程中的炎症从而发挥抗动脉粥样硬化作用.
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灵芝多糖肽对ECV304细胞氧化损伤的保护作用
目的 研究灵芝多糖肽对ECV304氧化损伤的保护作用.方法 培养ECV304细胞,以叔丁基氢过氧化物(tBOOH)为氧化剂损伤细胞,造成氧化损伤模型,培养液中加入不同浓度灵芝多糖(12.5、25、50、100 mg·L-1),以MTT法测细胞存活率;以光镜、电镜检测细胞形态学改变及线粒体损伤;用AnnexinV/PI双标记细胞,流式细胞检测细胞凋亡的百分率.结果 灵芝多糖(12.5、25、50、100 mg·L-1)可减少叔丁基氢过氧化物对ECV304的氧化损伤,MTF检测灵芝多糖给药组,ECV304细胞存活率增加.光镜下可见细胞损伤减少,电镜可见灵芝多糖(50 mg·L-1,温育24 h)减轻细胞器如线粒体氧化损伤,减少细胞凋亡.细胞流式检测表明:对照组、给药组、损伤组总凋亡百分率分别2.24%±0.43%、24%4±6.4%(P＜0.01)、82.1%±7.9%.结论 灵芝多糖肽(GLPP)对ECV304细胞氧化损伤具有保护作用.
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纤维素-大豆蛋白混合膜与内皮细胞生物相容性的实验研究
目的:研究和评价纤维素-大豆蛋白混合膜与内皮细胞的生物相容性,为其作为人工生物支架材料应用于组织工程提供实验依据.方法:将内皮细胞株ECV304与不同组分、碱处理前后的纤维素-大豆蛋白混合膜共培养,分别以四氮甲唑蓝(MTT)法检测细胞活力,以扫描电镜(SEM)观察细胞形态和生长状态.结果:与阴性对照组和单纯纤维素组相比,ECV304在纤维素-大豆蛋白混合膜上生长良好,大豆蛋白加入到纤维素膜中显著提高了ECV304的细胞活力;在碱处理后的混合膜表面,细胞长出许多足突伸入膜孔隙,明显促进细胞在膜表面粘附.结论:初步表明纤维素-大豆蛋白混合膜与内皮细胞ECV304生物相容性良好,在血管组织工程领域具有应用潜能.
关键词： 纤维素-大豆蛋白混合膜 内皮细胞 ECV304 生物相容性 组织工程 -
阿魏酸钠对肿瘤坏死因子诱导人脐静脉内皮细胞NOS基因表达的影响
目的：探讨阿魏酸钠(SF)在人脐静脉内皮细胞中对内皮型一氧化氮合酶(ecNOS)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)基因表达的影响。方法：常规培养人脐静脉内皮细胞(ECV304)，分成5组：①正常对照组，常规培养；②肿瘤坏死因子-α(TNF-α)Ⅰ组，培养液中加入TNF-α 1 000 u/ml作用30 min；③TNF-αⅡ组，培养液中加入TNF-α1 000 u/ml作用6 h；④SF+TNF-αⅠ组，培养液中先加入SF1 mg/ml孵育1 h，再加入TNF-α 1 000u/ml作用30 mn；⑤SF+TNF-αⅡ组，培养液中先加入SF1 mg/ml孵育1 h，再加入TNF-α1 000 u/ml作用6 h。采用原位杂交法检测iNOS和ecNOS的mRNA表达，扫描电镜观察细胞形态变化。结果：①TNF-α使内皮细胞iNOS mRNA表达增高而ecNOS mRNA表达降低；电镜下内皮细胞破坏较明显，细胞皱缩，微绒毛断裂，分布不规则。以上改变又以6h为著。②将SF与TNF-α共同作用于内皮细胞使内皮细胞iNOS mR-NA表达下降，ecNOS mRNA表达增高；电镜下内皮细胞破坏轻微。结论：TNF-α诱导内皮细胞iNOSmRNA表达增高，ecNOSmRNA表达抑制。而SF使内皮细胞iNOS mRNA表达下降，ecNOS mRNA表达增高，这可能是SF抗动脉粥样硬化，抗炎症损伤的机理之一。
