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热休克蛋白27在神经系统中的生物学作用
热休克蛋白(heat shock protein,HSP)广泛存在于多种生物细胞,属于高度保守的蛋白质家族.它是20世纪70年代由美国学者Tissieres等[1]发现的一类新型蛋白质.热休克蛋白可以上调细胞的应激反应能力,以保护细胞远离各种压力,当细胞遭受高热、氧化还原反应,接触重金属以及氨基酸类似物或细胞毒性药物时会启动神经系统内的热休克蛋白系统.热休克蛋白是产生热休克反应的一部分,是高效表达的细胞蛋白.在未承受应激状态的细胞中,热休克蛋白只占到1％～2％.在承受应激状态的细胞中,热休克蛋白则占到了6％～8％[2].
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绿色荧光蛋白标记HIV融合蛋白基因表达载体
目的利用基因工程技术,构建携带绿色荧光蛋白(greenfluorescent protein,GFP)标记的HIV(ENV-6C)基因的表达载体,并在E.coli BL21中高效表达.方法经核酸内切酶酶切、连接,构建重组表达载体pRSETB-HIV(ENV-6C)-GFP,通过十二烷基磺酸钠-聚丙稀酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、Western印迹杂交技术(Western blot)分析重组结果,转化到E.coli BL21中,荧光分光光度计检测含有重组质粒的大肠埃希菌培养物中重组蛋白的表达情况.结果成功构建重组原核表达载体pRSETB-HIV(ENV-6C)-GFP,并在E.coli BL21中实现高效表达,检则到发绿色荧光的融合蛋白GFP-HIV(ENV-6C).结论融合蛋白具有人类免疫缺陷病毒(HIV)外壳蛋白的抗原活性,可用绿色荧光蛋白标记抗原,对制备HIV抗体及免疫诊断新技术有一定价值.
关键词： 绿色荧光蛋白(GFP) 人类免疫缺陷病毒(HIV) 融和基因 高效表达 -
血管内皮生长因子在原核细胞中的活性检测术
背景:目前血管内皮细胞生长因子制备困难,来源有限,限制了临床的应用.目的:用基因工程的方法在人肠杆菌中诱导表达人血管内皮生长因子165,分离纯化并检测其免疫学以及生物学活性.为后期构建携带血管内皮生长因子165蛋白的预成血管化组织工程骨提供了充足的蛋白来源.设计、时间及地点:开放性实验,单一样本观察,于2005-04/2007-01在陕两省疾病预防控制中心病毒室完成.材料:携带目的基因血管内皮生长因子165的克降质粒PUC18-VEGF165由西安交通大学第二医院时志斌博士构建,PGEM-T easv 质粒购自美国Promerga公司,原核表达质粒购自德国Qiagen公司,DH5 α、M15、JM109菌株由陕西省疾病预防控制中心病毒研究室保存.方法:利用聚合酶链反应亚克隆的方法获得目的基因片段,构建表达质粒pQE30-VEGF165,在大肠杆菌JM109中用IPTG进行诱导表达并使用Ni2+-NTA进行蛋纯化.经过纯化获得了血管内皮生长因子165蛋白.主要观察指标:①人血管内皮生长因子165基因的亚克隆结果.②重组表达载体pQE30-hVEGF165的鉴定结果.③人血管内皮生长因子165蛋白的诱导表达、纯化.④使用ELISA和Western blot技术检测人血管内皮生长因子165蛋白免疫学活性.⑤鸡胚尿囊绒毛膜试验和matrigel血管形成实验检测其生物学活性.结果:重组表达质粒pQE30-VEGF165在大肠杆菌中成功地表达了相对分子质量为23 000的蛋白,其以不溶性的包涵体形式存在,占菌体蛋白的30%左右,经过分离和Ni柱纯化获得了血管内皮生长因子165蛋白,浓度约为0.2g/L,ELISA和Western blot实验显示其具有良好的免疫学活性,鸡胚尿囊绒毛膜试验和matrigel血管形成实验显示表达蛋白具有良好的生物学活性.结论:实验在原核细胞中稳定、高效表达了具有活性的血管内皮生长因子165蛋白,为后期预构血管化组织工程骨的构建提供了充足的蛋白来源.
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酿酒酵母丙酮酸脱羧酶基因的克隆及表达
目的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)丙酮酸脱羧酶(PDC)基因的克隆和表达.方法利用PCR技术从酿酒酵母的总cDNA中钓取出PDCsc基因,构建其高效表达质粒,利用Ion和ompT蛋白酶缺陷株Escherichia coli BL21(DE3)进行表达.结果扩增出长约1.7 kb的PDCsc基因,成功构建其表达质粒pSC-22b,对转化菌株的SDS-PAGE分析结果显示:该基因获得高效表达,表达蛋白占细胞总蛋白的18.6%.结论成功构建高效表达PDCsc基因的工程菌株,为实现利用PDCsc进行的生物转化奠定基础.
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移动单孢菌丙酮酸脱羧酶基因的克隆及表达
目的 克隆与表达移动单孢菌(Zymomonas mobilis)丙酮酸脱羧酶(Pyruvate decarboxylase,PDC)基因.方法 利用聚合酶链反应(PCR)技术从移动单孢的基因组DNA中扩增出PDCzm基因,构建其高效表达质粒,利用Ion和ompT蛋白酶缺陷株Escherichia coli BL21(DE3)进行表达.结果 扩增出DNA碱基对数目约1.7kb的PDCzm基因,成功构建其表达质粒pZM-22 b,对转化菌株的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析结果显示:该基因获得高效表达,表达蛋白占细胞总蛋白的37.9%.结论 成功构建高效表达PDCzm基因的工程菌株,为实现利用PDCzm进行的生物转化奠定了基础.
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重组人截短型胰岛素样生长因子1在大肠杆菌中的高效表达
目的:建立人截短型胰岛素样生长因子1的原核高效表达系统.方法:利用基因重组技术将人截短型胰岛素样生长因子1[Des(1-3)IGF1]的cDNA片段克隆到融合蛋白表达载体pMTY4中,用离子交换层析法纯化蛋白并经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、放射免疫检测、N-末端前16位氨基酸序列测定及生物活性检测等方法对所获蛋白进行了鉴定.结果:获得含人Des(1-3)IGF1基因的重组质粒,在大肠杆菌中高效表达出含凝血酶识别序列的MS2-Des(1-3)IGF1融合蛋白,该蛋白经凝血酶消化后纯化可获得与天然型一致的人Des(1-3)IGF1.结论:该方法是获得人重组Des(1-3)IGF1的有效途径,对进一步研究Des(1-3)IGF1有重要意义.
关键词： 人截短型胰岛素样生长因子1 大肠杆菌 高效表达 -
人源抗HBsAg抗体Fd段和L链高效表达菌株的筛选
目的：选用高效表达载体分别高效表达人源抗HBsAg抗体的Fd段和L链，经包涵体纯化和变性复性使Fd段和L链之间形成二硫键，终制备有活性、高产量的人源抗HBsAg基因工程抗体Fab。方法：用PCR法从可溶性表达重组质粒抗HBsAg Fad Comb3扩增Fd段和L链后分别构建高效表达载体PQE32-Fd和PQE32-L，并分别导入大肠杆菌M15中进行表达，用SDS-PAGE筛选出高效表达克隆。结果：SDS-PAGE筛选的高效表达克隆M15-PQE32-Fd和M15-PQE32-L经IPTG诱导后以包涵体形式表达，其表达量很高。从高效表达克隆重新扩增Fd段和L链后进行测序鉴定发现所得的序列与已报道的抗HBsAg抗体Fab基因吻合率为97％。结论：虽然已有表达可溶性人源抗HBsAg基因工程抗体Fab的报道，但因其表达量低而不能实际应用。筛选出高效表达人源抗HBsAg抗体Fd段和L链的克隆，因为包涵体形式表达需经变性复性，虽然变性复性后其产量会受影响，但因表达量很高，所以还是有很高的实际应用价值。其包涵体变性复性条件仍需进一步探讨。
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抗乙肝病毒表面抗原单链抗体在大肠杆菌中的高效表达
目的:在大肠杆菌中高效表达抗乙肝表面抗原的单链抗体.方法:通过PCR将单链抗体基因重组到原核细胞表达载体pT7中,构建单链抗体高效表达载体pT7SC.将pT7SC质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导进行表达.结果:获得了ScFv的高效表达,表达产物占菌体总蛋白的28%以上.竞争抑制性ELISA检测诱导后的细菌培养上清,证明所表达的ScFv具有抗体活性.进一步将c-Myc十肽连接在ScFv的羧基端,使所表达的ScFv易于检测.结论:在大肠杆菌高效表达抗乙肝ScFv,将促进小分子抗体的应用.
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睫状神经营养因子cDNA的克隆、表达、纯化及生物活性测定
目的:利用基因工程技术获得有较高生物学活性的睫状神经营养因子(CNTF)蛋白.方法:应用反转录PCR技术直接扩增出人CNTF cDNA,克隆入pUC19载体中,用双脱氧法进行手工序列分析,构建表达菌株pBV220-CNTF/DH5α.表达的蛋白质得到纯化,用鸡胚背根节无血清培养法检测表达蛋白生物学活性.结果:所克隆的CNTF基因序列与文献报道完全一致,pBV220-CNTF/DH5α能特异表达分子量大约为26 000的蛋白质,表达量约为菌体总蛋白量的35%.CNTF蛋白质经纯化后纯度约95%,而且表达蛋白有很高的生物学活性.结论:该研究结果为CNTF的结构和功能的研究及临床应用打下基础.
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人bFGF基因克隆表达及表达产物的纯化和生物学活性分析
目的:通过融合蛋白表达方式将编码人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)cDNA在大肠杆菌DH5α中的表达,为bFGF进一步研究提供材料来源.方法:用多聚酶链反应(PCR)及DNA重组技术将PCR产物克隆到pGEM-5Z载体并测序,然后克隆到表达载体pXH上.结果:转化重组质粒pLX1的大肠杆菌经42℃温控诱导4～5 h,SDS-PAGE分析显示融合蛋白的分子量约35 000,薄层扫描分析表明该蛋白占菌体总蛋白量的9.9%.经Factor Xa酶切后得到分子量约为17 000的bFGF,其生物学活性ED50为2.29 ng/ml.结论:经PCR方法扩增的bFGF可在大肠杆菌中高效表达,为其进一步结构与功能研究打下基础.
关键词： 人碱性成纤维细胞生长因子 高效表达 纯化 -
重组杆状病毒高效表达猪圆环病毒2型Cap蛋白及其免疫特性分析
目的 利用重组杆状病毒高效表达猪圆环病毒2型(porcine circovirus 2,PCV2)Cap蛋白,并分析该蛋白的免疫特性.方法 将PCV2 Cap基因克隆至转移载体pFastBac Ⅰ,转化感受态E.coli DH10Bac细胞,获得重组杆粒rBacmid-Cap,转染Sf9细胞,SDS-PAGE和Western blot法检测重组杆状病毒,并于High Five(H5)细胞中进行高效表达.将小鼠随机分为PBS对照组、杆状病毒组、重组杆状病毒组及疫苗对照组,均经小鼠肌内注射,100 μL/只,分别于第0和14天进行免疫,于首免后第21、28、35及42天经小鼠眼眶静脉丛采血,分离血清,ELISA法进行检测.结果 PCR和测序分析结果表明,重组转移质粒和重组杆粒构建正确.重组PCV2 Cap蛋白的相对分子质量约28 000,可与抗His标签单克隆抗体及抗PCV2 Cap多克隆抗体发生特异性结合.重组杆状病毒按MOI=5及1感染H5细胞约72 h,PCV2 Cap蛋白表达量高,表达产量约150 μg/mL.首免后第21、28、35及42天,重组杆状病毒组小鼠血清抗体水平明显高于PBS对照组及杆状病毒组(P＜0.001);首免后第21、28、35天,重组杆状病毒组小鼠血清抗体水平明显高于疫苗对照组(P＜0.05),首免后第42天,两组差异无统计学意义(P＞0.05).结论 成功利用杆状病毒表达系统高效表达了PCV2 Cap,重组蛋白可诱导小鼠产生较高水平抗体,本研究为PCV疫苗的研制奠定了基础.
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高效表达乙型肝炎表面抗原的CHO工程细胞株的构建
目的 构建高效表达乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的CHO 工程细胞株.方法 从pCIneo质粒出发,构建含有改造了稀有密码子的HBsAg S基因和启动子弱化的二氢叶酸还原酶(DHFR)转录单位的新型表达载体,利用脂质体转染CHO/dhfr-细胞.经3轮氨甲喋呤(MTX)梯度加压筛选和单克隆筛选,获得高效表达HBsAg的CHO 工程细胞株,并对HBsAg的分泌动态进行检测.结果 所构建的新型表达载体pC1-DS经PCR及酶切鉴定,证明构建正确,转染CHO/dhfr~-细胞后,经筛选得到高效表达HBsAg的CHO T程细胞株3F9,表达量达9.21μg/10~6个细胞·48 h.单层细胞培养动态表明,3F9株细胞能在40 d内稳定高效表达HBsAg.结论 已成功构建稳定高效表达HBsAg的CHO工程细胞株,为提高HBsAg的产量创造了条件.
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单克隆抗体在哺乳动物细胞中高效表达的研究进展
目前单克隆抗体已成为生物制药业发展快的领域之一,需求的增加促进了单克隆抗体大规模生产的发展,但工业生产中仍然存在产率低的问题.影响单克隆抗体表达水平的主要因素包括宿主细胞、表达载体、培养条件等方面.在寻找强启动子、增强子等高效表达元件的同时,对宿主细胞改造已成为提高单克隆抗体在哺乳动物细胞表达水平的重要研究方向.
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HIV-1整合酶基因合成与其在大肠杆菌中的高效表达
目的:通过人工合成HIV-1整合酶(integrase,IN)基因的编码序列,提高目的蛋白的表达.方法:根据IN的氨基酸序列,选择大肠杆菌偏好的密码子,设计并合成了877碱基,共编码288个氨基酸,克隆入pMD18-T载体,经测序证实后,构建原核表达载体pET-His-p31,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE和Western blot分析.结果:酶切及测序结果表明表达载体构建成功,工程菌诱导表达后的电泳图谱在相对分子质量为32kDa的位置出现明显目的蛋白条带,表达产物主要以包涵体形式存在,占菌体总蛋白的65.9%,Western blot结果表明表达的聚合酶蛋白能与HIV-1阳性血清发生特异性反应.结论:已获得高效表达工程菌pET-His-p31,为下一步研究HIV诊断试剂奠定基础.
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汉坦病毒核蛋白核心区域高效表达及产物鉴定
汉坦病毒是引起肾综合征出血热(HFRS)的主要病毒,汉坦病毒的基因由 L、M、S 三个片段构成,分别编码病毒RNA聚合酶, 囊膜核蛋白G1和G2及核衣壳蛋白(简称核蛋白,Nucleocapsid Protein, NP).
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痘苗病毒载体的特点及应用
痘苗病毒具有宿主范围广、安全、高效表达、插入外源基因的容量大等诸多优点,是继反转录病毒、腺病毒载体之后又一广泛应用的载体系统.本文对痘苗病毒载体的特点及其应用作了综述.
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毕赤酵母表达系统
毕赤酵母表达系统是一种新的真核基因表达系统,由于其有许多突出的优点,越来越受到分子生物学界的重视,已有多种重组蛋白在该系统成功表达.本文从表达菌株、表达载体、转化及整合、外源蛋白的表达及修饰等方面对其进行综述,并分析了影响毕赤酵母高效表达外源蛋白的因素.
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Tet-Off对GDNF重组腺相关病毒载体表达的调控作用
胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)对多巴胺能神经元、运动神经元等都具有神经营养作用,是帕金森病等中枢神经系统退行性病变常见的治疗基因[1,2].以腺相关病毒(AAV)为载体将GDNF导入尾状核头部等功能核团能缓解帕金森病症状、促进多巴胺能神经元再生[3].本研究在AAV介导GDNF体内高效表达的基础上,在GDNF上游插入Tet-Off反式激活子及其反应元件启动子复合物,从而降低转基因后可能的致瘤作用及其它潜在危险.
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丙型肝炎病毒抗原表位基因在新的抗原呈递系统中的重组构建及高效表达
目的将人工合成的丙型肝炎病毒(HCV)E1区的抗原表位基因,构建到一种新的抗原表位呈递系统的高效表达载体pET-RNA2中进行高效表达.方法运用基因工程技术将人工合成的HCVE1区的抗原表位基因,构建到一种新的抗原表位呈递系统的高效表达载体pET-RNA2中,构成一个嵌合基因进行高效表达.在该载体适当的位置插入外源抗原表位可使其呈现一定的空间构象,使抗原表位位于重组蛋白的表面并有望改善其免疫原性.结果分别在载体的106、153、305位氨基酸处插入外源抗原表位基因,成功构建了重组质粒pET RNA HCV/A1、pET-RNA-HCV/A2和pET-RNA-HCV/A3,并分别在大肠杆菌中进行高效表达.表达产物相对分子质量约为45000.初步研究结果表明,在特定条件下不需要异丙基β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导就可使之获得高效表达,表达的嵌合蛋白占菌体总蛋白的40%以上.结论HCV抗原表位基因成功构建到一种新的抗原呈递系统中并获得高效表达,为深入研究HCV抗原表位的免疫学和生物学特性奠定了基础,并对今后设计诊断试剂及抗原表位特异性疫苗有一定意义.
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幽门螺杆菌过氧化氢酶基因的克隆、高效表达及活性评价
目的构建高效表达幽门螺杆菌(Hp)过氧化氢酶重组蛋白的候选菌株并测定其活性.方法用PCR方法从Hp染色体DNA上扩增过氧化氢酶基因,将其定向插入表达载体pET-22b(十)中,并在BL21(DE3)大肠杆菌中表达,进一步利用贝尔斯-西策尔斯法测定其活性.结果DNA序列分析表明,所克隆的过氧化氢酶基因序列与基因库公布的一致.在37℃诱导表达3 h后,过氧化氢酶重组蛋白表达量占菌体总蛋白的24 4%,并显示了良好的活性.结论本研究获得了表达高活性Hp过氧化氢酶的克隆,为深入研究其相关功能奠定了良好基础.
