首页 > 文献资料
-
成人骨髓基质干细胞体外培养与鉴定
目的本实验旨在建立一套体外分离培养人骨髓基质干细胞(human bone marrow stem cell HMSCs)的方法,观察HMSCs的形态和掌握其生长规律,找到一种佳的培养环境.方法穿刺抽取成人骨髓约20ml,通过离心法获取HMSCs,体外培养并传代,观察原代及传代细胞的细胞形态及生长规律,第4代细胞用矿化液连续培养30天,在倒置显微镜下观察矿化结节形成情况.结果体外利用骨髓基质细胞培养液成功培养了HMSCs,并连续传代5～7代.利用第4代细胞用矿化液连续培养30天,矿化结节形成,在细胞间有钙盐沉积.结论 HMSCs可以在体外培养成功,并可定向诱导为成骨细胞,有希望作为极佳的种子细胞应用于临床.
-
骨髓间充质干细胞
骨髓是一个复合体,它由红细胞、白细胞、它们的前体细胞及被称为基质(stromal)的结缔组织网架组成.来自基质的细胞,在形态上分别与成纤维细胞、网状细胞、脂肪细胞和内皮细胞的形态相似 [1],这些细胞被称为骨髓基质干细胞.它们在体外能被不同的诱导因子诱导,分化为骨、软骨、肌肉、脂肪等 [2].干细胞的主要特点是结构比较简单,是不具有特定机能的原始细胞,能以自我复制的方式增生,在一定的条件下能向特定的方向分化,产生几个亚系的前体细胞 [3].骨髓基质干细胞就能分化为不同的间充质细胞,如成骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞及脂肪细胞,因此Caplan等人也将基质干细胞称为间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSCs) [4].目前已经研究了造血系统干细胞、肝脏干细胞、肌肉系统的干细胞,研究的终目的是器官再造,在有些领域已经应用于临床,例如血液科利用造血干细胞治疗再生障碍性贫血和白血病;内分泌科利用胰岛干细胞治疗糖尿病;而骨科正在研究MSCs修复骨缺损.
-
BMSCs在功能化自组装多肽水凝胶中定向分化神经细胞研究
目的：探讨骨髓基质干细胞（ BMSCs ）在功能化自组装多肽水凝胶中定向分化为神经细胞及分化后细胞的功能特征。方法：制备功能化自组装多肽水凝胶，分别将BMSCs接种于RADA16自组装多肽水凝胶（对照组）与功能化自组装多肽水凝胶（实验组）表面，观察细胞迁移情况。用预诱导剂bFGF和EGF及定向诱导剂（SHH＋RA）时序诱导，应用Nestin、MAP2、GFAP、ChAT和VAT染色，比较分化后神经样细胞的形态和功能标志的差异。结果：BMSCs在功能化自组装多肽水凝胶中共培养及诱导剂的特定组合和时序的诱导下增殖分化呈现神经元细胞样改变，MAP2阳性细胞百分率较对照组显著提高（P＜0．05），GFAP 阳性细胞百分率较对照组显著降低（P＜0．05），且功能标志ChAT和VAT只在实验组表达。结论：BMSCs在功能化自组装多肽水凝胶中能定向诱导分化为具有功能的神经细胞。
-
骨髓基质干细胞对急性脊髓损伤大鼠模型神经功能修复的影响
目的 探索骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)体外定向诱导分化为神经细胞后移植治疗急性脊髓损伤动物模型的疗效.方法 对BMSCs进行体外诱导,并鉴定.将模型大鼠分为3组,将诱导及未诱导的BMSCs和生理盐水分别注入模型鼠脊髓半切点附近,在3个月内用BBB评分法对治疗情况进行评价.结果 BMSCs体外诱导后的细胞经免疫组化检测可证实为神经细胞; 进行细胞移植的两组动物死亡率明显下降,神经功能有明显恢复(P＜0.05);并且BMSCs诱导后移植组神经功能恢复较未诱导组明显(P＜0.05);而生理盐水组移植前后评分变化不明显.结论 BMSCs诱导组治疗脊髓损伤模型的疗效总体好于未诱导的BMSCs组,前两组的疗效均好于生理盐水组.
-
骨髓基质干细胞修复骨不连与骨缺损的进展
1968年,Friedenstein等[1]早证明了骨髓基质干细胞(bone marrow stem cell,BMSCs)存在.他们通过对全骨髓标本的培养,获得了一些具有克隆化、非吞噬性和成纤维细胞样生长的贴壁细胞,这些细胞就是骨髓基质干细胞.针对Friedenstein的观察结果,Piersma等[2-4]对此又进行了深入的研究,他们发现骨髓基质干细胞可以分化为骨、软骨、脂肪、甚至肌肉组织等各种间质组织.1985年,Owen认为骨髓基质干细胞系统是伴随造血干细胞系统生长的、可以自我更新并分化为各种连接组织的细胞群,由此提出了基质细胞系统的概念.由于骨髓基质干细胞的多分化性,近年来已成为组织工程学研究的热点.本文将就骨髓基质干细胞在修复骨不连与骨缺损方面进行综述.
-
骨髓间充质干细胞生物学特性及其多向分化潜能的理论基础和机制
骨髓分为造血和基质两大系统,前者包括造血干细胞和各阶段血细胞;后者指骨髓腔内为造血系统提供结构和功能支持的结缔组织.因此,正常骨髓至少存在两种干细胞:骨髓造血干细胞(HSCs)和骨髓基质干细胞(MSCs).后者以往被统称为骨髓基质细胞(BMSCs).
-
叶酸诱导骨髓基质干细胞分化为神经细胞的浓度探索
目的 探讨叶酸对骨髓基质干细胞诱导分化为神经细胞的佳浓度.方法 MSCs由正常成年人骨髓经密度梯度离心加贴壁离心获得,取第5代MSCs以1 mmol/L二巯基乙醇(BME)预诱导24 h后,用羟基茴香醚(BHA)、2%二甲基亚砜(DMSO)和3种不同浓度的叶酸诱导分化,采用免疫细胞化学法检测神经细胞特异性抗原标志神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶原纤维酸性蛋白GFAP的表达,MTT(四唑盐比色)法检测不同时间段对BMSCs增殖的影响.结果 不同剂量叶酸组分化为NSE阳性神经元样细胞的百分率都较对照组高(P<0.01) ,但以40 mg/L中等浓度的叶酸神经细胞多,且神经元比例高于其他组.结论 叶酸诱导BMSCs向神经元分化以40 mg/L浓度为佳.
-
不同时间诱导后上清液在骨髓间充质细胞向神经元样细胞分化中的作用
目的 研究体外使用音猬因子(SHH)、维甲酸(Ra)、Forskolin(Fn)组成的诱导体系诱导骨髓间充质细胞(BMSCs)后的上清液对BMSCs向神经细胞分化的作用.方法 从健康志愿者髂骨处抽取骨髓4 mL,体外分离、培养、扩增后用400 ng/L SHH、0.5 μm Ra 和5 μm Fn 组成的诱导体系进行诱导,取诱导后6 h、12 h、24 h、3 d、5 d和7 d的诱导液上清分别作用于BMSCs.7 d后使用倒置显微镜和免疫组织化学方法观察诱导前后细胞的变化.结果 诱导7 d后各组均有部分细胞胞体收缩、伸长突起,表现出神经细胞的形态.12 h上清诱导组同SHH+Ra+Fn 诱导组NSE、MAP-2阳性细胞比例高于其他组(P<0.05),12 h上清诱导组同SHH+Ra+Fn诱导组NSE、MAP-2阳性细胞比例无统计学意义(P>0.05).结论 12 h后上清液可有效诱导BMSCs向神经细胞分化.
-
胚胎干细胞向成骨细胞转化的研究现状
骨组织工程[1]实际应用的关键是成骨细胞成骨以修补骨缺损,其前提是找到良好的种子细胞.而目前种子细胞的老化是组织工程中的一大难题,一些分化和增殖能力强的原始细胞即干细胞,是解决这一难题的希望所在[2].目前研究较多的是骨髓基质干细胞,但它却存在着:①相对低的产生率,大约100 000个细胞中才有1个真正的干细胞;②自我更新能力有限,而且随着时间的延长,增生潜能及向特殊类型细胞转化的能力均消失殆尽的问题.因此,基于骨组织工程的目的仍需发展一种新的细胞资源.而胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESC)因其具有全能性和无限增殖的能力,有望成为组织工程中种子细胞的新来源[3].
-
自体骨髓在兔腰椎横突间融合中诱导成骨的研究
脊柱融合术是脊柱外科的基本手术之一,后外侧横突间、小关节突间融合是目前常用的方法,但假关节发生率为20％～50％.自体骨髓内含有骨髓基质干细胞,具有成骨能力.本实验通过研究自体骨髓在腰椎横突间融合中诱导成骨的作用,探讨其作为骨移植添加物的效果,为临床应用提供参考依据.
-
立体定向移植方法在干细胞移植中的应用研究
目的:探讨立体定向移植方法在干细胞移植中的应用.方法:腹腔注射青霉素建立癫痫模型.24只健康Sprague-DawleySD大鼠分为生理盐水移植组及干细胞移植组.用立体定向仪进行移植,分别于移植后7d脑灌注取材,通过荧光观察比较干细胞移植后干细胞在移植部位的准确性,立体定向移植方法的安全性.结果:发现移植后7d脑片,在针道内均有大量的GFP标记的细胞存在,且无一例大鼠死亡.结论:通过立体定向移植方法,移植干细胞入癫痫大鼠脑内CA1区,位置准确.
-
绿色荧光蛋白体外转染兔骨髓基质干细胞
目的:观察以质粒为载体,经脂质体介导的绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)转染的骨髓间充质干细胞体外表达情况.方法:以质粒病毒为载体,PT 67细胞为包装细胞,介导绿色荧光蛋白转染新西兰大白兔,在相差显微镜和荧光显微镜下观察,流式细胞仪检测GFP的表达效率.结果:骨髓基质干细胞体外培养后贴壁、集落生长,连续传代培养生长良好.培养2 wk后骨髓基质干细胞表面CD 44抗原表达阳性.介导绿色荧光蛋白转染新西兰大白兔的骨髓基质干细胞,转染率可达30％左右.结论:骨髓基质干细胞容易获取、来源充足、可以大量扩增,可作为骨组织工程的种子细胞.GFP基因的导入不会影响骨髓间充质干细胞的活性和生物学特性.
-
移植骨髓基质干细胞对癫痫所致细胞凋亡的影响
目的:探讨骨髓基质干细胞移植对癫痫导致的细胞凋亡的抑制作用.方法:腹腔注射青霉素建立癫痫模型.64只健康SD大鼠分为正常对照组,癫痫未移植组,移植对照组,骨髓基质干细胞移植组.用立体定向仪进行移植,分别于移植后7d,14d,28d脑灌注取材,应用免疫组化染色方法检测脑组织bcl-2,bax蛋白的表达.结果:干细胞移植组的bax蛋白表达明显少于对照组(P<0.01),骨髓基质干细胞移植14d组的bax蛋白表达明显少于癫痫移植7d组(P<0.01),癫痫移植28d组凋亡细胞数明显少于癫痫移植14d组(P<0.01).结论:移植于癫痫鼠海马内的骨髓基质干细胞可以减少癫痫所致的细胞凋亡.
-
兔骨髓基质干细胞体外培养的生物学特性
目的:分离培养兔骨髓基质干细胞并探讨其体外生物学特性.方法:通过梯度密度离心法分离兔骨髓基质干细胞,体外培养、扩增,观察细胞的大体形态和超微结构;通过绘制细胞生长曲线、MTT实验来研究细胞的增殖能力和代谢活性.结果:兔骨髓基质干细胞呈梭形,胞质内有丰富的粗面内质网和线粒体,具有很强的增殖能力和代谢活性.结论:本实验方法取材方便,能较容易地获得大量的兔骨髓基质干细胞.
-
兔骨髓基质干细胞体外培养的生物学特性
目的:分离培养兔骨髓基质干细胞并探讨其体外生物学特性.方法:通过梯度密度离心法分离兔骨髓基质干细胞,体外培养、扩增,观察细胞的大体形态和超微结构;通过绘制细胞生长曲线、四甲基谷氮唑盐(MTT)实验来研究细胞的增殖能力和代谢活性.结果:兔骨髓基质干细胞呈梭形,胞浆内有丰富的粗面内质网和线粒体,具有很强的增殖能力和代谢活性.结论:本实验方法取材方便,能较容易地获得大量的兔骨髓基质干细胞.
-
复合组织工程人工骨修复兔骨缺损的实验研究
目的 探讨体外复合人工骨对兔骨缺损的修复及干细胞增殖、凋亡情况.方法 将实验兔分为A(自体骨植入组)、B(复合人工骨植入组)、C(空白组)3组,体外培养兔骨骨髓基质干细胞复合人工骨材料,按组并分时间段植入兔桡骨骨缺损模型中,分时段取材进行免疫组化、反射学、拉伸应力实验、大体观察、光镜检查等获取体外复合人工骨对兔骨缺损的修复情况,及人工骨粘附干细胞增殖、凋亡情况.结果 术后4周时B组在成骨速度、成骨质量及抗拉伸强度较B、C组快、强.术后8周B组在成骨速度、成骨质量及抗拉伸强度均仍较A组强,但差距在减少,C组仍无明显骨痂.术后12周A组在成骨速度、成骨质量及抗拉伸强度和B组无明显区别,C组术后12周骨折边缘模糊,少量骨痴形成.实验A组BMP-2平均灰度值与对照B组比较有统计学意义(P＜0.05),与对照组C组比较有统计学意义(P＜0.05),对照B组与对照C组比较有统计学意义(P＜0.05).结论 复合骨组织材料有利于兔成骨细胞的增殖、粘附和分化,能促进成骨细胞在体外成骨的能力,在体内可降解且具有较好的骨传导能力.
-
基因转染骨髓基质干细胞构建组织工程心脏瓣膜的实验研究
目的 探索一种行之有效的方法增强细胞黏附力,加快组织工程心脏瓣膜的体外构建.方法 通过纤维连接蛋白羧基端细胞结合域(FnCBD64)的原核表达、提取和纯化,构建FnCBD64基因重组腺病毒载体Ad.FnCBD64,并进行绵羊矛髓基质干细胞(BMSCs)的体外分离培养及生物学特性分析,制备去细胞猪主动脉瓣,在无菌条件下将脱细胞瓣叶圆片置入96孔板中(心室面向上),分别给予Fn、FnCTD64牛血清白蛋白(BSA)预先包埋,未预包埋作为对照组.细胞悬液接种,每只瓣叶种植细胞数为4×105个.在开始种植细胞的第8天取瓣叶进行细胞计数,电镜扫描MTT检测.结果 对照组在经过脉动冲刷实验高流量液体的冲刷以后,其表面的骨髓间质干细胞几近完全脱落,电镜扫描下为裸露的瓣膜支架;而预涂FnCBD64组虽然经过高流量的流体冲刷,有稀疏的细胞残留,细胞间有瓣膜支架的结构;转染Ad.FnCBD64组瓣膜表面存留的细胞比预涂FnCBD64组明显多,某些部位细胞呈复层生长,细胞可见排列极性改变,有向活体内细胞转化的趋势.结论 预涂FnCBD64和转染Ad.FnCBD64均能明显增强BMSCs在去细胞猪主动脉瓣叶及整体瓣膜上的黏附,而转染Ad.FnCBD64的效果更好.
-
右归丸含药血清诱导骨髓基质干细胞分化的佳浓度探索
目的:探讨右归丸含药血清体外诱导大鼠骨髓基质千细胞分化为神经元样细胞的佳浓度.方法:用DMEM/F-12培养液培养Wistar大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs),采用不同浓度右归丸含药血清对其进行体外诱导,并用MTT法检测各组细胞生长情况,用免疫细胞荧光方法计算各组神经元样细胞阳性数加以比较.结果:BMSCs在2.5％含药血清培养液中活力好.结论:2.5％右归丸含药血清培养液是诱导BMSCs分化实验的佳浓度.
-
补肾益髓中药含药血清诱导BMSC骨向分化作用机制的实验研究
目的:探讨补肾益髓中药血清对骨质疏松症大鼠BMSC骨向分化的调控机制.方法:分离培养大鼠BMSC,实验随机分为6组即空白组、血清组、血清+TGF组、血清+BMP组、TGF+ BMP组、综合诱导组,检测补肾中药含药血清对BMP-2、TGF-β1、Smad4、Cbfal mRNA表达,探讨补肾益髓中药含药血清在诱导BMSC骨向分化过程中可能的作用机制.结果:综合诱导组能明显促进ALP、Coll、BGP、TGF-β1、、BMP-2的表达量;血清+TGF、TGF+ BMP、血清+BMP联合使用有一定的协同作用.各诱导在促进BMSC向OB分化过程中,通过上调TGF-β超家族/Smads信号传导通路中Smad4以及Cbfa1 mRNA水平,对骨向分化起到了启动和促进作用.结论:各诱导组在诱导BMSC骨向分化的过程中,上调Smad4、Cbfa1 mRNA水平可能是诱导各组促进BMSC骨向分化的作用机制之一.
-
老鹳草素通过Wnt/β-catenin信号通路影响小鼠骨髓基质干细胞的增殖和成骨分化
目的:观察Wnt/β-catenin信号通路在老鹳草素诱导小鼠骨髓基质干细胞(BMSCs)增殖和成骨分化中的作用机制.方法:分离、培养小鼠BMSCs,分为对照组(DMEM/F12完全培养基)、老鹳草素低剂量组(10-9mol·L-1老鹳草素+ DMEM/F12完全培养基)、老鹳草素中剂量组(10-8 mol·L-1老鹳草素+ DMEM/F12完全培养基)、老鹳草素高剂量组(10-7 mol·L-1老鹳草素+ DMEM/F12完全培养基)、老鹳草素高剂量+DKK1(Wnt/β-catenin信号通路特异性阻断剂)组和DKK1组.成骨诱导第7天时,采用CCK-8法检测细胞增殖,碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(OCN)试剂盒测定ALP活性及OCN含量.成骨诱导48 h时,采用Real time-PCR和Western-blot检测各组Wnt/β-catenin信号通路的关键信号分子Wnt3a、β-catenin、GSK-3β、Axin2、Runx2 mRNA和蛋白表达.结果:成骨诱导第7天时,老鹳草素各剂量组明显促进BMSCs的增殖,呈剂量依赖性(均P＜0.05);同时ALP活性及OCN含量较对照组显著升高,呈剂量依赖性(均P＜ 0.05).成骨诱导48 h时,老鹳草素各剂量组Wnt3a、β-catenin、Axin2、Runx2 mRNA和蛋白表达较对照组显著上调,GSK-3β mRNA和蛋白表达较对照组显著下调,呈剂量依赖性(均P＜0.05).加入DKK1后,细胞增殖受到显著抑制,ALP活性及OCN含量显著降低(均P＜0.05);同时Wnt3a、β-catenin、Axin2、Runx2 mRNA和蛋白表达显著下调,GSK-3β mRNA和蛋白表达显著上调(均P ＜0.05).结论:老鹳草素能够明显促进BMSCs的增殖及向成骨方向分化,其机制与Wnt/β-catenin信号通路的激活有关.
