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参与创面修复的干细胞及其在创面修复中作用的研究进展
皮肤作为人体大的器官,在抵御外界病菌入侵、调节体温、感觉等方面有重要作用.通常情况下,皮肤的表皮处于动态的更新状态,新生的表皮细胞取代老化脱落的角质细胞,这个过程与定位于表皮基底部的表皮干细胞密切相关,基底表皮干细胞的增殖同表皮脱落的细胞处于动态平衡,这一平衡维持着皮肤正常的组织结构和细胞内环境的稳定.
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表皮干细胞表面标志物的研究进展
表皮干细胞(epidermal stem cells,ESCs)是来源于胚胎外胚层的皮肤组织的专能干细胞,可以分化成各种表皮细胞,使表皮始终处于持续的增殖、分化、脱落、消亡状态,大约每月更新一次,并且增殖与消亡的速度保持大致平衡,从而保证了皮肤形态和功能的完整性.
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胰岛素样生长因子及其受体在难愈性溃疡组织中的表达特征
目的:探讨胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)与其受体两亚基(IGF-Ⅰ Rα和IGF-Ⅰβ)在正常皮肤和溃疡组织中的分布和表达特征及其与溃疡形成的关系.方法:16例被测标本中包括不同类型的皮肤溃疡组织8例和正常皮肤8例.用常规病理技术和免疫组化方法确定这三种蛋白在不同组织中的定位和表达量的变化规律.结果:在正常皮肤中,IGF-Ⅰ蛋白主要存在于表皮细胞、内皮细胞和部分成纤维细胞内,而其受体的阳性信号主要分布于表皮细胞的细胞膜上.在溃疡组织中,与正常皮肤相比IGF-Ⅰ表达虽有所升高,但增加不显著(P＞0.05),蛋白定位也无明显差异.含有IGF-ⅠRα和IGF-Ⅰβ蛋白的阳性细胞主要为部分表皮细胞、单核细胞和巨噬细胞,两种蛋白的阳性表达率分别显著降至为正常皮肤的43.9%和50.0%(P＜0.05).结论:在IGF-Ⅰ因子高浓度环境中,溃疡创面难愈性修复可能与IGF-Ⅰ Rα和IGF-Ⅰβ蛋白表达下降,引起因子与受体结合发生障碍相关.
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皮肤创面愈合过程中上皮间质化机制的研究
目的:探讨β2肾上腺素受体(β2-AR)在皮肤创伤修复上皮间质化(EMT)过程中的作用机制及意义.方法:采用免疫印迹法(Western blot)、逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)、免疫荧光技术等实验方法,体外观察β2-AR激动剂(ISO)和抑制剂(ICI)对上皮细胞间质化标志物(α-平滑肌肌动蛋白、波形蛋白、snail)表达的影响及创面皮肤上皮化标志物(E-钙黏附素)表达的变化.结果:β 2-AR可通过介导皮肤创面愈合的EMT过程,促进表皮细胞向间质表型转化,且运动和迁移能力在该过程中不断增强.结论:β 2-AR是皮肤上皮间质化的关键分子,其介导的EMT过程是皮肤创面愈合的生物学基础.
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异种(猪)脱细胞真皮基质粉对表皮细胞和成纤维细胞的促进作用
目的 观察冷冻研磨获得的脱细胞真皮基质粉(ADMP)生物学性状,探索高纯度且保留生物活性的异种(猪)ADMP对表皮细胞和成纤维细胞生长的支持及在皮肤创伤修复中的应用.方法 选取幼龄长白猪背部皮肤,经生物酶法脱细胞、冷冻干燥后经过不同冷冻研磨程序得到异种(猪)ADMP,再由60钴辐照获得无菌异种(猪)ADMP;通过扫描电子显微镜和透射电子显微镜观察异种(猪)ADMP颗粒大小及胶原形态,确定适合应用的研磨程序;通过MTT法检测HaCaT细胞和BJ人皮肤成纤维细胞在不同浓度异种(猪)ADMP包被下的黏附作用,确定异种(猪)ADMP实现细胞大黏附的浓度范围;DMEM培养液基添加异种(猪)ADMP为实验组,单纯DMEM培养液基为对照组,使用实时细胞分析技术分析BJ人皮肤成纤维细胞迁移指数,验证异种(猪)ADMP对成纤维细胞的促迁移作用;原代表皮细胞接种在异种(猪)ADMP培养液8d,绘制增殖曲线,检测异种(猪)ADMP对原代表皮细胞的促增殖作用,同时免疫荧光检测原代表皮细胞表面成熟与分化蛋白的表达.对数据进行Student's t-检验.结果 1、2、3、5、7、10次循环研磨获得异种(猪)ADMP,肉眼可见全部为白色、无块状,其中1、2、3次循环呈较粗颗粒;5、7、10次循环呈现集中均匀趋势,粒径分布在0 ～12 μm之间.其中5次循环粒径(13.00±2.10) μm与7次循环[(6.00±0.96)μm比较,差异有统计学意义(t=6.093,P=0.0002).异种(猪)ADMP透射电子显微镜下发现,不同循环次数获得的异种(猪)ADMP均能保留大量胶原分子.BJ人成纤维细胞和HaCaT细胞随包被浓度的增加,细胞黏附作用不断增强,浓度高于750 μg/cm2,无明显变化.实时细胞分析技术检测BJ人皮肤成纤维细胞在DMEM培养液基对照组培养液72 h后的迁移指数为1.21 ±0.10,而异种(猪)ADMP培养液基试验组的迁移指数为3.66 ±0.11,两组比较差异有统计学意义(t=22.24,P=0.002).在异种(猪)ADMP培养液的原代表皮细胞形态统一增殖迅速,对照组出现一定比例的分化细胞,试验组与对照组第5天细胞数分别为(4.11±0.28)×105、(1.10±0.12)×105个,两组比较差异有统计学意义(t=13.51,P=0.005);第8天细胞数分别为(5.00±0.48) ×105、(3.05 ±0.30)×105个,两组比较差异有统计学意义(t=4.87,P=0.039),增殖曲线显示试验组在接种即日培养液至第5天,一直处于指数增长期.荧光染色中异种(猪)ADMP培养液的原代表皮细胞E-cad全部表达,少量表达角蛋白10,整合素α6几乎全部强阳性,角蛋白14全部表达并有部分强阳性,Ki-67抗原表达率高.结论 通过生物酶解和冷冻研磨获得的异种(猪)ADMP对参与皮肤创伤修复重要的表皮细胞和成纤维细胞,具有促进其增殖和迁移的作用,未来可进一步应用于皮肤创伤修复.
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利用组织工程双层皮肤修复糖尿病溃疡的研究
目的 探讨组织工程双层皮肤修复糖尿病溃疡的效果.方法 利用同种异体的皮肤表皮细胞和皮肤成纤维细胞分别作为表皮和真皮的种子细胞制备组织工程双层皮肤,选取已制备的溃疡面积相当的糖尿病溃疡动物模型20例,随机分为实验组和对照组各10例,临床选取26例溃疡面积差异无统计学意义的糖尿病患者,随机分为试验组和对照组各13例,分别将制备的皮肤用于动物模型和用于临床糖尿病足溃疡患者,同时控制血糖,对溃疡进行清创处理,以制备的组织工程双层皮肤覆盖创面,行常规护理;对动物模型的创面愈合情况和临床创面愈合效果分别进行统计和分析.结果 动物实验中,实验组愈合速度明显快于对照组,平均愈合时间较对照组提前6d,实验组与对照组愈合时间差异有统计学意义(F=0.178,P＞0.05,方差齐,t=-10.919,P＜0.05);移植4周时,实验组愈合率为60％,对照组10例均未完全愈合,愈合率为0,两组愈合率比较差异有统计学意义(t=0.011,P＜0.05).临床试验中,移植6周时,试验组愈合率为84.6％;对照组愈合率为23.1％,两组比较差异有统计学意义(x2=0.001,P＜0.05).试验组的平均愈合时间为43.25 d,对照组的平均愈合时间为76.69 d,与对照组相比,试验组创面的平均愈合时间缩短了约33 d,对照组的愈合速率较试验组明显缓慢,试验组与对照组的创面愈合时间差异有统计学意义(方差齐性检验结果,x2=16.971,P ＜0.05,方差不齐,x2=7.649,P＜0.05).结论 应用组织工程双层皮肤修复糖尿病足溃疡是一种切实可行的临床治疗方法.
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浅谈表皮干细胞传代于脱细胞真皮基质所形成的复合皮的体会
20世纪70年代发明了自体表皮干细胞培养技术,逐渐应用于临床,但是南于自体表皮细胞缺乏真皮结构,收缩性大,不易转移和固定,移植后很脆弱,抗感染能力差,导致其移植成功率很不稳定,成活以后易产生严重的瘢痕,因此单纯的角质细胞培养和移植临床很少应用.将表皮干细胞传代于脱细胞真皮基质形成的复合皮移植效果较单纯的角质细胞明显提高,为烧伤患者的皮肤再生提供新的方法.
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表皮细胞、成纤维细胞、毛囊同时移植修复全层皮肤缺损的实验研究
我们利用组织工程技术,在修复全层皮肤缺损时,除移植自体表皮细胞与成纤维细胞外[1],同时移植自体毛囊,在组织工程化皮肤中增加了毛囊成分,使其与正常皮肤更加接近.
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表皮细胞-无细胞真皮复合皮的构建及生长活性研究
应用组织工程技术于体外重建复合的表皮-真皮皮肤替代物可望为大面积深度烧伤患者提供大量的皮源。我们探讨了以异种（猪）无细胞真皮为载体，于体外种植表皮细胞形成复合皮的可能性，为进一步移植封闭创面提供依据。 1．材料和方法：按常规法制备来源于猪皮的异种无细胞真皮。分离培养3株以上正常人包皮的表皮细胞，以5×104/cm2密度种植于无细胞真皮表皮面，培养2周。每2～3 d换液1次。
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间质细胞-上皮细胞转化与人胚胎表皮细胞发生的研究
目的探讨胚胎期表皮细胞形态发生与间质-表皮细胞转化(MET)及其调节因子之间的关系.方法对早期胚胎标本分别采用间质细胞标记物波形蛋白(Vim)和α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、胚胎表皮特异性蛋白细胞角蛋白(CK)8和18、表皮干细胞特异性蛋白CK19和相关调节因素转化生长因子β1(TGFβ1)及其受体(TGFβRⅠ)标记物进行免疫组化、免疫荧光染色和组织形态学观察.结果在人胚胎胎龄(EGA)6～8周期间,外胚层Vim+和α-SMA-细胞向CK8和18+和CK19+表皮干细胞转变,并检测到中等强度(++)TGFβRⅠ信号,但TGFβ1信号十分微弱(±);至EGA 10周以后这些细胞呈现表皮细胞的组织形态学特征.结论 EGA 6～8周是人胚胎表皮细胞经由MET发生的重要时期,TGFβRⅠ信号通路可能参与了MET调节过程,但其配体TGFβ1起源及其作用机制有待进一步研究.
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自体组织工程化皮肤修复全层皮肤缺损的实验研究
目的为制成含表皮细胞与成纤维细胞的双层皮肤替代物,直接用于修复全层皮肤缺损.方法选用长枫杂交仔猪10只,酶消化法获取皮肤表皮细胞与成纤维细胞,将原代培养处于对数生长期的表皮细胞、成纤维细胞分别与30%氧化异丙烯F-127 混匀成细胞悬液后,种植聚羟基乙酸(polyglycolic acid,PGA)形成细胞-生物材料复合物,用于修复自体动物背部直径4 cm全层皮肤缺损,以单纯生物材料(PGA+氧化异丙烯)充填的创面作为对照组.修复术后1,2,4,8周取材,通过组织学和基底膜特殊染色等方法对新生组织进行评价.结果第1周新生组织即出现表皮与真皮2层结构,特殊染色观察到连续的基底膜.第2周表皮与真皮均较前增厚.修复后第8周组织工程化皮肤的形态结构均与正常皮肤相似.对照组则无皮肤形成,仅见大量肉芽组织.结论应用组织工程技术,以PGA+氧化异丙烯为表皮细胞、成纤维细胞载体构建的组织工程化皮肤可修复全层皮肤缺损.
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活性皮肤替代物的研究与应用
1987年,美国国家科学基金会提出了组织工程的概念,目前组织工程已成为一个新兴的前沿学科,并取得了一些振奋人心的成果,皮肤组织工程在其中居领先地位,一些活性皮肤替代物已经应用于临床,成为组织工程化组织器官移植的成功范例.实际上在组织工程的概念提出之前,人们早已在研究具有细胞活性的皮肤替代物.20世纪60年代,随着细胞培养技术的突破,Kheinwold Green等首先培养出表皮细胞膜片.后经许多研究者的改良,研究出了适于移植的表皮细胞膜片,使体外培养活组织移植的梦想变成现实.在随后的几十年里,不断有新的活性皮肤替代物问世,直至近年来出现了商品化的、器官型的皮肤替代物Apligraft(商品名).天然的、人工合成的各种真皮基质很多,也有商品化的产品如Alloderm(商品名).然而由于缺乏活细胞成分,以及结构和成分上的不完整性,终不能成为理想的皮肤替代物.构建尽可能接近正常皮肤结构、功能和形态的活性皮肤替代物,仍是未来的研究方向.
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皮肤软组织扩张术的应用进展
皮肤软组织扩张术（Skin tissue expansion,STE 1976）是通过增加置入皮下扩张器内的容量，对表面皮肤产生压力，使其产生“额外”皮肤，利用新增加的皮肤转移覆盖创面。STE为烧伤、创伤瘢痕、肿瘤、缺损的修复重建增添了新的较为满意的方法，是整形外科领域里程碑性的进展［1］。 一、皮肤软组织扩张术的基础研究 1.扩张后的组织学变化：皮肤经过一定容量的扩张后，局部面积增加。扩张表皮细胞的有丝分裂活动24 h内可增加3倍。有新生的细胞形成。表皮细胞对机械刺激反应敏感，皮肤软组织扩张时的有丝分裂活动是正常组织对张力的一种反应，而有丝分裂活动增加引起的细胞数量的增多，是扩张器表面皮肤面积增加的主要原因。现已证实扩张6 w后增张率69.76 %，主要为细胞分裂增殖而来。 在扩张器囊内压不断增加的牵拉作用下，表面组织细胞之间的部分不牢固的连接分离，细胞间隙增宽，形态被拉长，同时导致细胞间质增生。另外，由于局部张力的增加使邻近组织受到牵拉产生“蠕变”而向扩张区移动，以上二者亦是皮肤面积增加的另外来源。 扩张后组织形态学的改变表现为表皮增厚，细胞层数增加，真皮及皮下组织变薄，乳头层及网状层含有大量胶原纤维，血管数量增加，皮肤附件（毛囊、汗腺等）彼此分离，但形态正常。扩张器周围形成一层纤维包膜。扩张后皮肤的毛细血管和末梢神经纤维数量增加，类似皮瓣延迟术后的变化。纤维包膜内含丰富的毛细血管。 扩张皮肤的超微结构显示基底细胞层及棘细胞层的胞浆中含有大量的张力丝。真皮中有大量排列紧密的胶原纤维束，弹力纤维结构未发生变化。在扩张早期，真皮深层还可见到少量的成肌纤维细胞，胞浆内含有大量的粗面内质网及线粒体。
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表皮干细胞增殖分化的分子调控机制
皮肤作为人体大的组织器官,覆盖于人体的外表,是医学美学美容研究的主要组织器官.近年来的研究表明,皮肤表皮细胞的自我更新、再生修复以及衰老退变是由来自毛囊或表皮基底层的成体干细胞--表皮干细胞的增殖分化所决定的.对于表皮干细胞的深入研究,将对烧创伤创面修复机制、皮肤年轻化医学美容提供强有力的实验依据及新技术、新方法.
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内镜下眉弓外侧皮样囊肿切除术
皮样囊肿是在胚胎发育过程中表皮细胞被误卷入闭合的沟槽中而形成的先天性囊肿,治疗以手术切除为首选.2002年8月至2006年2月我科收治9例眉弓外侧囊肿患者,采用同侧颞部发际线内切口入路的内镜手术切除,收到了较好的疗效.
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组织工程化表皮膜片构建及其在供皮区的应用研究
目的构建组织工程化表皮细胞膜片并应用于供皮区创面治疗.方法利用患者少量自体或同种异体正常皮肤分离、培养、扩增的表皮细胞,接种于壳聚糖/明胶膜构建成表皮细胞膜片;将膜片移植于治疗组供皮区创面、适度加压,同时设立对照组:空白材料对照以及传统油纱布对照覆盖创面.于术后5～10 d、30 d、90 d行大体观察、组织学检查、广谱角蛋白、外皮蛋白、层粘连蛋白、免疫组织化学检测以及Ⅰ、Ⅲ型胶原比值测定(偏光显微镜、RT-PCR).结果利用自体及异体表皮细胞和壳聚糖/明胶膜能够构建出人表皮细胞膜片,应用于临床供皮区创面治疗15例,经过3个月随访,疗效肯定.移植膜片创面愈合时间(8.1±1.3)d,空白材料对照区为(16.2±3.8)d,空白油纱布对照区为(23.0±5.8)d.移植膜片存活良好,结构较完整、术后30 d及90 d观察:12例无明显增生,3例有轻度增生(20.0%),而空白油纱布对照区11例遗留增生性瘢痕(74.4%,χ2=8.127,P＜0.01).结论表皮细胞-壳聚糖/明胶膜片能促进供皮区创面早期愈合并减少后期瘢痕增生,具有良好治疗效果.
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游离毛囊培养与毛囊组织工程的实验研究进展
毛囊是由上皮成分(包括毛母质、外根鞘)和真皮成分(包括毛乳头、结缔组织鞘)组成的.毛囊的发育是由表皮细胞及其下方的间质相互诱导形成的,Paus等[1]根据毛囊的长度、近端的位置、形成时间及发生过程中的特征将毛囊的形态发生人为的分为0～8阶段,为研究者筛选突变鼠毛囊的异常形态提供了一种有用的方法.大多数毛囊具有生长期、退行期、休止期三个阶段的循环周期.影响毛发生长的因素有很多,如生长因子、细胞因子、皮质激素、表-真皮间相互作用、药物等,其具体作用机理尚不完全清楚.现我们仅就游离毛囊的培养与毛囊组织工程的动物实验研究进展做一综述.
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增生性瘢痕表皮细胞双向电泳图谱的建立及差异蛋白展示
目的建立在体增生性瘢痕表皮细胞蛋白质分子双向电泳(2-DE)技术,筛选出增生性瘢痕表皮细胞较正常表皮细胞差异表达的蛋白质,为揭示表皮细胞在增生性瘢痕形成过程中的作用奠定基础.方法利用消化法分离出在体的增生性瘢痕组织中的表皮细胞,提取其中总蛋白质,利用双向电泳技术展示蛋白质分子的表达,通过Melanie 3.0软件对凝胶图像进行分析,将结果与数据库中正常表皮细胞2-DE图谱进行比较.结果建立了能够显示超过600个蛋白质点的在体增生性瘢痕表皮细胞双向电泳图谱,通过比较筛选出在位置、形状或密度上存在差异的蛋白质点24个.其中高表达的点有8个,低表达点有9个,表达缺失或极低表达点有4个,新发现蛋白质点3个.结论采用消化法分离在体增生性瘢痕表皮细胞建立其2-DE图谱的方法是可行的,为进一步进行增生性瘢痕相关性蛋白质组研究奠定了基础.初步筛选出的24个差异蛋白质点提示增生性瘢痕表皮细胞的异常可能与增生性瘢痕的形成有关.
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septin2基因短剪接本转表达产物对小鼠皮肤培养细胞作用的实验研究
目的 构建septin2基因短剪接本的真核表达载体,探讨其在体外培养的小鼠皮肤培养细胞中的表达及对细胞的作用.方法 特异引物PCR扩增鼠胚皮肤mRNA逆转录产物,获得septin2基因短剪接本septin2s.构建其真核表达载体pcDNA3.1(-)/septin2s,转染体外培养的小鼠表皮细胞及成纤维细胞.RT-PCR法检测septin2s的表达,并进行细胞形态及生长动力学分析.结果 septin2s在转染的表皮细胞及成纤维细胞中均获得表达,表皮细胞增殖现象明显,而成纤维细胞无显著变化.结论 通过构建真核表达载体pcDNA3.1/septin2s,并使其在体外培养的小鼠皮肤培养细胞中表达,为揭示其在鼠胚皮肤中的功能和作用奠定了基础.
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表皮细胞体外增殖与增殖表型细胞含量变化规律的实验研究
目的研究人表皮细胞(human epidermal cells,hECs)体外扩增与增殖表型细胞含量变化规律.方法收集2～3岁健康幼儿包皮共20例,对标本拍照,软件分析照片中标本面积,分离、收集表皮细胞,计算原代(P0)细胞获得率(5例).记录不同代次细胞生长曲线,细胞直径,克隆形成率(5例).对不同代次细胞的角蛋白19(keratm,K19)和外皮蛋白(involucrin)的mRNA表达情况及阳性细胞率分别进行RT-PCR检测(5例)和流式细胞仪(FACS)分析(5例).结果原代细胞平均获得率为(1.64±0.297)×106/cm2.hECs大可扩增(700±37)倍,第5代(P5)的扩增倍数为(243±13)倍.P0克隆形成率为(45±4)%,随传代依次降低,至第5代(P5)时为(9±2)%,至第6代(P6)时消失.RT-PCR检测发现K19 mRNA在P5及P5之前表达,P6未见表达;Involucrin各代均表达.FACS检测各代hECs中K19阳性细胞百分率逐渐降低,P0时为(66.97±3.14)%,P6为(4.65±1.38)%;外皮蛋白表达阳性细胞百分率逐渐增高,P0时为(11.65±1.62)%,P6为(97.03±2.66)%.结论体外扩增至第5代的幼儿包皮来源的表皮细胞,维持着增殖细胞表型,符合组织工程表皮种子细胞的要求.表皮细胞体外扩增能力逐渐降低与增殖表型细胞含量减少有关.
