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MS-275抑制肝癌细胞HepG2增殖及其相关信号传导机制的体外实验研究
目的 研究组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂MS-275诱导人肝癌细胞株HepG2细胞周期阻滞作用,并对其信号传导机制进行初步探讨.方法 体外培养人肝癌细胞株HepG2;应用MTT比色法观察MS-275对HepG2的生长抑制作用,应用流式细胞仪检测MS-275对细胞周期的影响;Westem印迹分析细胞周期蛋白(Cyclin)D1、p21、p-p38MAPK三种蛋白表达的差异.结果 HDAC抑制剂MS-275能抑制肝癌细胞生长,具有时间和剂量的依赖性.可以引起细胞周期Go-G1期阻滞.MS-275可以使HepG2细胞p21蛋白表达提高,Cyclin D1蛋白表达降低,在SB203580组两蛋白的表达又恢复到对照组水平.p-p38MAPK蛋白在两组表达均提高.结论 MS-275能诱导肝癌细胞株的细胞周期阻滞,这种作用可能是通过p8MAPK信号传导途径介导的,与下调Cyclin D1的表达、上调p21的表达有关.
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肺癌肿瘤抑制物1转染HepG2肝癌细胞及对细胞周期、细胞凋亡及caspase-3的影响
目的 将已构建完成的携带增强绿色荧光蛋白基因的TSLC1真核表达载体转染到HepG2细胞中,观察其对HepG2肝癌细胞的作用.方法 脂质体Lipofectamine 2000介导重组载体转染到HepG2肝癌细胞中,经G418筛选建立稳定转染细胞株,分别采用RT-PCR、免疫组化法和Western印迹法检测其表达;同时检测细胞周期、凋亡及caspase-3酶活性.结果 与对照组比较,RT-PCR方法可见转染组细胞TSLC1 mRNA表达明显增多(P＜0.05),免疫组化和Western印迹法可见转染组细胞TSLC1蛋白表达明显增高(P＜0.05);流式细胞仪检测发现转染组G_0/G_1期细胞显著增多,而S期细胞明显降低(P＜0.05),转染组细胞凋亡比例明显比对照组多(P＜0.05);caspase-3酶活性显著增多(P﹤0.05).结论 本实验成功建立了稳定转染TSLC1的HepG2细胞株,并证实TSLC1能够阻滞细胞周期,促进凋亡及提高caspase-3酶活性.
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JNK通路介导Ghrelin对肿瘤坏死因子-α诱导的HepG2细胞间黏附分子-1 mRNA表达的抑制
目的 研究Ghrelin对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导的HepG2细胞细胞间黏附分子-1(ICAM-1)mRNA表达水平的影响及c-Jun氨基末端激酶(JNK)在其中的作用.方法 HepG2细胞培养,加入不同浓度TNF-α,采用RT-PCR检测ICAM-1 mRNA的水平.给予Ghrelin预处理1 h后,再加入TNF-α检测ICAM-1变化.免疫印迹法检测胞浆p-JNK的表达.结果 TNF-α浓度依赖地增高HepG2细胞ICAM-1 mRNA的表达;Ghrelin 组的ICAM-1 mRNA的表达减低; TNF-α组p-JNK增加,Ghrelin组较TNF-α组减少.结论 TNF-α可能通过p-JNK通路介导HepG2细胞 ICAM-1 mRNA的表达;Ghrelin可能通过抑制p-JNK通路抑制 ICAM-1的表达.
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p33ING1转染HepG2肝癌细胞对p21WAF1/ CIP1表达的影响
目的 探讨p33ING1对pcDNA3.1-p33ING1转染后的HepG2肝癌细胞p21WAF1/CIP1表达的影响.方法 实验分为对照组和转染组;将pcDNA3.1-p33ING1及空载质粒pcDNA3.1转染到HepG2细胞中,终建立稳定转染的细胞株,RT-PCR检测p33ING1表达;RT-PCR和免疫组化检测P21WAF1/ CIP1mRNA和蛋白质表达.结果 与对照组比较,转染组p33ING1mRNA表达明显增高(P＜0.05),p21WAF1/CIP1mRNA及蛋白质表达亦明显高于对照组(P＜0.05).结论 成功建立pcDNA3.1-p33ING1的HepG2细胞株,并证实p33ING1影响p21WAF1/ CIP1mRNA和蛋白质的表达.
关键词： p33ING1 p21WAF1/CIP1 HepG2 抑癌基因 -
核心蛋白聚糖对HepG2细胞表皮生长因子受体转导蛋白及Ras/Raf信号通路的影响
目的 将核心蛋白聚糖(DCN)真核表达载体转染到HepG2中并检测其表皮生长因子受体(EGFR)表达.方法 经大肠杆菌JM109介导DCN真核表达载体转染HepG2细胞,建立稳定转染的细胞株,采用Westem印迹法和免疫组化检测其EGFR表达.结果 pFRT/laczeo-DCNHepG2细胞中EGFR较pFRT/laczeo HepG2明显高表达；pFRT/laczeo-DCN HepG2细胞中EGFR颗粒明显减少、变小.结论 DCN转染的HepG2细胞TGFR减少,能够抑制MAPK/Ras/Raf信号通路,从而阻止、抑制HepG2的生长.
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重组家蚕素Ⅱ基因稳定转染HepG2细胞及鉴定
目的 重组家蚕素Ⅱ基因( MBbxⅡ)稳定转染HepG2细胞,为研究MBbxⅡ在哺乳动物细胞中的生物学作用奠定基础.方法 含有MBbxⅡ质粒转化大肠杆菌DH-5α感受态菌,挑取单克隆摇菌,中量提取质粒,转染HepG2细胞45 d,G418筛查.挑细胞单克隆继续培养,待细胞融合80％提取RNA并进行逆转录,RT-PCR鉴定目的条带.结果 稳定转染MBbxⅡ于HepG2细胞中,转染后细胞可正常分裂增殖.结论 本研究成功稳定转染MBbxⅡ基因于HepG2细胞中.
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survivin在二烯丙基二硫诱导HepG2细胞凋亡中的作用
目的:研究Surivin在二烯丙基二硫(diallyl disulfide,DADS)诱导HepG2细胞凋亡中的作用.方法:MTT法检测细胞的生长活性;流式细胞仪检测细胞周期;RT-PCR法检测survivin mRNA水平;Western blot法检测survivn蛋白水平.结果:用药组HepG2细胞活性与正常组相比,随着药物浓度的增加(25,50,100,200μ mol/l),分别下降了9.3%、10.4%、21.6%、31.2%,HepG2细胞凋亡率分别增加0.83%、1.97%、6.0%、9.9%,低浓度(25,50 μ mol/l)的DADS可以诱导survivin mRNA和蛋白表达升高,而高浓度的(100,200u mol/l)DADS可以降低survivin mRNA和蛋白表达.结论:DADS诱导HepG2细胞survivin表达增加,抵抗DADS诱导HepG2细胞的凋亡作用.
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间充质干细胞双标记光学成像的体内试验研究
目的:验证双标记生物发光成像活体观测MSCs在肝癌裸鼠模型向肿瘤病灶的趋化作用的可行性.方法:应用fluorescence (荧光)与bioluminescence(生物发光)两种成像方法,对MSCs进行CM-DiI荧光标记及对人肝癌细胞HepG2进行Fluc-慢病毒感染并由此建立裸鼠肝癌模型,构建双标记成像系统,应用精诺真小动物光学成像仪在裸鼠肝癌模型中观测间充质干细胞向肿瘤的趋化作用.结果:在鼠尾静脉注射标记MSCs细胞后21天荧光成像可见MSCs主要积聚于肿瘤病灶处及肝脏.生物发光成像后可监测到病灶处由luciferase标记肿瘤细胞(HepG2)发出荧光;将荧光成像与生物发光成像所得图像经后处理融合后,可见证间充质干细胞像肿瘤病灶定向迁徙的生物过程.经肿瘤病理切片证实间充质干细胞成功迁徙至肿瘤痛灶中.结论:应用间充质干细胞双标记光学成像系统实现MSCs在活体内对肿瘤的趋化过程进行观测是可行的.这种成像方法可作为下一步以MSCs为载体的肿瘤基因治疗的有效监测手段.
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紫草素对人肝癌HepG2细胞增殖的抑制及诱导凋亡作用
目的:观察紫草素抑制人肝癌HepG2细胞增殖及凋亡诱导的作用.方法:用不同浓度的紫草素处理UepG2细胞,MTT检测紫草素对HepG2细胞生长增殖的抑制作用;比色法测定Caspase-3酶活性;Western blot法检测磷酸化Akt蛋白(pAkt)的表达.结果:紫草素能够抑制人肝癌HepG2细胞的增殖,并呈浓度、时间依赖性,紫草素与nepG2细胞作用24小时后Caspase-3酶活性显著增强,显示紫草素诱导的调亡作用随时间的延长而增加;同时,紫草素处理HepG2细胞后,随着药物浓度的增加,磷酸化Akt蛋白表达下降.结论:紫草素可抑制人肝癌细胞HepG2的增殖,诱导HepG2细胞凋亡,凋亡机制可能与紫草素抑制P13K/Akt信号途径有关.
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NAIF1对肝癌细胞HepG2增殖与迁移能力的影响
目的:在肝癌细胞HepG2中过表达外源NAIF1(核凋亡诱导因子1),探讨NAIF1的亚细胞定位以及对HepG2增殖和迁移能力的影响.方法:以真核表达质粒pEGFP-N1为对照组,pEGFP-N1-NAIF1为实验组,瞬时转染肝癌细胞HepG2,利用免疫印迹方法检测NAIF蛋白表达效率;以DAPI染核,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白定位,确定NAIF1的亚细胞定位;通过MTT方法绘制细胞增殖曲线;通过transwell小室法检测NAIF1对HepG2迁移能力的影响.结果:在肝癌细胞HepG2中,外源表达NAIF1主要定位于细胞核;与对照组HepG2/pEGFP-N1相比,HepG2/pEGFP-N1-NAIF1的细胞增殖、迁移能力下降(P＜0.05).结论:外源表达NAlF1蛋白定位于HepG2细胞核,过表达NAIF1抑制HepG2的细胞增殖与迁移能力,NAIF1可能作为肝癌治疗的潜在靶点.
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5-脱氧杂氮胞苷对人肝癌细胞HepG2增殖及beclin1表达的影响
目的:观察5-脱氧杂氮胞苷(5-aza-CdR)对HepG2细胞生长抑制及beclin1表达的影响,以探讨其抗肿瘤发生的潜在机制.方法:采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测5-aza-CdR对HepG2细胞的生长抑制；用相差显微镜观察不同药物浓度下不同时间段的肝癌细胞形态学改变；采用RT-PCR法和Weste(rn) blot法检测5-Aza-CdR对抑癌基因beclin1的mRNA和蛋白表达的影响.结果:5-aza-CdR可抑制HepG2细胞生长,呈剂量依赖性,并上调beclin1的mRNA和蛋白的表达.结果:显示102.4umol/L5-aza-C-dR作用72小时细胞增殖抑制率高,可达(84.3±3.31)％,beclin1的mRNA和蛋白表达上调明显,与对照组相比差异有统计学意义.结论:5-aza-CdR可抑制HepG2细胞增殖,其机制可能是通过恢复某些抑癌基因的表达,上调beclin1的mRNA和蛋白表达.
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JKA97诱导HepG2凋亡及其分子机制研究
目的:研究药物JKA97对人肝癌细胞HepG2增殖的抑制作用及其分子机制.方法:采用MTT法观察药物JKA97对细胞增殖的影响;倒置显微镜观察细胞形态变化;流式细胞术检测细胞凋亡;Western blot方法检测线粒体融合蛋白mfn2表达水平变化.结果:药物JKA97抑制人肝癌细胞HepG2细胞增殖,5、10、20 μmol/L作用组24 h抑制率分别为34.26%、43.08%、54.02%;药物JKA97诱导人肝癌细胞HepG2凋亡,10、20 μmol/L JKA97作用HepG2细胞24h,细胞凋亡率分别为22.9%、72.9%;线粒体融合蛋白mfn2表达水平显著降低.结论:药物JKA97对人肝癌细胞HepG2生长具有明显的增殖抑制作用,诱导细胞凋亡;线粒体融合蛋白mfn2表达水平降低可能是其重要的分子机制之一.
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TRAIL慢病毒载体构建及其在肝癌细胞中的表达
目的:构建携带TRAIL基因的慢病毒表达载体并实现其在肝癌细胞株HepG2中的稳定高表达.方法:构建TRAIL重组慢病毒表达载体pCDH-CMV-TRAIL-EF1-GFP-T2A-Puro,脂质体法将重组慢病毒载体和包装质粒混合物共转染293T细胞,包装产生慢病毒颗粒,纯化并测定病毒滴度.利用Western blotting检测TRAIL蛋白在HepG2中的表达.结果:酶切以及测序证实,成功构建TRAIL基因重组慢病毒载体,纯化的慢病毒滴度为1.02× 104 ifμ/μL.利用嘌呤霉素筛选获得稳定表达TRAIL的细胞系,经Western blot方法检测到TRAIL蛋白的稳定高表达.结论:成功构建了带有TRAIL基因的慢病毒载体,并实现其在HepG2的稳定高表达.
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肝脱细胞基质溶液包被对HepG2细胞增殖及基质金属蛋白酶活性的影响
目的:建立由猪肝组织制备肝脱细胞基质溶液的新方法,并研究基质溶液包被对人肝癌细胞HepG2增殖及基质金属蛋白酶活性的影响.方法:对猪肝脏进行脱细胞处理,经研磨、冻干及胃蛋白酶消化制备肝脱细胞基质溶液,利用此基质溶液包被聚苯乙烯培养表面,进行HepG2细胞体外培养,并使用CCK-8、实时定量PCR、明胶酶谱等检测细胞增殖以及基质金属蛋白酶的基因表达和活性.结果:建立了由猪肝组织制备肝脱细胞基质溶液的新方法.与未包被组相比,脱细胞基质溶液包被培养显著促进HepG2细胞增殖,其细胞周期蛋白cyclin D1的基因表达增高,为未包被组的1.95倍(P＜0.01).此外,脱细胞基质溶液包被组HepG2细胞的MMP14基因表达为未包被组的2.01倍(P＜0.05),明胶酶谱检测基质溶液包被组细胞的MMP9活性为未包被组的6.66倍(P＜0.01).结论:肝脱细胞基质溶液包被培养可显著促进HepG2细胞增殖并提高其MMP9的活性,在构建模拟肝癌微环境培养体系中具有一定的应用潜力.
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人肝癌细胞系HepG2中survivin-3鉴定及其真核载体构建
目的:鉴定肝癌细胞系HepG2中survivin异构体(survivin variant,SVV variant)并构建其真核表达栽体.方法:提取HepG2细胞总RNA,根据Gen-Bank内survivin 3个异构体核苷酸序列设计3条引物对其进行鉴定;设计含有BamH I和Xho I双酶切位点的SVV-3引物,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增SVV-3完整编码区,扩增产物用BamHI和XhoI双酶切后定向克隆到真核细胞表达栽体pcDNA3.1中,序列测定进行鉴定.结果:HepG2细胞表达SVV-3、1,SVV-3表达尤为丰富.对SVV-3克隆测序,与Gen-Bank报道完全一致.结论:成功鉴定出HepG2表达SVV-3、1,构建了SVV-3真核表达载体.
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酸性环境诱导肝癌HepG2细胞EMT
目的 研究酸性环境对肝癌HepG2细胞上皮细胞间质转化(EMT)的影响.方法 分别在酸性和碱性条件下培养HepG2细胞,观察细胞形态的区别.划痕实验检测两组细胞的迁移能力,Matrigel侵袭实验检测细胞的侵袭能力.RT-PCR检测两组细胞EMT相关基因mRNA的表达水平.Western blot检测两组细胞EMT相关基因蛋白的表达水平.结果 酸性条件下培养的HepG2细胞形态明显从上皮型转变为间质型;酸性条件下HepG2细胞的迁移能力明显强于碱性条件下;酸性条件下HepG2细胞穿越Matrigel的数量明显多于碱性条件下;酸性条件下HepG2细胞EMT相关基因Vimentin、Slug、Snail及Zeb1的mRNA表达以及EMT相关蛋白Vimentin和MMP9的表达强度均明显高于碱性条件下.结论 酸性环境能诱导肝癌HepG2细胞EMT的发生.
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HepG2细胞培养的相关条件
HepG2人肝肿瘤细胞株广泛应用于遗传毒理学及病毒培养等方面的研究,研究肝脏疾病发病机理及其临床应用有着重要意义.由于其与肝细胞具有相同的生物学活性,还被用于胰岛素抵抗的研究.本文对肝癌细胞培养的佳条件做一简单综述.
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用体外实验的方法评价CIK细胞抗肝癌细胞作用的研究
目的 探讨细胞因子激活杀伤(CIK)细胞体外对肝癌肿瘤细胞株的杀伤作用.方法 采集健康人外周血单个核细胞,用无血清培养基经白介素2(IL-2)、干扰素 (IFN-γ)、CD3Mc-Ab、白介素1α(IL-1α)诱导,制备CIK细胞,流式细胞仪检测CIK细胞的免疫表型.结果 CIK细胞与对照组细胞相比增殖速度快,增殖倍数高对肝癌细胞具有强的杀伤活性.结论 CIK细胞具有较强的抗肝癌细胞活性,CIK细胞过继免疫治疗是一种非常有前景的抗肿瘤治疗方法.
关键词： 细胞因子诱导杀伤细胞 细胞培养技术 HepG2 -
降糖宁胶囊对HepG2细胞糖代谢作用及其作用机制的研究
目的 观察降糖宁胶囊(人参、山药、石膏、知母等)对HepG2细胞糖代谢的影响,并探讨其降糖机制.方法 体外培养人肝癌HepG2细胞,MTT法检测降糖宁对细胞活力的影响;HE染色法观察降糖宁对细胞形态的影响;采用葡萄糖氧化酶法检测降糖宁对细胞糖消耗的影响;Western-blot检测磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)及人胰岛素受体底物(IRS1)表达量.结果 降糖宁胶囊对HepG2细胞的活力和形态无明显影响,可明显促进HepG2细胞对葡萄糖的消耗,能促进AMPKβ1/2、IRS1蛋白表达量.结论 降糖宁胶囊的降糖机制可能涉及对胰岛素受体信号通路及AMPK信号通路的影响.
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覆盆子酮对HepG2细胞胰岛素信号转导通路中SHP-1和IRS-1表达的影响
目的 观察覆盆子酮对HepG2细胞糖消耗的影响及胰岛素信号转导通路中SHP-1和人胰岛素受体底物(IRS-1)表达的影响.方法 体外培养人肝癌HepG2细胞,采用MTT法检测细胞活力;葡萄糖氧化酶法检测细胞糖消耗;RT-PCR法检测蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-1的基因表达;Western-blot法检测IRS-1的表达量.结果 覆盆子酮可明显促进HepG2细胞对葡萄糖的消耗,明显降低HepG2细胞SHP-1 mRNA基因表达量,并能促进IRS-1蛋白表达量.结论 覆盆子酮可能通过影响胰岛素信号转导通路中IRS-1和SHP-1的表达发挥降糖作用.
