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骨髓间充质干细胞移植对脊髓损伤大鼠中枢α-氨基羟甲基恶唑丙酸受体蛋白表达的影响
目的 观察骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植对脊髓损伤大鼠海马和杏仁核α-氨基羟甲基恶唑丙酸(AMPA)受体蛋白谷氨酸受体(GluR)1,2表达的影响,探讨BMSCs移植治疗大鼠脊髓损伤的潜在抗慢性应激作用.方法 选择成年雄性SD大鼠48只,按随机数字表法分为对照组、模型组、治疗组,每组16只.模型组、治疗组采用改良Allen法建立大鼠下胸段(T10)脊髓损伤模型.造模后7d,于L4～L5间隙蛛网膜下腔向对照组及治疗组注射100μl含1.0×106BMSCs的Hank缓冲液混悬液,模型组注射同体积Hank缓冲液.术前、术后评估大鼠后肢运动功能.每组于移植后第14,28天处死一半动物,灌注后取脑,冰冻切片后行GluR1、GluR2免疫组织化学染色.结果 BMSCs移植后,治疗组动物后肢运动功能持续恢复.移植术后14 d,GluR1阳性细胞数,模型组和治疗组在海马CA1区均高于对照组(P ＜0.05,0.01)；GluR2阳性细胞数有类似趋势,但差异无统计学意义(P＞0.05).移植术后28 d,GluR1阳性细胞数,模型组在CA1、CA3、DG区均高于对照组,在CA1、CA3区亦高于治疗组(P＜0.05,0.01),模型组和治疗组在DG区均高于各自移植后14 d阳性细胞数(P＜0.05,0.01)；GluR2阳性细胞数,治疗组在基底外侧杏仁核(BLA)高于对照组(P＜0.05),在其他区各组表现出与GluR1表达类似的趋势,但差异无统计学意义(P＞0.05).结论 BMSCs移植可改善大鼠下胸段脊髓损伤模型的后肢运动功能,并对其中枢AMPA受体GluR1/2表达有调节作用,表现出潜在的抗慢性应激作用.
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亚低温治疗对大鼠重型脑创伤后谷氨酸及甘油的影响
笔者通过观察重型脑创伤后脑细胞间液谷氨酸和甘油的变化规律,进而探讨亚低温治疗对谷氨酸的兴奋性毒性与脑细胞膜稳定性的影响.现报告如下.
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谷氨酸对腺苷A2A受体调节一氧化氮合酶活力的影响
目的探讨谷氨酸是否能够影响腺苷A2A受体对一氧化氮合酶(NOS)活力的调节. 方法用1 000 ng/ml脂多糖(LPS)刺激小胶质细胞,分别加入100 nmol/L A2A受体激动剂CGS21680以及不同浓度的谷氨酸(0.1,0.25,0.5 mmol/L)干预,观察NOS活力变化. 结果LPS诱导NOS活力增高,激活A2A受体可以产生抑制作用;0.25及0.5 mmol/L谷氨酸和A2A受体激动剂同时存在时,NOS活力进一步增高. 结论高浓度谷氨酸可逆转腺苷A2A受体激动剂抑制升高NOS活力的作用.
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谷氨酸在大鼠冲击伤复合缺氧后视网膜神经节细胞损伤中的作用
目的研究谷氨酸在大鼠冲击伤复合缺氧后视网膜神经节细胞(RGCs)损伤中的作用及机制. 方法健康Wistar大鼠56只,分为正常对照组(NG,6只)、单纯冲击伤组(BG,24只)、冲击伤复合缺氧组(HG,24只).致伤组动物用BST-Ⅰ型生物激波管致冲击伤.HG组致伤后置于体积分数为12.5%低氧舱内6 h.于伤后1,3,5,7 d处死大鼠取视网膜采用氨基酸分析仪测定其谷氨酸浓度,用免疫组化方法检测Caspase-3P20表达,TdT介导的dUTP缺口末端标记技术(TUNEL)染色观察凋亡情况. 结果伤前视网膜谷氨酸浓度为(0.245±0.008) μg/mg,伤后1 d 谷氨酸浓度即明显升高(P＜0.01),以后逐渐回落,但仍明显高于正常(P＜0.01).正常视网膜内未见Caspase-3P20表达和TUNEL染色阳性细胞,伤后3 d开始出现,5 d明显增多(P＜0.01),7 d仍维持于高水平,且阳性细胞主要为RGCs,内核层偶见.所检测三个指标变化呈显著性相关. 结论冲击伤复合缺氧明显加重了视网膜的损伤,谷氨酸兴奋毒性介导的RGCs凋亡可能是冲击伤复合缺氧后视网膜损伤的重要机制之一.
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皮层神经元机械性损伤后代谢型谷氨酸受体表达及其拮抗剂的保护作用
目的研究体外培养小鼠脑皮层神经元机械性损伤后代谢型谷氨酸受体1a(metatropic glutamate receptor 1a,mGluR1a)的表达规律及其选择性拮抗剂1-氨基茚-1,5-二羧酸(1-aminoindan-1,5-dicarboxylic acid,AIDA)的保护作用. 方法孕15～16 d昆明种小鼠胚胎脑皮层神经元体外培养7 d,以微量移液器塑料滴头在培养孔内划割,造成机械性损伤,伤后不同时间点(10,30 min、1,3,6,12,24,72 h)行神经元免疫组化染色,并留取培养液上清,检测乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)活性;对照组除不划伤神经元,其他处理同损伤组.AIDA处理组在损伤前30 min,每孔加入AIDA使其终浓度为20 μmol/L,其余步骤同前,激光扫描共聚焦显微镜检测AIDA处理前后神经元细胞内Ca2+含量变化. 结果 mGluR1a在正常神经元中表达呈弱阳性,染色颗粒分布于胞浆、胞膜及突起;机械性损伤后10 min起,mGluR1a表达明显增强,胞核周围胞浆内染色明显加深,持续至伤后24 h,神经元突起中也有明显表达,伤后72 h,存活神经元数量明显减少,mGluR1a染色呈弱阳性.对照组LDH活性为(80.5±21.9)U/L,损伤后30 min, LDH活性较对照组明显增加(P﹤0.05),3,6 h时与对照组相比,差异无统计学意义(P＞0.05),伤后12～72 h, LDH活性较对照组明显增强(P﹤0.05).伤后12～72 h,AIDA处理组LDH活性较单纯损伤组明显降低(P﹤0.05).AIDA处理组较对照组神经元细胞内Ca2+含量明显降低(P﹤0.05). 结论体外培养小鼠脑皮层神经元机械性损伤后mGluR1a表达明显增强,其选择性拮抗剂AIDA的脑保护作用显著.
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创伤性脑损伤CT特征与脑脊液谷氨酸的关系
兴奋性氨基酸(EAA)谷氨酸(GLU)和天门冬氨酸的神经毒性是脑创伤、缺血缺氧及癫痫发作后脑损伤的重要因素之一.笔者以42例成人急性脑外伤为对象,探索创伤性脑损伤(TBI)首次头颅CT表现与脑脊液(CSF)中GLU之间的关系.
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脑损伤患者的康复结局与血清谷氨酸水平的相关性研究
目的 探讨脑外伤患者的康复结局与血清谷氨酸(GLU)水平的相关性. 方法 采用高效液相色谱法(HPLC)测定30例急性脑外伤患者伤后24 h内和6 d的血清谷氨酸,并在24 h内采用格拉斯哥昏迷计分(GCS)及20 d后功能独立性(FIM)的评定值进行相关性研究. 结果 血清GLU(24 h内)的水平和GCS、FIM得分呈良好的负相关.将24 h测量的血清GLU浓度与6 d血清GLU浓度值比较,分为持续增高组与降低组.两组20 d后的FIM平均得分有显著性差异(P＜0.01),GLU浓度持续增高组的FIM得分远远低于GLU浓度降低组. 结论 脑外伤患者血清GLU浓度可影响脑组织的继发性损伤程度,并影响患者功能的恢复.
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急性颅脑损伤脑脊液中谷氨酸含量变化的临床意义
笔者报告30例急性颅脑损伤后,脑脊液中兴奋性氨基酸谷氨酸(Glu)含量的变化,对其在颅脑损伤中的作用进行探讨.
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二次脑损伤后鼠脑皮层代谢性谷氨酸受体5mRNA表达改变及α-甲基-4-羧基苯丙氨酸的治疗作用
目的研究二次脑损伤后鼠脑皮层代谢性谷氨酸受体 5 (mGluR5) mRN A的变化及Ⅰ类mGluR5拮抗剂α-甲基-4-羧基苯丙氨酸(MCPG)的作用。方法 90只SD大鼠随机分为原位杂交组(60只)和MCPG作用组(30只) ，每组又分为不同的亚组。在Marmarou大鼠加速性弥漫性脑损伤模型基础上，采用抽血造成低血压。在伤后不同时间进行原位杂交和病理学研究。结果单纯脑损伤后脑皮层 mGluR5 mRNA于伤后1 d开始降低，7 d低 ( P<0.05 )；而脑损伤合并二次脑损伤组脑皮层 mGluR5 mRNA水平在伤后变化更明显。Ⅰ类mGluRs拮抗剂MCPG可减少二次脑损伤后的损伤神经元的数目。结论脑损伤可以抑制 mGluR5的表达和生成，其作用可能与mGluR1、 mGluR 1α不同，对神经元具有保护作用。
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新生儿缺氧缺血性脑病脑脊液谷氨酸变化
利用高压液相色谱法测定了18例缺氧缺血性脑病(HIE)新生儿脑脊液谷氨酸含量.结果显示:中重度HIE脑脊液谷氨酸浓度明显高于轻度HIE及对照组,轻度HIE与对照组比较差异无显著性.中重度HIE中有无惊厥者脑脊液谷氨酸浓度无显著性差异.提示脑内谷氨酸的增加与HIE患儿脑损伤的程度有关.本资料结果为谷氨酸受体拮抗剂在新生儿窒息、HIE的临床应用提供了初步依据.
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Ca-A/K通道在缺氧缺血性脑损伤中的作用
新生儿缺氧缺血性脑病(hypoxic-ischemic encephalopathy,HIE)是围产期窒息缺氧导致的缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemic brain damage,HIBD),是新生儿期死亡和致残的主要原因[1].缺氧缺血导致的脑损伤涉及到氧自由基、细胞内钙超载、谷氨酸(Glu)兴奋毒性作用、炎症作用、细胞凋亡及自噬等多种机制,其中以Glu受体介导的兴奋性神经毒性尤为重要.脑缺氧缺血引起Glu大量释放,有研究发现,缺氧缺血后新生儿脑脊液内Glu浓度即增高,其水平与窒息程度呈正相关[2].大量Glu聚集在细胞外间隙,激活突触后膜Glu受体及一系列可以导致细胞死亡的级联反应.
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雌激素干预对高浓度氧致新生鼠视网膜细胞损伤的影响
目的 探讨高浓度氧致新生鼠视网膜细胞损伤及雌激素干预的意义.方法 建立新生wistar大鼠高氧诱导视网膜损伤模型,分为对照组、高氧组和高氧+雌激素组各20只.采用常规病理切片观察视网膜细胞的变化及组织结构变化；TUNEL染色观察视网膜细胞凋亡情况；RT-PCR检测谷氨酰胺合成酶(GS) mRNA的表达.结果 对照组组织形态、细胞凋亡数目及GSmRNA表达均无明显变化.高氧组第6、7天细胞明显水肿、变形、崩解、结构紊乱,第8、10天细胞数目减少,层次变薄；细胞凋亡率第7天达高峰(2.13±0.66),第10天下降至(0.74±0.29),均高于对照组(P＜0.01)；GS mRNA表达第6天明显升高(0.62±0.05),第7天降至正常水平以下(0.46±0.06).高氧+雌激素组细胞变化无高氧组明显；细胞凋亡率明显低于高氧组(P＜0.05)；GS mRNA表达第6天明显升高,第7天达高峰(0.80±0.06),高于高氧组(P＜0.01).结论 高氧诱导GS mRNA抑制,引起视网膜细胞凋亡性损伤.雌激素可以改善视网膜细胞存在的内环境,从而达到有效保护视神经细胞的目的.
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高效液相色谱-荧光法测定大鼠纹状体细胞外液中4种氨基酸的含量
目的:采用高效液相色谱-荧光检测法(HPLC-RF)建立大鼠脑微透析液中天门冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)和γ-氨基丁酸(GABA)的测定方法.方法:采用ODS-C18(5μm,250mm×4.6mm)色谱柱,柱温为35℃,流动相A为磷酸盐缓冲液(pH 6.7),流动相B为纯甲醇,梯度洗脱,流速为1.0 mL·min-1,荧光检测器的激发波长为239 nm,发射波长为375 nm.以邻苯二甲醛和β-巯基乙醇为衍生化试剂,柱前衍生,将脑微透析液直接注入高效液相色谱仪完成分析.结果:Asp、Glu、Gly和GABA4种氨基酸在0.5～32 μmol·L-1范围内线性关系良好,回收率范围为96.2％～102.1％.结论:所建立的氨基酸检测方法具有流动相配制简单、保留时间稳定、分析时间短、重复性好和回收率高等优点,可用于脑微透析液中痕量氨基酸的测定.
关键词： 脑微透析 纹状体 高效液相色谱-荧光检测法 氨基酸类递质 衍生化 邻苯二甲醛(OPA) 天门冬氨酸 谷氨酸 甘氨酸 氨基丁酸 -
UPLC/Q Exactive MS检测肉苁蓉多糖促PC12细胞释放神经递质的方法研究
目的:建立UPLC/Q Exactive MS法测定PC12细胞释放的神经递质多巴胺、去甲肾上腺素和谷氨酸含量.方法:采用Ultimate 3000系列高效液相色谱仪和Q Exactive四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱系统检测.标准品用超纯水溶解后,以乙腈-水(0.1％甲酸,10 mmol· L-1醋酸铵)(4∶96)为流动相,Hypersil GOLD色谱柱分离,通过高分辨质谱的全扫描/选择离子监测(Full MS/SIM)模式进行定性筛查和定量检测.应用Sigma Plot12.0统计软件包进行数据分析.结果:多巴胺和谷氨酸在3～2 000ng· mL-1浓度范围内线性关系良好,低定量限为3 ng·mL-1;去甲肾上腺素在100～2 000 ng·mL-1浓度范围内线性关系良好,低定量限为100 ng· mL-1;3种神经递质的加标回收率高,精密度RSD均小于5％;常温放置8h,4℃冷藏7d后以及-20℃冷冻1个月后稳定性良好.本实验同时在药物肉苁蓉多糖(CDPS)改善学习记忆功能已有研究的基础上,测定PC12细胞给药后3种神经递质不同时间点的释放浓度,结果显示CDPS对3种神经递质释放量有明显促增趋势.结论:UPLC/Q Exactive MS法适合同时测定PC12细胞分泌的多巴胺、去甲肾上腺素和谷氨酸的含量.
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LC-MS/MS法同时测定人血浆中谷氨酸和精氨酸
目的:建立测定人血浆中谷氨酸和精氨酸的方法,以应用于人体药代动力学研究.方法:血浆样本经与丹酰氯衍生化反应后,选用Synergi 4μ Hydro-RP 80A柱(150 mm ×2.0 mm,4μm),以甲醇-10 mmol·L-1乙酸铵(含0.1％甲酸)(50∶ 50)为流动相,流速0.3 mL·min-1,采用API3200型三重四极杆串联质谱仪的多重反应监测(MRM)扫描方式进行监测,电喷雾离子化源,正离子方式,选择监测离子反应分别为m/z 381.0--170.2(谷氨酸丹酰氯衍生化产物)、m/z 408.0--170.3(精氨酸丹酰氯衍生化产物)和m/z 353.0 →157.1(内标D-高丝氨酸丹酰氯衍生化产物).结果:谷氨酸、精氨酸和内标D-高丝氨酸的丹酰氯衍生化产物的保留时间分别为4.62、3.21和4.39 min;血浆中谷氨酸和精氨酸的线性范围均为3.00～300 μg·mL-1(r＞0.99),定量下限(LLOQ)均为3.00 μg·mL-;批内、批间精密度(RSD)均小于15％;准确度(RE)均在±15％的范围以内;谷氨酸和精氨酸平均提取回收率分别为(85.6±3.3)％和(79.9±3.9)％;平均基质效应因子分别为(116.3±4.9)％和(102.4±7.3)％;稳定性试验中,在各种贮存条件下血浆中谷氨酸和精氨酸均较稳定.结论:该方法适用于谷氨酸精氨酸注射液人体药代动力学研究.
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6-羟基多巴胺诱导PC12细胞释放谷氨酸及死亡不受Ⅰ组亲代谢型谷氨酸配基的影响
目的:探讨Ⅰ组亲代谢型谷氨酸受体(mGluR)配基对6羟基多巴胺(6-OHDA)诱导的PC12细胞死亡及谷氨酸(Glu)释放的影响.方法:培养PC12细胞，以100 μmol/L Ⅰ组mGluR激动剂(RS)-3，5-dihydroxyphenylglycine(DHPG)和拮抗剂DL-2-amino-3-phosphonopropionic acid(DL-AP3)预先刺激细胞1 h，再加入6-OHDA100 μmol/L共孵育24 h，显微镜下观察细胞形态变化，用TUNEL法检测凋亡细胞，用噻唑蓝(MTT)法检测细胞存活率，并用高效液相色谱检测Gl u的释放量.结果:6-OHDA降低PC12细胞存活率(P＜0.01)，其诱导的Glu释放呈浓度和时间依赖性.Ⅰ组mGluR配基不能减少6-OHDA引起的PC12细胞死亡，也不影响6OHDA引起的Glu释放量.结论:Ⅰ组mGluR配基对6-OHDA引起死亡的PC12细胞无保护作用.
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四氢吖啶类衍生物EDT抑制脑缺血及保护大鼠皮层神经元抗谷氨酸诱发的细胞毒性
目的:考察9-(4-乙氧羰基苯氧基)-6,7-二甲氧基-1,2,3,4-四氢吖啶盐酸盐(EDT)对大鼠局灶性脑缺血及谷氨酸(Glu)和硝普钠(SNP)致鼠皮层神经元损伤的作用.方法:灼断小鼠一侧大脑中动脉形成局灶性脑缺血模型,用氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法测定脑梗塞率同时对神经症状进行评分.在原代培养的大鼠皮层神经细胞,采用MTT比色法,测定培养质内LDH及NO释放量.结果:EDT 2.5、5和10mg/kg及尼莫地平2 mg/kg灌胃5 d显著改善局灶性脑缺血小鼠的神经运动功能,缩小脑梗塞范围.在原代培养的鼠皮层神经细胞,EDT 0.01-3 μmol/L浓度依赖地对抗Glu诱发的NO过量形成,并提高MTT微量比色值,同时,减少SNP引起的LDH过量释放,提高细胞存活率.结论:EDT能有效对抗脑缺血损伤,其神经保护作用可能是通过阻断Glu受体及抑制N0生成而实现的.
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GABA合成酶抑制剂盐酸氨基脲对褪黑激素催眠作用的影响
目的:观察GABA合成酶抑制剂盐酸氨基脲对褪黑激素催眠作用的影响.方法:采用小鼠协同戊巴比妥钠睡眠法和大鼠脑电图描记法测定盐酸氨基脲对睡眠和褪黑激素催眠作用的影响.结果:褪黑激素对小鼠和大鼠均具有明显的催眠作用.盐酸氨基脲单独使用对小鼠和大鼠的睡眠无影响,但能明显阻断褪黑激素对戊巴比妥钠引起的小鼠睡眠时间的延长,并且明显抑制褪黑激素引起的大鼠总睡眠时间,慢波睡眠时间,快波睡眠时间的增加和觉醒时间的减少.结论:盐酸氨基脲能明显拮抗褪黑激素的催眠作用,提示褪黑素的催眠作用由GABA能系统介导.
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大鼠展神经核到动眼神经核投射的神经递质检测
①目的研究大鼠展神经核到动眼神经核投射通路的神经递质.②方法对10只大鼠(实验组)内侧纵束于展神经核水平进行机械损毁后,通过免疫组织化学染色,观察动眼神经核中谷氨酸和天冬氨酸的变化,并与对照组(10只大鼠)进行比较.③结果机械损毁后,大鼠展神经核的核间神经元明显变性;实验组动眼神经核内直肌亚核区谷氨酸和天冬氨酸的免疫阳性产物较对照组明显减少(t=3.154、3.067,P<0.01).④结论谷氨酸和天冬氨酸是展神经核到动眼神经核投射的神经递质.
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电针结合益髓汤对铝痴呆兔脑脊液及海马区谷氨酸含量的影响
目的：观察电针结合益髓汤对铝中毒痴呆模型受试兔脑脊液及海马区谷氨酸含量的影响。方法：将50只受试兔随机分为空白组、模型组、电针组、中药组和针药组，项背部皮下注射氯化铝制作病理模型，给予相应的电针、中药、生理盐水后，用比色法检测脑脊液及海马区谷氨酸的含量变化。结果：与空白组比较，模型组谷氨酸含量明显异常升高。与模型组比较，针刺组、中药组和针药组脑脊液及海马区中谷氨酸含量降低。结论：电针结合益髓汤对模型兔异常升高的脑脊液及海马区谷氨酸含量具有治疗性下调作用。
