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高效表达幽门螺杆菌cag A蛋白工程菌的构建
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)是引起人类慢性活动性胃炎、消化性溃疡的主要病原菌,并与胃癌的发生密切相关.对Hp毒力因子进行的研究表明:尿素酶、空泡毒素(VacA)及细胞毒素相关蛋白A(CagA),是引起人类严重胃部疾患的主要致病因素[1].其中cagA基因已被克隆并进行了序列分析[2].研究还证实cagA基因的存在是产生有活性的空泡毒素所必须的,并能促进细胞因子IL-8的释放及激活转录因子NF-k B,加重胃黏膜的组织损伤,故而目前认为含cagA基因的Hp菌株是高毒株[3].我国人群中,Hp的携带率高达80%左右,胃癌的发病人数每年约20万,约占全世界胃癌发病人数的35%,在Hp分离株中约有97%～98%存在cagA基因,表明我国是Hp高毒株的高感染国[4].为了获得高效表达的幽门螺杆菌CagA蛋白,从而为高毒力Hp的人群普查提供一种具有良好前景的基因工程诊断抗原,我们克隆了该基因的保守区域,对不同诱导条件下CagA蛋白的表达量进行了优化研究,并对CagA蛋白的可溶性表达进行了探索.
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骨形态发生蛋白在骨组织工程研究中的进展
骨形态发生蛋白(BMPs)在胚胎肢体发生及关节形成方面有重要作用,是骨、软骨组织修复的必要成分[1],另外BMPs在其他组织的发育中亦发生作用,并与肿瘤等多种疾病的生物学行为有关[2],BMPs已广泛渗透到生物医学及组织工程研究的各个领域,它的诱导成骨特性研究深入,并得到一致的公认.但外源性的BMPs在体内易分散,易于被蛋白酶降解,不能持久有效的发挥作用,从很大程度上限制其进一步应用.目前,主要通过以下两种主要方法予以解决:一是选用适宜的载体材料,在体内起到缓释系统的作用,保持BMPs局部浓度和持久有效的发挥生物效能;二是通过基因转移的方法,将编码BMPs基因转染靶细胞,使其高效表达BMPs.本文概述了相关方面的研究进展.
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菌丝霉素的高效表达、纯化及活性
将来自腐生子囊菌中的菌丝霉素成熟肽基因经大肠杆菌密码子优化后,克隆到pET32a(+)载体中,构建了含His-tag标签和TEV酶识别位点的菌丝霉素表达质粒pYG330,使含菌丝霉素的融合蛋白在大肠杆菌中以可溶形式高效表达.建立了菌丝霉素的纯化路线,将融合蛋白进行TEV酶切后脱盐再进行亲和色谱分离,收集目的蛋白冻干浓缩,通过高效液相色谱进一步纯化获得纯度72％的目的多肽.纯化所得菌丝霉素对临床耐药金黄色葡萄球菌M-2和枯草芽孢杆菌有明显的抑菌活性.
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毕赤酵母高效表达外源蛋白的相关策略及研究进展
蛋白类药物和工业酶的异源表达在各类生物制药产业和工业应用中具有重要意义.巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)作为为成功的真核蛋白表达系统之一,近20年来经历飞速发展并受到广泛关注,产生了巨大的经济和社会价值.但另一方面,由于该系统受到包括外源基因本身特性、菌种特性、表达环境以及发酵工艺等在内的诸多因素的影响,其对于不同外源蛋白的表达情况也表现出较大差异.为解决这一难题,研究人员尝试使用了各种策略,如密码子优化、高拷贝菌株筛选、引导肽筛选、敲除蛋白酶基因和甘油运转体基因、共表达促折叠因子和透明颤菌血红蛋白,以及诱导条件、辅助表达物添加和发酵工艺的优化.本文对提高此系统外源蛋白表达量的相关策略及产业化研究进展进行了综述,并简要展望此系统的产业化发展前景.
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外源嵌合基因gtfB-ctxB在T2、T3、T4代防龋用转基因生菜植株中的遗传稳定性
为了观察培育的外源嵌合基因gtfB-ctxB转基因生菜(防龃齿转基因生菜)传代生长情况,初步探索gtfB-ctxB基因在生菜中遗传的稳定性.田地种植T2、T3、T4代外源嵌合基因gtfB-ctxB生菜植株36,64,40株.在不同生长时期,随机选取植物不同组织部位为样本,用聚合酶链式反应技术检测gtfB-ctxB.T2、T3、T4代转基因生菜中均含有外源嵌合基因gtfB-ctxB,并且每代生菜中转基因生菜所占比例基本一样,都超过50％,其中T2代24株,T3代43株,T4代27株.并且3个连续世代植株阳性率间比较,差异无统计学意义(P＞0.05).gtfB-ctxB外源基因在生菜下代中能高效表达,并且具有很好的遗传稳定性.
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改造的sTRAIL基因在重组毕赤氏酵母菌中的表达及活性分析
利用甲醇毕赤氏酵母系统对改造的TRAIL基因进行优化表达研究及产物活性分析,确定改造后的基因表达量是否提高.应用电转化技术将4种重组表达载体转化毕赤氏酵母菌GS115,经Zeocin抗生素筛选、PCR检测获得阳性酵母工程菌,采用摇瓶发酵及SDS-PAGE进行高效表达菌株的筛选,经CM-柱层析、Western blot及MTT法对重组蛋白进行初步纯化、抗原活性检测和生物学活性分析,确定了佳摇瓶发酵条件:培养基适pH值5.5～6.5,佳甲醇诱导浓度为1%,适甲醇诱导周期为96 h.筛选到高效表达菌株pPICZα-A-sTRAIL/GS11 5、pPICZα-A-sTRAILK/GS115、pPICZα-A-sTRAILA/GS11 5、pPICZα-A-sTRAILAK/GS115,其表达量分别达到67,113.4,98,145 mg/L,改造后的TRAIL具有抗原活性和生物学活性.对TRAlL基因的改造可以提高其在甲醇毕赤氏酵母系统中的表达.
关键词： 毕赤氏酵母 肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体 高效表达 活性分析 -
重组人胸腺素原α在大肠杆菌中的表达优化
在15 L的生物反应器内,对重组人胸腺素原α（huPTMAα）在大肠杆菌TG-1中经IPTG 诱导后的表达条件进行优化；应用NBS-MICROS 15 L.T.DR型生物反应器(15 L)，用工程菌E.coli pGEX-IN/PTMA,研究了诱导时不同的pH、温度、搅拌速率和IPTG浓度，利用正交试验对发酵条件进行了优化。经1次预试验和9次正式试验结果表明，huPTMAα的表达受溶氧条件的影响较显著，其中搅拌速率和通气量为大的影响因子，当其为250r/min时，表达水平高。经SDS-PAGE和凝胶扫描发现表达蛋白占菌体蛋白的60%以上。该实验为工程菌的中试提供了佳的表达诱导条件，对其稳定性，高效表达具有重要的指导意义。
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重组人白细胞介素15表达载体的构建及其在大肠杆菌中的高效表达
目的:获得重组人白细胞介素15(rhIL-15)高效表达菌株.方法:经细菌脂多糖+γ干扰素活化的人外周血单个核细胞提取细胞总RNA,用RT-PCR方法扩增出编码人IL-15 cDNA的基因片段,采用pBV220表达载体,经DNA重组技术构建IL-15基因工程菌.结果:核酸序列测定与预期一致,所表达的IL-15经SDS-PAGE证明分子量约15kD,表达量占菌体总蛋白的28%,经CTLl2细胞检测,表达产物粗提物1∶100复性后效价可达到106IU/ml.结论:构建的基因工程菌为IL-15高效表达菌株.
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生物代谢基因调控在抗生素生物合成中的应用
抗生素的生物合成是以原核或低级真核生物复杂的次级代谢过程为基础的,次级代谢过程能产生数量丰富、结构复杂的各类代谢物作为具有应用价值的抗菌药物.次级代谢产物的合成与某种遗传物质或基因及其决定的酶密切相关.所以,深入阐明代谢过程及调控基因(靶基因)并对相关基因进行体外重组并高效表达,必将提高药物生物合成的效率.近年来,国外开展了用带关键酶基因的质粒转化菌种,增加菌种中关键酶基因浓度和转录水平以及抑制菌种非必要基因的表达,简化后处理工序,提高产量等代谢基因调控的研究和实践,并取得了一定成果.
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瘦素与绿色荧光蛋白融合基因的合成及其高效表达
目的: 为了便于追踪瘦素(Leptin)在体内的去向,对其进行体内定位,设计合成Leptin荧光分子蛋白探针.方法:用PCR技术将Leptin cDNA与绿色荧光蛋白cDNA构建成融合基因LG,然后将其克隆进原核表达载体pET3c中,构建成原核表达工程菌BL21(DE3)/pET3c-LG.用Western-blot杂交检测重组蛋白的免疫原性,用荧光显微镜观察融合蛋白及其诱导菌休的发光活性.结果:DNA测序结果证实设计合成的融合基因与预期一致;构建的工程菌BL21(DE3)/pET3c-LG获得了表达,融合蛋白的表达量占菌体总蛋白的40%以上;Western-blot杂交检测表明重组蛋白具有Leptin的免疫原性;经IPTG诱导后的菌体及蛋白粗提液在荧光显微镜下可观察到其能发射出强烈的绿色荧光.结论:融合基因在大肠杆菌中实现了高效表达,表达的融合蛋白具Leptin的免疫原性和GFP的发光特性.为利用绿色荧光蛋白标记Leptin在动物体内的药物治疗的研究提供了一种新的途径.
关键词： 瘦素 绿色荧光蛋白(GFP) 融合基因 高效表达 -
HEK293细胞的传代、建库与高效表达重组HPV16-E6E7腺病毒的研究
目的 对HEK293细胞进行三级细胞库的建立,并高效表达重组的HPV16-E6E7腺病毒.方法 进行HEK293细胞传代培养,并建立三级细胞库,按中国药典2010年版Ⅲ部要求进行常规检验;培养重组HPV16-E6E7腺病毒,测定滴度,插入目的基因以及基因组酶切图谱鉴定.结果 HEK293细胞传代符合其生长形态,建立的三级细胞库和不同细胞库之间的传代数,细胞浓度和装量均符合疫苗基质制备的要求;能高效表达重组HPV 16-E6E7腺病毒,种子滴度＞3.0× 109 IU.mL-1;表达的目的基因和目的蛋白稳定.结论 建立的HEK293三级细胞库符合疫苗用细胞基质的要求.
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人PTP1B基因cDNA全长的克隆和原核系统表达
目的 构建人蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)基因cDNA全长的原核表达质粒(pET-28a(+)-hPTP1B)并在大肠杆菌中高效表达.方法 取2型糖尿病人(BMI＞28 kg·m-2)的淋巴细胞提取总RNA,RT-PCR后的扩增产物回收构建克隆载体pMD-hPTP1B,测序后设计带酶切位点BamHⅠ和EcoRⅠ的引物,PCR后酶切连入pET-28a(+)中,转化DE3,IPTG诱导表达,SDS-PAGE后用Western blot检测其特异表达,并进一步对rhPTP1B诱导表达时IPTG的浓度、时间和温度等条件进行了优化.结果 测序证实所得的hPTP1BcDNA序列与其在GenBank中的序列一致,重组质粒pET-28a(+)-hPTP1B的双酶切结果与预期大小完全一致,IPTG诱导后高效表达的蛋白质是其不溶性的包涵体形式.IPTG诱导的佳浓度是0.05 mmol·L-1,时间为5 h,温度为37℃.结论 成功克隆了人PTP1B基因,构建了相应的原核表达载体并对原核体系诱导表达的条件进行了优化,使其能在DE3中高效表达,为筛选高特异的小分子抑制剂和制备相应的单克隆抗体打下坚实的基础.
关键词： 蛋白酪氨酸磷酸酶1B cDNA pET-28a(+) 高效表达 包涵体 -
人肝细胞核因子-1β基因cDNA全长的克隆与表达
目的 构建人肝细胞核因子-1β (hHNF-1β)基因cDNA全长的原核表达质粒[pET-28a(+)-hHNF-1β]并在大肠杆菌(E.Coli)中高效表达.方法 提取正常成人肝脏组织的总RNA,RT-PCR后的扩增产物回收,构建克隆载体pMD-HNF-1β,设计带酶切位点BamHⅠ和Hind Ⅲ的引物,PCR后酶切连入pET-28a(+)中,转化DE3,测序后IPTG诱导表达,Western blot检测其特异表达,并对重组hHNF-1β(rhHNF-1β)诱导表达时IPTG的浓度、时间和温度等条件进行了优化.结果 测序证实所得的hHNF-1β cDNA序列与其在GenBank中的序列一致,重组质粒pET-28a(+)-hHNF-1β的双酶切结果与预期大小完全一致.IPTG诱导的佳浓度是0.04 mmol/L,时间为6 h,温度为37℃.结论 成功克隆和构建了hHNF-1β基因的原核表达载体并对诱导表达的条件进行了优化,为进一步的功能分析奠定基础.
关键词： 肝细胞核因子-1β pET-28a(+) 高效表达 包涵体 -
猪肺炎支原体168株黏附因子基因的克隆与表达
目的表达猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)168 株黏附因子(P97),探索其作为诊断抗原的可能性.方法采用PCR方法,从猪肺炎支原体168 株基因组DNA中扩增到黏附因子(P97)基因的抗原决定簇序列(R1区),产物经双酶切后克隆到表达载体pET-32a(+)中,具有正确阅读框架的重组表达质粒pET-32a(+)-P97(R1)转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达后采用SDS-PAGE和Western-blotting检测重组质粒目的基因表达.结果 (1)获得Mhp168株黏附因子基因R1区长约270bp的DNA片段,测序证明重组质粒pET-32a(+)-P97(R1)的外源基因序列与已报告的Mhp232及J株黏附因子基因序列基本一致;(2)SDS-PAGE检测表达产物,在相对分子量26.5kDa处有阳性表达条带,融合蛋白约占细菌蛋白总量的23.3%,主要以可溶性蛋白形式存在;(3)免疫印迹显示,该蛋白条带与兔抗猪肺炎支原体高免血清有阳性反应.结论 Mhp168株黏附因子基因在大肠杆菌中获得了高效表达,重组蛋白具有免疫反应性.
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绿色荧光蛋白在寄生虫学研究中的应用
绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)是一类存在于水母、水螅等腔肠动物体内的生物发光蛋白质,由238个氨基酸组成,分子量为27kDa[1].关于GFP的结构近年来有许多报道[2-3],它是由11个β-折叠围绕着一个α-螺旋而成的圆桶状结构,α-螺旋含有一个3肽(Ser-Tyr-Gly)环化而成的发光基团[4].通过对发光基团和其它区域进行随机诱变,已经得到许多GFP突变体,有的发蓝光,有的发出的荧光比野生型强[5].通过对GFP基因进行密码子优化,得到了能在不同生物高效表达的突变体,如病毒、细菌、寄生虫、酵母、昆虫细胞、植物细胞及哺乳动物细胞等.
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重组弓形虫GRA4的原核表达与纯化
构建能在pET原核系统中高效表达的弓形虫致密颗粒蛋白GRA4基因的重组表达质粒,并对其表达产物进行纯化.采用PCR方法自pMD1 8-GRA4(pGEX)重组子中扩增GRA4基因片段,定向克隆入原核表达载体pET-23a(+),转化E.coliBL21(DE3),以His·BindTM柱亲和层析纯化表达产物;用此纯化重组蛋白加CFA经皮下注射免疫小鼠三次,间接ELISA法测定其特异性抗体滴度.成功构建了重组表达质粒pET-GRA4,SDS-PAGE显示其表达产物约为40kD,主要以包涵体的形式存在,经亲和纯化后的pET-GRA4重组蛋白产量大、纯度高,能被兔抗弓形虫免疫血清所识别;免疫小鼠后亦可诱导产生出高滴度的特异性IgG抗体.利用pET原核系统成功表达和纯化了弓形虫GRA4重组蛋白,为弓形虫病诊断抗原和疫苗的研究奠定了基础.
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弓形虫RH株膜表面抗原2全长基因的高效表达与抗原性分析
构建原核重组表达质粒pET23a-SAG2,并在大肠埃希菌中实现高效表达,以及检测表达产物的抗原性.PCR扩增SAG2编码基因目的片段,琼脂糖凝胶电泳回收纯化,克隆至pMD18-T载体,转化大肠埃希菌DH5α.测序后亚克隆至表达质粒载体pET23a,构建重组表达质粒pET23a-SAG2,转化大肠埃希菌DH5α.筛选阳性克隆,经限制性酶切分析鉴定后,转化大肠埃希菌BL21(DE3),以异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达.十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)与免疫印迹分析表达产物.PCR扩增出约500bp的SAG2编码基因目的片段,与预期片段大小相符,经测序鉴定无基因突变;所构建的pET23a-SAG2重组表达质粒阳性克隆经PCR与双酶切鉴定,与预期结果一致;含有pET 23a-SAG2重组质粒的大肠埃希菌BL21(DE3)诱导后得到了高效表达,SDS-PAGE显示表达产物约Mr 19 000;免疫印迹结果表明表达产物具有良好的抗原性.成功构建了pET 23a-SAG2表达质粒,实现了全长成熟SAG2蛋白在大肠埃希菌中的高效表达;表达产物具有良好的抗原性.
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影响外源基因表达的因素研究进展
随着基因工程技术运用的日益普及,重组蛋白的高效表达成为人们关注的焦点,本文从上游构建、发酵工程、代谢工程和生化工程等几方面进行探讨重组基因的高效表达.外源基因在工程菌中的表达影响因素包括:受基因剂量、质粒稳定性、mRNA5'和3'非翻译区(UTR)和信号肽等上游的影响,也受宿主菌,蛋白酶,蛋白加工,酶切,糖基化及培养条件的影响.
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巴斯德毕赤酵母高效表达外源蛋白的策略
巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)是表达外源蛋白理想的真核表达系统之一.要在一种宿主表达系统中成功表达外源蛋白并获得较高产量,必须要较为全面地了解影响其表达的诸多因素.本文综述了应用该体系高效表达外源蛋白需考虑的策略.
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重组干扰素-tau在大肠杆菌中的高效表达
目的 研究重组干扰素-tau的纯化和复性.方法 将构建好的重组质粒pBV220转化E.coii BL21,发酵培养后迅速升温至42℃2诱导干扰素-tau以包涵体的形式高效表达.裂菌后利用8 mol/L尿素溶解目的蛋白质,经凝胶过滤色谱层析纯化后,再透析复性.结果 干扰素-tau的表达量占菌体总蛋白质量的20%以上,纯化后纯度可达96%以上,活性得到有效恢复.结论 建立了干扰素-tau纯化及复性的方法,获得了高表达、高纯度、有活性的干扰素-tau.
