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副流感病毒5型CC-14株辅助质粒的构建及鉴定
目的 构建副流感病毒5型(parainfluenza virus 5,PIV5)CC-14株核衣壳蛋白(nucleoprotein,NP)、磷蛋白(phosphoprotein,P)和聚合酶蛋白(large protein,L)基因真核表达质粒,并在MDCK细胞中表达,为该病毒反向遗传系统的建立奠定基础.方法 根据PIV5 CC-14株全基因组中的NP、P和L基因分别设计特异性引物,经RT-PCR扩增得到NP、P和L基因,酶切后分别连接至pcDNA3.1+真核表达载体(或pMD18-T)上,构建辅助质粒pcDNA3.I-NP、pcDNA3.1-P和pcDNA3.I-L,转染MDCK细胞,RT-PCR检测NP、P和DL基因的转录情况.结果 经双酶切及测序鉴定证明辅助质粒pcDNA3.1-NP、pcDNA3.1-P和pcDNA3.1-L构建正确,3个质粒转染MDCK细胞后,经RT-PCR分别可扩增得到NP、P和DL基因片段.结论 成功构建了PIV5 CC-14株pcDNA3.1-NP、pcDNA3.1-P和pcDNA3.1-L辅助质粒,且均可在MDCK细胞中有效转录,为该病毒反向遗传系统的建立奠定了基础.
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eIF4E与恶性肿瘤的关系
翻译水平调节对真核细胞基因表达调控有着非常重要的作用.真核细胞起始因子4E(eukaryot-ic initiation factor 4E,eIF4E)是mRNA帽结合磷蛋白,是帽依赖性mRNA翻译过程中的限速因子.
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生长相关蛋白的生理病理作用
神经生长相关蛋白(growth associated protein,GAP-43)是脊椎动物神经细胞膜上的一种特异性磷蛋白,在脑中分布广泛但不均一,在神经系统的发育和损伤再生等事件中,常能检测到GAP-43在mRNA和蛋白水平上明显升高,因此,国际上已将GAP-43列为研究神经生长发育和损伤修复等的首选分子探针.
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戊型肝炎病毒抗原研究进展
戊型肝炎病毒(HEV)为线状单股正链RNA病毒,基因组全长约7.5kb(7.2~7.6kb),编码2 400~2 533个氨基酸,由5'端非结构区(NS)和3'端结构区(S)组成,3'端带一个由150~200个腺苷酸残基组成的poly A尾巴.HEV基因组含3个开放读码框架(ORFs),ORF1位于5'NS区,长5 079bp(第28~5107nt),编码HEV复制相关蛋白,包括甲基转移酶、木瓜酶样的蛋白酶、解旋酶、RNA依赖性RNA聚合酶(RDRP);ORF2从ORF1终止密码下游37个bp开始,长1 980bp(第5 147~ 7127nt),编码660个氨基酸,主要包括信号肽和衣壳蛋白;ORF3位于ORF1、ORF2之间(第5 106~5 478nt),与两者均有部分重叠,长369bp,编码一段123个氨基酸的多肽,功能不清.有学者认为ORF3编码的蛋白是一种与细胞骨架有关的磷蛋白,也有认为与转膜元件有关.本文仅就HEV抗原表位及ORF2抗原真核表达的研究进展简要综述如下.
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恶性疟原虫海南株MESA基因的序列分析
成熟疟原虫感染红细胞表面抗原( mature parasite-infected erythrocyte surface antigen,MESA)又称恶性疟原虫红细胞膜蛋白 2 (Plasmodium falciparum erythrocyte membrane protein 2,PfEMP2)或PP300,是成熟期疟原虫合成的磷蛋白.它通过小泡运送至感染的红细胞膜骨架上[1,2],与红细胞蛋白4.1以非共价方式紧密结合.MESA包含7个明显的重复区,重复区占全部氨基酸残基的60%[3].
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胰腺癌组织中骨桥蛋白与血管内皮生长因子的表达及其临床意义
胰腺癌是预后较差的恶性肿瘤之一,5年生存率不足5%.其主要因素在于胰腺癌早期诊断率较低且易转移;约半数患者确诊时已发生转移,而丧失手术机会.骨桥蛋白(osteopontin,OPN)是一类分泌型的糖基化磷蛋白,其在结直肠癌、胃癌等多种恶性肿瘤的原发肿瘤及其转移瘤组织中呈高表达.
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人呼吸道合胞病毒RNA聚合酶复合体蛋白N、P、L和M2-1重组质粒的构建和鉴定
目的 构建可表达人呼吸道合胞病毒(RSV)转录延长/终止抑制因子M2-1(简称M2-1)、核蛋白(N)、磷蛋白(P)和大蛋白(L)的真核表达载体并鉴定蛋白表达情况.方法 采用合成T7启动子Oligo DNA及PCR方法获得含有T7启动子的表达盒,通过体外连接方法克隆入载体px8δT,制备表达载体px8δT-PT.设计3对PCR引物,PCR扩增出RSV的M2-1、N和P基因,并克隆至px8δT-PT,构建px8δT-PT-M2-1、px8δT-PT-N和px8δT-PT-P.同时利用已有的质粒pcDNA3.1-L构建px8δT-PT-L.用重组质粒转染 BSR T7/5细胞,72 h后再用Western blot法鉴定蛋白的表达.结果 成功实现px8δT的改造,构建的4种重组质粒px8δT-PT-M2-1、px8δT-PT-N、px8δT-PT-P和px8δT-PT-L,经限制性内切酶分析与预期一致,经Western blot法分析证实M2-1、N及P蛋白被表达.结论 获得以T7为启动子的表达载体px8δT-P,成功构建了含有M2-1、N及P编码基因的表达载体,为利用反向遗传学技术进一步改造RSV奠定了基础.
关键词: 人呼吸道合胞病毒 核蛋白 磷蛋白 转录延长/终止抑制因子M2-1 大蛋白 -
骨桥蛋白与乳腺癌的关系
近年来,在世界范围内乳腺癌的发病率呈逐年升高的趋势,骨桥蛋白(osteopontin,OPN)是一种分泌型、黏附性的糖基化磷蛋白.近年来的研究揭示,OPN在肿瘤细胞的黏附、移行、浸润、血管新生、凋亡以及肿瘤的微环境中起关键作用~([1-2]),现将其与乳腺癌的关系综述如下.
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博尔纳病病毒p24和p40基因星形胶质细胞特异表达重组质粒的构建
目的 构建星形胶质细胞特异性表达的博尔纳病病毒磷蛋白和核蛋白基因重组质粒,以供后续实验研究使用.方法 用PCR方法扩增BDV p24和p40基因完整序列同时加入Nhe Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切位点,将所得目的片段克隆至pMD18-T载体,再通过酶切连接将其连接至pCMvie-GFAP质粒中的GFAP启动子的下游,分别得到p24和p40重组质粒.用酶切、PCR以及测序3种方法鉴定重组质粒,并将质粒转染人胶质瘤细胞株(U251),采用免疫细胞化学方法检测目的蛋白表达.结果 pCMvie-GFAP-BDVp24和pCMvie-GFAP-BDVp40重组质粒经酶切、PCR鉴定可见目的条带位置与预期相符,经测序可见插入序列正确,质粒转染U251细胞后,经免疫细胞化学检测到目的蛋白表达.结论 成功构建了pCMvie-GFAP-BDVp24和pCMvie-GFAP-BDVp40星形胶质细胞特异性表达质粒,为研究这两种病毒蛋白的致病机制及其对星形胶质细胞的影响提供了工具.
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狂犬病毒糖蛋白研究进展
狂犬病是由狂犬病毒(Rabies virus,RV)引起的人兽共患传染病,一旦发病,病死率几乎100%,是人类病死率高的急性传染病.狂犬病毒是单股负链RNA病毒.病毒基因组长约12kb,由3'端至5'端依次排列着N、P、M、G和L5个狂犬病毒的结构基因,分别编码核蛋白、磷蛋白、基质蛋白、糖蛋白和转录酶大蛋白.由G基因编码的糖蛋白,是病毒与宿主细胞结合的配体,介导了病毒与靶细胞的结合及在神经系统的分布,不但与病毒的毒力、致病性密切相关,而且是狂犬病毒的主要保护性抗原,能刺激机体产生中和抗体,保护机体抵抗病毒的感染.本文结合我们的研究工作,对近年来狂犬病毒糖蛋白的研究进展作一综述.
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博尔纳病病毒持续感染的原因及意义
近年来许多国家尼巴病毒和西尼罗河病毒脑炎的暴发流行,导致感染区内数千人短时间内迅速死亡;2004年以来爆发的禽流感病毒等都引起了人类极度恐慌和巨大的经济损失.这些疾病的出现引起了研究者们对新发病毒感染性疾病的高度关注.BDV可能也是新发感染性疾病中的一种病原体,研究者们近年亦对其进行了广泛的研究.博尔纳病(Borna disease,BD)是19世纪末首先在德国马匹发现的一种神经综合症.其病原体博尔纳病病毒(Borna disease virus,BDV)是一种非分节段的单股负链RNA病毒,属于单分子负链RNA病毒目博尔纳病毒科,具有8.9 kb基因组,包括6 个开放读码框架,分别编码核蛋白(N) 、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G)、RNA聚合酶(L)、病毒蛋白(X).该病毒虽然在世界多个国家和地区均有发现,但临床病例主要集中在中欧[1].
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胶原蛋白的6个基本问题
胶原蛋白是常见蛋白质之一我们每天通过食物摄入各种各样的蛋白质,如乳清蛋白(来自奶类)、酪蛋白(奶类)、卵白蛋白(蛋类)、卵磷蛋白(蛋类)、大豆蛋白(大豆)、肌蛋白(肉类)、谷蛋白(大米和小麦)、麦胶蛋白(小麦)、白蛋白(肉类、肝脏和血液)、血红蛋白(血液)、弹性蛋白和胶原蛋白(动物皮、骨骼、筋等结缔组织)以及各种酶蛋白(动植物细胞).
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正交设计法选择测定奶粉中磷含量的预处理条件
奶粉中磷多以核蛋白、磷蛋白、磷酯等有机磷形式存在,是人体必需的营养成分[1].目前奶粉中磷的测定方法常用的是分光光度法[2],由于其样品预处理采用湿式消化法,处理样品时存在元素易损失,试剂用量大,易污染及酸量影响显色效果等不足,本文采用压力溶弹法在密闭容器内加压消解,能够克服湿法之不足,并应用正交设计法[3原理,以奶粉为样品,对溶弹法中影响样品预处理的因素进行选择试验,通过三因素两水平试验,确定佳的奶粉中磷含量的预处理条件,在较短时间内用较少实验次数获得理想的预处理效果.
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人呼吸道合胞病毒RNA聚合酶复合体蛋白N、P的表达鉴定
本研究根据编码A亚型人呼吸道合胞病毒(Human Respiratory Syncytial Virus,HRSV)核壳体蛋白(Nucleocapsid protein, N)和磷蛋白(phosphoprotein, P)的基因序列,各设计一对特异性的引物,应用RT-PCR技术,从感染HRSV的HEp-2细胞中扩增获得n和p的基因片断,克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+).获得的重组质粒通过脂质体Lipofectamine 2000转染COS-7细胞,72 h后再用Western blot鉴定蛋白的表达.结果显示真核表达载体pcDNA3.1(+)/N和pcDNA3.1(+)/P的限制性内切酶分析结果与预期一致,基因序列分析显示没有发生无义突变,利用蛋白印记方法也检测到了N和P的特异性条带.于是我们认为成功构建了含有HRSV N和P编码基因的真核表达载体,在真核细胞内能顺利表达.为进一步开展HRSV反向遗传学等研究奠定了基础.
关键词: 人呼吸道合胞病毒(hRSV) 核壳体蛋白 磷蛋白 真核表达 -
小鼠肝细胞表皮生长因子信号转导相关磷蛋白的动力学研究
目的 探讨小鼠肝细胞中表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)信号转导相关磷蛋白的动力学改变及其对信号转导终生理效应的影响.方法 采用双向电泳及放射性同位素标记技术,并结合相关数据库资源,分析小鼠肝细胞在饱和浓度EGF持续刺激不同时间得到的EGF信号相关磷蛋白磷酸化水平的动力学变化.结果 小鼠肝细胞内EGF信号转导途径中,大多数的磷蛋白都表现为激活后很快恢复到未刺激状态;个别磷蛋白则表现为持续活化状态,如Eps15和ERK2.结论 在细胞整体水平上,EGF信号途径中磷蛋白表现的动力学行为是受到整个信号转导系统整合后的动力学行为;个别磷蛋白表现为持续活化状态,这些改变可能与肿瘤的发生、发展有密切关系.
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博尔纳病毒P24转染后不同时期核酸和蛋白的表达及细胞定位
目的 通过观察博尔纳病毒(borna disease virus,BDV)磷蛋白(P24)及其编码核酸不同时期的表达和细胞定位,探索BDV潜伏感染的机制.方法 构建包含BDV GFP-P24质粒的OL细胞模型,检测并比较不同时期P24核酸和蛋白的表达;对构建的OL细胞模型和各种阴性对照进行逆转录原位PCR的检测,观察P24蛋白编码核酸的细胞定位;使用倒置荧光显微镜观察OL细胞中P24蛋白的细胞定位.结果 成功构建了含BDV GFP-P24质粒的OL细胞,发现转染后20代以内细胞P24核酸和蛋白的表达差异不显著(P>0.05);BDV的P24重组蛋白基因始终定位于细胞核,其蛋白早期在细胞核出现,反复传代约15次后可同时在细胞核和细胞质内出现.结论 BDV的重组蛋白P24在病毒感染过程中起关键作用,其编码基因始终存在于宿主细胞核内,但表达的蛋白可以在一定时期通过核膜进入细胞质.
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表达A型H5N1血凝素的重组副流感病毒5能使小鼠抵抗高致病性禽流感病毒H5N1的攻击
安全有效的疫苗是阻止高致病性( HPAI)禽流感病毒H5 N1在人群中大规模暴发的好方法。目前FDA批准的H5 N1疫苗有明显的局限性,因此,迫切需要更加有效的H5N1疫苗问世。副流感病毒5( PIV5)是一种副黏病毒,在人群中不引起任何疾病,因此是一种可行的疫苗载体。在我们的研究中,用单剂量的表达有来自一 H5 N1亚型病毒血凝素(HA)的重组活PIV5(rPIV5-H5)免疫小鼠,发现对致死剂量的HP AI H5 N1攻击具有免疫作用。另外,我们试验了把H5N1 HA插入到PIV5基因组中不同位置对PIV5制成的疫苗有效性的影响。有趣的是,当把H5N1的HA插在前导序列,即PIV5启动子和第一个病毒基因(其编码核蛋白NP )之间时,不能产生有活力的病毒。当把 H5 N1的 HA 插在NP和下一个基因V/磷蛋白( V/P )之间时,能引起病毒生长缺陷。当把H5 N1的HA插在小疏水基因(SH)和血凝素-神经氨酸酶基因(HN)交界处时,其制成的疫苗对HPAI H5N1有好的免疫力:在小鼠试验中,只要用1000 PFU的剂量便已足够。本研究说明了表达有H5N1 HA 的重组PIV5有潜力成为HP AI H5 N1的候选疫苗。