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人脐血细胞在肝损伤裸鼠体内向肝细胞的分化
目的探讨在制备的肝损伤模型中人脐血单个核细胞向肝细胞的分化能力. 方法采用腹腔注射CCl4和5-氟尿嘧啶的方法制备肝损伤模型,将分离的脐血单个核细胞以2×107/ml经尾静脉注射入裸鼠体内.4周后处死裸鼠取肝组织.以RT-PCR方法对ALB、AFP mRNA的表达进行检测;并用免疫组织化学SP染色检测人HSA、PCNA、ALB的表达情况.结果RT-PCR显示ALB、AFP mRNA在人肝组织移植组中表达呈阳性,而在损伤未移植组和正常对照组表达为阴性;免疫组织化学染色表明,在裸鼠肝实质区域出现人HSA、PCNA和ALB阳性表达细胞.结论人脐血单个核细胞在裸鼠体内确有向肝细胞分化的趋势.
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几种细胞因子对人脐血CD34+干细胞在体外诱导扩增为树突状细胞的研究
多种疾病用树突状细胞(dendritic cell, DC)作免疫治疗具有一定的疗效.由于DC在人体组织中含量甚微,限制了DC的研究及临床应用.因此如何获得足够的成熟DC便成为DC广泛应用的关键技术问题.我们比较了不同细胞因子组合对脐血CD34+造血干细胞在体外诱导扩增为DC的效率及功能的影响,提供一种体外获得大量成熟DC的有效途径.
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树突状细胞在再生障碍性贫血发病中的变化
树突状细胞(DC)在自身免疫性疾病的发病过程中起重要作用,Ⅰ型DC促进TH1细胞极化,与多种自身免疫性疾病发病密切相关.本研究检测了再生障碍性贫血(简称再障,AA)患者骨髓中Ⅰ型DC的含量,探讨DC负载人脐血CD34+细胞后在rhsCD40L的激发作用下对自体T细胞的活化和扩增变化.
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人脐血间充质干细胞体外分离培养的实验研究
目的 探讨来源于人脐血的间充质干细胞(MSCs)在体外分离、纯化和扩增培养的可行性和条件.方法 无菌条件下收集正常足月胎儿的脐带血,经肝素抗凝,用相对密度1.077的淋巴细胞分离液分离脐血的单个核细胞,以偏酸性的MesencultTM作为培养基进行培养和纯化扩增,用流式细胞仪检测MSCs的表面标志.结果 来源于人脐血的单个核细胞种植于特定的培养基中后,可产生贴壁细胞,主要表现为破骨样细胞和间充质样细胞,传3代后,可得纯化扩增的人脐血MSCs.6.6×105个脐血原代MSCs在体外扩增10代后,获得9.9×108个细胞.流式细胞仪检测结果显示,人脐血MSCs不表达CD34、CD11a和CD11b,强表达CD29,弱表达CD71,与骨髓MSCs表面抗原特性一致.结论 源于人脐血的MSCs在体外可以培养、扩增,可作为干细胞来源之一用于实验研究和临床.
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脐血干细胞生物学特性及在脊髓损伤修复中的应用
自从1974 年Kandtzon 等发现人脐血中存在造血干细胞后,国内外学者对脐血干细胞的生物学、免疫学特性及临床应用进行了广泛的研究,证明脐血可以作为一种新的干细胞来源治疗恶性血液病、退行性疾病及修复神经损伤等.目前,人脐血干细胞移植治疗脊髓损伤是脊髓修复领域的研究热点,在动物实验中已取得满意效果,并有初步的临床研究.本文就近几年脐血干细胞的生物学特性及其在脊髓损伤修复中的应用进展做一综述.
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流式细胞术四色荧光分析人脐血和外周血树突状细胞的前体细胞亚群的设门方法
检测循环中树突状细胞的前体细胞(pDC)亚群对评估肿瘤患者的免疫功能状态,了解自身免疫性疾病的发病机理,观察造血干细胞移植后免疫重建等具有重要价值[1-3].
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人脐血内皮祖细胞的体外分离和培养
目的 建立一种稳定的体外分离和培养人脐血来源内皮祖细胞的方法.方法 采用密度梯度离心法从人脐带血中分离单个核细胞,将其接种至人纤维连接蛋白包被的六孔板中,用EGM-2培养基诱导培养.通过形态学观察、细胞表面特异性抗原、摄取功能和体外血管形成能力对内皮祖细胞进行鉴定.结果 细胞形态学观察发现,刚分离的单个核细胞较小,呈圆形,4d后可见少量的圆形和梭形贴壁细胞,8d后有明显集落形成,14 d后相邻集落相互融合,呈现出典型铺路石样改变.内皮祖细胞能摄取乙酰化低密度脂蛋白,结合荆豆凝集素1,表达CD34、CD133和血管内皮细胞生长因子受体2,并且具有体外血管生成能力.结论 采用密度梯度离心法可从人脐带血中成功分离和培养出内皮祖细胞,以用于相关实验研究.
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人脐血源肝干/祖细胞体外定向诱导分化
目的 研究具有多分化潜能的脐血单个核细胞,定向诱导分化成肝干/祖细胞的可能性.方法 采集32份足月分娩后的新鲜脐带血,密度梯度离心法分离出单个核细胞,随即分为两组:①对照组8份脐血:培养液中无细胞因子;②实验组24份脐血,随机分为4组,分别在培养的当天、7、14、21天进行实验测定:培养液中加入细胞因子SCF、OSM、HGF、LIF、FGF-1、FGF-2;观察细胞形态学的变化,RT-PCR定量测定hALBmRNA,细胞免疫化学检测ALB、CK18、CK19的表达.结果 观察到实验组中培养的细胞数目随培养时间的延长逐渐增多,体积增大,折光性增强的形态学变化,RT-PCR检测到hALBmRNA表达逐渐增强,细胞免疫化学显示CK18、CK19、ALB呈阳性表达.结论 脐血单个核细胞在定向诱导下有分化为肝干/祖细胞的能力,可以考虑作为肝干/祖细胞和肝细胞新的细胞来源.
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人脐血内皮祖细胞的体外培养
目的 从人脐带血中分离内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs),建立人脐血内皮祖细胞体外培养的方法,为实现内皮祖细胞的移植及实验研究提供足量的细胞来源.方法 采用密度梯度离心法分离人脐带血内皮祖细胞,在EGM-2培养基中培养,采用流式细胞仪、免疫组化和免疫荧光鉴定EPCs.结果 脐带血单个核细胞在经EGM-2培养过程中出现梭形贴壁和铺路石样等形态;1周后既分化成EPCs,细胞免疫荧光CD133染色率在培养第7天为(67.2±2.12)%,免疫组化CD34染色率为(89.67±2.05)%,流式细胞仪鉴定该种细胞CD133与KDR的双阳性率达87.8%.可确定该细胞为EPSc.结论采用本培养方法可获得良好的内皮祖细胞用于实验研究.
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全反式维甲酸对人脐血CD133+细胞体外短期扩增中生物学特性的影响
维甲酸(RA)对许多细胞的增殖和分化具有调节作用.全反式维甲酸(ATRA)在体内外能诱导急性早幼粒细胞白血病(APL)细胞向成熟粒细胞分化,对造血细胞的调节作用尚未完全明了,有报道认为RA能促进粒系和红系祖细胞的增殖,也有报道认为,RA对造血干/祖细胞(HSPC)的增殖和分化具有抑制作用[1,2].近来有研究显示,RA在体外能促进小鼠HSPC的自我更新,并能延迟HSPC的分化[3,4].为了解ATRA对人脐血HSPC体外增殖和分化的影响,我们观察了ATRA对人脐血CD133+细胞体外增殖和分化的影响.
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人脐血防治白血病化疗后骨髓抑制
1.资料与方法1·1病例资料所有患者均为急性非淋巴细胞性白血病住院病人,M11例,M23例,M42例,M53例,M61例,共10例,化疗方案用经典DA(柔红霉素、阿糖胞苷).
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脐血干细胞移植修复失代偿期肝硬化
背景：国内外研究证实，脐血干细胞可在体内大量扩增、诱导分化成完备的肝细胞，并表现出一定的肝功能。
目的：观察脐血干细胞移植治疗大鼠失代偿期肝硬化的效果。
方法：取20只SD大鼠，以40%四氯化碳花生油诱导大鼠失代偿期肝硬化模型，造模后第8周随机分为对照组与实验组，每组10只，实验组于尾静脉注射1.0×107 L-1的人脐血干细胞悬浮液2 mL，对照组于尾静脉注射细胞培养液2 mL。移植4周后，检测大鼠血清学天冬氨酸氨基转移酶、丙氨酸氨基转移酶、白蛋白、总胆红素、透明质酸、层粘连蛋白、前胶原蛋白Ⅲ及胶原蛋白Ⅳ水平，肝脏组织病理切片结果。
结果与结论：①血清学检测结果：与对照组比较，实验组白蛋白水平增高(P<0.05)，天冬氨酸氨基转移酶、丙氨酸氨基转移酶、总胆红素、透明质酸、层粘连蛋白、前胶原蛋白Ⅲ及胶原蛋白Ⅳ水平降低(P<0.05)。②肝脏病理组织学观察结果：两组肝脏组织均有不同程度的肝硬化，实验组肝硬化程度低于对照组。③结果表明，脐血干细胞移植可有效改善失代偿期肝硬化大鼠的肝组织生理功能。 -
两步法分离人脐血单个核细胞的佳条件
背景:如何获得较为纯化、高活性的干细胞,目前未见深入研究报告,也未见一个标准化操作流程方案.目的:探讨两步法分离人脐血单个核细胞佳分离条件.方法:观察羟乙基淀粉在20,30,40,50,60,70 min不同时间沉淀脐血中红细胞的效果;使用人淋巴细胞分离液,分别在800,700,600,500,400 g/min,离心30,25,20 min的条件下分离人脐血单个核细胞.结果与结论:6%羟乙基淀粉沉淀脐血60 min效果好;使用密度为(1.077 0±0.000 1) g/mL人淋巴细胞分离液,在4 ℃条件下以700 g/min离心力,离心30 min,洗涤3次,这样获得的人脐血单个核细胞效果好,所得细胞沉淀中混杂细胞如红细胞及其他细胞碎片较少,人脐血单个核细胞的细胞得率及活力比较高.提示应用羟乙基淀粉沉淀和人淋巴细胞分离液分离两步法,在佳时间条件下可提高脐血干细胞的回收率.
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人巨细胞病毒对人脐血红系祖细胞生长的影响及作用机制研究
人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)感染在我国发生率达80%～90%[1],大多数是潜伏感染.造血系统是其感染的主要受累部位之一,引起各系血细胞减少,其机制尚未明了,本文旨在探讨HCMV对人脐血红系祖细胞生长的抑制和其作用机制.
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抗原诱导的人脐血CTL细胞活性的实验研究
目的 因脐血干细胞增殖能力﹑自我更新能力较强,故脐血造血干细胞生物学特性研究已经成为热点.本文探讨观察了所提抗原及其对人脐血细胞(CTL) 诱导的特异性抗肿瘤作用.方法 用密度梯度离心法提取人肿瘤抗原,并测定诱导的人脐血细胞CTL活性.结果 小肠纤维肉瘤Ag诱导4天后,不同效价实验组CTL活性均有升高,效价1∶100的抗原诱导的CTL活性强.乳腺癌抗原诱导8天后,效价1∶100实验组CTL活性显著提高,结论所提两种抗原效果良好,可明显诱导脐血CTL活性,以效价1∶100实验组佳.
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黄芩甙诱导人脐血间充质干细胞分化为神经元样细胞
目的 探讨中药黄芩甙体外诱导人脐血间充质干细胞(MSCS)分化为神经元样细胞的可行性及其可能的机制.方法 无菌条件下采集正常足月胎儿的脐带血,经肝素抗凝,用相对密度1.077的淋巴细胞分离液分离脐血单个核细胞,加入含黄芩甙50μmol/L的液体培养体系中进行扩增培养.取扩增培养2周的人脐血MSCS进行诱导实验.实验共分3组:诱导组(诱导液和维持液均含黄芩甙300～400 μmol/L);对照1组(诱导液和维持液均不含黄芩甙及其它抗氧化剂);对照2组(诱导液和维持液均含3mmol/L β-巯基乙醇、20g/L二甲基亚砜和20mmol/L丁化羟基苯甲醚,不含黄芩甙).诱导30min后开始在倒置显微镜下动态观察人脐血MSCS生长情况及诱导前后形态学变化.各组分别在诱导6h、24h、7d留取标本制作细胞爬片,用免疫细胞化学染色法评价神经细胞特异性烯醇化酶(NSE)和微管相关蛋白2(MAP-2)阳性细胞的表达率.用Hoechest 33 258染色法评价各组细胞存活率.结果 黄芩甙诱导7d后,人脐血MSCS形成较典型的神经元样细胞形态,免疫细胞化学染色显示黄芩甙诱导组NSE、MAP-2阳性细胞表达率及细胞存活率分别为77.2%±9.8%、76.6%±6.2%、86.5%±5.2%,显著高于对照1、2组(P＜0.01),分别为4.6%±0.7%、0.7%±0.5%、45.7%±8.3%和68.9%±4.5%、51.5%±5.2%、71.6%±6.4%.结论 黄芩甙能诱导人脐血MSCS分化为神经元样细胞,其诱导作用温和、稳定而持久,其诱导机制可能与黄芩甙的抗氧化、调控细胞NF-κB的活性从而刺激多种细胞因子的生成有关.
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抗原诱导的人CTL细胞活性的实验研究
目的:探讨观察所提抗原及其对人脐血细胞(CTL) 诱导的特异性抗肿瘤作用.方法:用密度梯度离心法提取人肿瘤抗原,并测定诱导的人脐血细胞CTL活性.结果:小肠纤维肉瘤Ag诱导4d后,不同效价实验组CTL活性均有升高,效价为1:100的抗原诱导的CTL活性强.乳腺癌抗原诱导8d后,效价1:100实验组CTL活性显著提高.结论:所提两种抗原效果良好,可明显诱导脐血CTL活性,以效价1:100实验组佳.
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人脐血CD34+细胞在NOD/SCID小鼠免疫重建及其抗HBV作用的初步探讨
目的:探讨NOD/SCID(nonobese diabetic/severe combined immunodefieient)小鼠移植人脐带血(human umbilical cord blood.HUCB)CD34+细胞后免疫重建的特性.建立hu-NOD/SCID人鼠嵌合模型并观察其人源化免疫细胞在小鼠体内的生长分化特性、存活时间及其对HBV感染的清除作用.方法:1.NOD/SCID小鼠于Co60 3.5 Gy照射后24 h内尾静脉输注HUCB CD34+细胞;2.以流式细胞技术鉴定小鼠外周血中CD45+,CD3+,CD19+,CD56+等人源化细胞的比例;3.NOD/SCID小鼠于移植后第4wk注射HBV感染者血清并以未移植的NOD/SCID小鼠作为对照,注射同等量的患者血清;4.于感染后1、7、10、15天采血.免疫荧光定量PCR方法分别检测其HBV-DNA含量.结果:1.HUCB CD34+细胞移植后第2 wk,在小鼠外周血中检测出的CD3+CD8+T细胞、CD3+CD4+T细胞、CD19+B细胞、CD56+NK细胞的比例分别为18.6%、16.1%、13.1%和27.8%.各细胞比例随小鼠周龄而变化.所有移植小鼠存活时间均达9wk;2.移植后小鼠感染HBV血清后,病毒仅在感染后第一天检出,随后消失;未移植CD34+细胞的小鼠外周血HBV-DNA一直维持在103水平;结论:1.NOD/SCID小鼠经射线照射后移植HUCB CD34+细胞.在不加任何刺激因子的情况下小鼠可以长时间存活并重建免疫;2.hu-NOD/SCID人鼠嵌合模型小鼠免疫成功重建后,对HBV感染有快速的清除作用.
关键词： 人脐血 CD34+细胞 HBV NOD/SCID小鼠 -
枸杞多糖诱导人脐血间充质干细胞向神经元样细胞分化的实验研究
目的:探讨枸杞多糖诱导人脐血间充质干细胞(MSCs)向神经元样细胞分化的可行性及其机制.方法:无菌条件下收集正常足月儿的脐带血,经肝素抗凝,用相对密度1.077的淋巴细胞分离液分离脐血的单个核细胞,用低糖DMEM培养基进行培养和纯化扩增.选取第3代细胞进行诱导实验,当传代细胞长满瓶底的80%以上时,先用含15%FBS和10ng/ml bFGF的DMEM完全培养基预诱导24小时,然后用不含血清含1g/L枸杞多糖的DMEM培养基诱导,光镜下观察细胞形态,用免疫组化技术检测细胞Nestin和NF的表达.结果:预诱导后MSCs没有变化,而经枸杞多糖诱导4h后细胞即出现形态学上的改变,细胞变成不规则形,立体感增强,从胞体伸出突起.免疫组化检测显示,细胞Nestin、NF呈阳性.结论:人脐血间充质干细胞经枸杞多糖诱导可转化为神经元样细胞,其诱导机制可能与枸杞多糖的抗氧化作用有关.
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人脐血间充质干细胞的改良分离培养
目的 探讨人间脐血来源的充质干细胞在体外分离培养与扩增的方法.方法 用重力离心-密度梯度离心法结合贴壁筛选法分离细胞,用含15％ FBS的DMEM低糖培养基培养并传代,流式细胞仪检测P3代间充质干细胞的表面标志.结果 脐血来源的单个核细胞24 h即开始贴壁,主要表现为破骨样细胞和间充质样细胞.经自然纯化法传代后,可得到形态单一的长梭形间充质干细胞.流式细胞仪检测结果显示该细胞表达CD44.结论 脐血来源的MSCs可以在体外分离培养和扩增,细胞表面标记与骨髓来源间充质干细胞一致.
