首页 > 文献资料
-
抗CEA F(ab')2抗体在CHO细胞中的表达、纯化及鉴定
目的:构建抗人癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)小分子嵌合抗体Rch24 F(ab’)2真核高效表达载体并在中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary Cell,CHO)中实现高产量表达,对Rch24 F(ab’)2的生物学活性进行鉴定.方法:采用DNA重组技术构建Rch24 F(ab’)2真核高效表达载体,转染CHO-dhfr-细胞,通过提高MTX浓度进行基因扩增表达,夹心ELISA法测定抗体产量,筛选高表达细胞株,采用亲和纯化的方法从细胞培养上清中纯化Rch24 F(ab’)2；采用SDS-PAGE鉴定分子量,采用Western blot、直接ELISA和细胞免疫荧光鉴定所表达的Rch24 F(ab’)2的人源性和抗原结合活性.结果:成功构建了抗人CEA小分子嵌合抗体Rch24 F(ab')2的真核高效表达载体,MTX加压扩增表达后筛选获得高产克隆5C4,其抗体产量为32.3 μg/ml;结果显示所分泌的主要为正确组装的Rch24 F(ab’)2分子,分子量约110kD; Western blot、直接ELISA、细胞免疫荧光结果证明所表达的Rch24 F(ab’)2含人抗体的恒定区,并特异地与肿瘤细胞表达的CEA结合.结论:成功地在真核细胞CHO中高效表达了具有良好的生物学活性的抗人CEA小分子嵌合抗体Rch24 F(ab’)2.
-
乙型脑炎病毒SA14-14-2株E蛋白主要抗原片段的高效表达
在本实验室已构建的原核表达载体(含乙脑疫苗株SA14-14-2株E蛋白基因主要抗原片段)的基础上用巴斯德毕赤酵母系统表达,该片段长1113bp,编码371个氨基酸残基,将其亚克隆入酵母表达载体pPICZα-A,以电穿孔法转化酵母X-33,用Zeocin平板筛选重组子,经甲醇诱导表达后,SDS-PAGE和免疫印迹分析表达产物.由于糖基化不同,所表达产物有两种,其相对分子质量分别为44kDa和50kDa,表达量较高,约为290mg/L,经Western印迹验证,有较好的抗原性.在ELISA试验中,我们直接以PBS透析后的酵母上清包被,能够很明显地区分出乙脑阴阳性血清,与RT-PCR检测的相符率达95%,为制备JEV的诊断抗原和基因工程疫苗提供了依据.
-
辐射调控自杀基因的腺病毒载体在胰腺癌细胞中的表达
早期生长反应基因-1(Egr-1)启动子可由电离辐射诱导,使得转导基因的表达可从时间与空间上进行调控[1],由此驱动单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(TK)在胰腺癌细胞中高效表达,提高杀伤胰腺癌细胞的效率,本研究旨在观察辐射调控下的自杀基因的腺病毒载体在胰腺癌细胞中的表达.
-
Flt3配体重组腺病毒治疗小鼠胃癌的实验研究
Flt3配体(FL)是新的早期造血生长因子[1].研究表明,它能显著增加树突状细胞(DC)[2]、自然杀伤细胞(NK)[3]的数量和功能.DC和NK细胞在机体抗肿瘤免疫反应中起着关键作用,因此如何增加DC、NK细胞的数量和功能,一直是我们研究的热点.虽然Flt3有此作用,但其在体内表达的水平很低,时间短,不能达到抗肿瘤的需要,因此在早期我们设计了Flt3配体重组腺病毒感染小鼠前胃癌细胞的研究,并证实被感染的胃癌细胞能介导所携带的mFL高效表达[4].在此基础上我们用Flt3配体重组腺病毒对小鼠胃癌进行局部治疗,观察其小鼠体内抗肿瘤效果.
-
前药热化疗对转CD基因结肠癌细胞SW480作用及其机制
有研究表明,癌胚抗原(CEA)转录调控序列可控制胞嘧啶脱氨基酶(CD)基因在CEA阳性的大肠癌组织中高效表达,在前药5-FC作用下产生选择性杀肿瘤细胞作用.研究显示,5-FC热化疗可增加其对转基因细胞的靶向性杀伤作用[1],为探讨前药热化疗作用机制,我们进行了初步研究.
-
人硫氧还蛋白cDNA的克隆和表达
我们在本研究中克隆出hTrx成熟区cDNA序列并在原核中高效表达出hTrx蛋白,现将结果报道如下.
-
心肌线粒体肌酸激酶肌膜型亚基基因在大肠杆菌中的表达
随着临床冠状动脉旁路术、经皮冠状动脉成形术以及溶栓术的应用,虽然挽救了许多心肌缺血性疾病患者的生命,但是也应运而出现了"再灌注损伤"问题.目前,人们认识到能量代谢障碍是造成心肌再灌注后细胞及亚细胞损伤的重要始动因素[1],而心肌线粒体肌酸激酶与能量代谢密切相关,它位于线粒体内外膜之间,内膜外表面上,是线粒体ATP的产生、利用、转换和贮存的关键酶[2].其中线粒体肌酸激酶肌膜型亚基(sMiMi-CK)只存在于心肌线粒体中,并能高效表达[3].故我们以此为重点在体外表达sMiMi-CK,从而为缺血性心脏病的治疗开辟一条基因治疗的新途径.
-
一种可用于治疗苯丙酮尿症的工程菌株的建立
目的:通过基因重组建立高效表达有活性的PAL菌株,为开创苯丙酮尿症的新疗法奠定基础.方法:对已克隆于pUC19质粒中的水稻苯丙氨酸氨解酶的cDNA进行反向测序,根据测序结果,与pET28系列质粒中的阅读框架结构进行比较,选择相匹配的pET28c质粒作为表达载体,用EcoRⅠ分别切开质粒pUC19-rPAL-1-cDNA和pET28c,切下的2.5 kb rPAL-1-cDNA通过1.5%琼脂糖凝胶电泳分离,透析袋回收,酚、氯仿抽提,乙醇沉淀,纯化后溶于双蒸水备用.
-
重组人β-防御素-2基因的植物表达载体的建立
目的:许多证据表明:利用转基因植物作为生物反应器规模化生产高附加值的药用重组蛋白质,其技术可行、成本低廉、效益显著,具有广阔的应用开发前景.本研究拟运用植物转基因技术,尝试构建高效表达hBD-2的植物生物反应器的可能性.方法:将C端带Myc和6xHis双标记的hBD-2的重组DNA克隆到植物真核表达载体pCAMBLA1303中,构建C端带Myc和6xHis双标签的hBD-2的重组植物真核表达载体;并将此载体转化根癌农杆菌LBA4404,利用卡那霉素进行抗性基因筛选,确定根癌农杆菌的阳性克隆;通过根癌农杆菌将外源基因转入马铃薯植物愈伤组织细胞,利用潮霉素抗性基因筛选及PCR检测,监测hBD-2在其中的遗传表达.结果:(1)酶切分析、PCR验证和DNA测序等证据表明,C端6个组氨酸的hBD-2已被正确地插入pCAMBIA1304载体中CaMV 35S和Nos终止子之间,成功构建了重组hBD-2/His基因的植物表达载体rpCAMBIA1304/hBD-2/His.(2)rpCAMBIA1304/hBD-2/His已成功地转化根癌农杆菌LBA4404,阳性克隆菌株已获得.(3)潮霉素抗性进行筛选及PCR检测结果提示:hBD-2 cDNA基因已整合到马铃薯植物愈伤组织的基因组中.结论:结果表明,重组hBD-2/His基因的植物表达载体通过根癌农杆菌介导进入了马铃薯细胞植物愈伤组织.利用植物转基因技术,构建高效表达hBD-2的植物生物反应器具有可能性.
-
重组人β-防御素-2基因在昆虫细胞的转染表达
目的:BEVS(Baculovirus expression vector system)杆状病毒表达系统是近年涌现的适用范围广、表达效率高的真核表达系统之一.本研究旨在探索应用该系统高效表达hBD-2的可行性及技术路线.方法:(1)利用引物hBD2p6和hBD2p9经PCR扩增,从原质粒的pcDNA3.1/Myc-His(+)/hBD-2中扩增出带有翻译起始密码ATG和终止密码TGA的完整重组hBD-2/His基因片段,通过双酶切,使该片段两端分别带有ScaI和KpnI两种限制性内切酶粘性末端;将此外源性片段插入转移质粒pAcGHLT-A的多克隆位点中的ScaI和KpnI位点上,使其处在多角蛋白基因强启动子的控制之下.(2)经重组pAcGHLT-A/hBD-2/His转移载体和AcNPV DNA共转染Sf21细胞,并在细胞内进行同源重组,形成重组病毒rAcNPVhBD-2/His.于共染后第5 d,收集各组细胞的培养上清,用终点稀释分析法检测共转染效率.经过多轮感染上清反复感染Sf21细胞和终点稀释分析法验证,获得高滴度的重组病毒.(3)用特异性抗-His抗体,经Western blot检测细胞及上清hBD-2/His的表达情况.结果:经酶切鉴定和测序分析证实:C端带Myc和6个多聚组氨酸双重标志的重组hBD-2已正确地插入BEVS系统的转移载体中,构建成重组转移载体pAcGHLT-A/hBD-2/His.经过多轮感染上清反复感染Sf21细胞及终点稀释分析法验证,高滴度的重组病毒rAcNPVhBD-2/His已被获得.Western blot检测结果提示Sf21细胞已表达和分泌6xHis-GST-hBD-2-6xHis融合蛋白.结论:本研究结果支持利用BEVS杆状病毒-昆虫表达系统作为高效表达重组hBD-2生物反应器的设想.
-
慢病毒载体--重组蛋白高效表达的新契机
随着生命科学产业的发展，人们对于重组蛋白的需求越来越大，所以构建一种能够大规模生产重组蛋白的系统成为当前的研究热点。而通过慢病毒（Lentivirus）来提高重组蛋白的产量可能会是一种十分有效的方法。由于其拥有的优良特性，慢病毒系统被广泛关注，已经被应用于许多领域。本文对近年来有关慢病毒系统在外源重组蛋白表达方面的应用进行了综述。将慢病毒应用于外源重组蛋白的表达，将会为外源蛋白的高效表达提供新的契机。
-
抗人血管内皮生长因子嵌合抗体在真核细胞中的高效表达
目的：在中国仓鼠卵巢（Chinese hamsterovary,CHO）细胞中高效表达有活性的抗人血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）嵌合抗体，并探索获得佳表达的途径。方法：采用一种新型的基因工程抗体真核高效表达载体系统，将抗VEGF嵌合抗体轻、重链基因导入二氢叶酸还原酶缺陷型CHO细胞，筛选表达抗VEGF嵌合抗体的克隆，再进行递增浓度的氨甲喋呤(methotrexate,MTX)加压扩增表达。采用ELISA检测所表达的嵌合抗体的生物学特性和产量。结果：采用三种不同的筛选加压扩增表达方法获得的结果有差异，其中采用每轮加压扩增表达后进行亚克隆的方法获得了高表达产量的克隆，产量可达28μg/ml。ELISA结果证实所表达的抗体为特异地与VEGF结合的、含人抗体恒定区的抗VEGF嵌合抗体。结论：成功地在真核细胞中高效表达了有活性的抗VEGF嵌合抗体，为下一步该嵌合抗体的临床试用奠定了重要的基础，并探索出该表达系统佳的筛选加压扩增表达方法。
-
幽门螺杆菌hpaA基因工程菌蛋白表达条件优化、纯化及其活性鉴定
目的:优化幽门螺杆菌hpaA基因工程菌(pMAL-c2X-hpaA-TB1)的表达条件,并对其表达产物进行纯化和免疫活性鉴定.方法:通过诱导表达实验了解不同诱导时机、诱导剂浓度、诱导时间对蛋白表达量的影响, 并应用SDS-PAGE方法对表达产物进行分析;Amyloss树脂预装柱对可溶性HpaA蛋白进行分离、纯化;对纯化后蛋白做Western blot实验鉴定免疫活性.结果:该工程菌培养2 h时加入异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)终浓度为0.3 mmol/L进行诱导4 h,目的蛋白表达量达到菌体总蛋白的30%以上;经纯化得到了较高纯度(＞90%)的目的蛋白,并具有良好的免疫活性.结论:建立了从TB1(pMAL-c2X-hpaA)可溶性表达产物中纯化高纯度rHpaA融合蛋白的方法,为进一步的动物实验和诊断性抗原的研制以及工程菌发酵、高效表达生产工艺的研究打下了基础.
-
VEGF与SUMO在大肠杆菌中融合高效表达及纯化
目的 研究血管内皮生长因子(VEGF)与小分子泛素样修饰蛋白(SUMO)融合并转入大肠杆菌BL21中进行VEGF的可溶性高效表达. 方法 采用PCR扩增方法,获得编码VEGF与SUMO融合蛋白的DNA片段并插入表达载体pET3c中,构建重组表达载体pET3c-SUMO-VEGF,转化到大肠杆菌B121中,获得重组菌株BL21/pET3c-SUMO-VEGF.以IPTG为诱导剂,对阳性重组茼株的诱导表达参数如诱导剂浓度、诱导温度、诱导时间等进行优化.结果 融合蛋白的佳表达条件为当OD600约0.6时,加入0.5mMIPTG,20℃诱导24h,获得了纯度达70%以上的SUMO-VEGF.结论 通过融合表达,解决VEGF独立表达时表达量低和可溶性差的问题,使其商业化的步伐进一步加快.
关键词： 血管内皮生长因子 小分子泛素样修饰蛋白 融合蛋白 高效表达 -
一个承载分子的设计与肽抗生素hPAB-β的高效表达
目的通过设计一个承载蛋白分子高效表达肽抗生素hPAB-β,为大量制备hPAB-β奠定基础.方法根据肽抗生素的特性,确立4条设计原则,并据此设计一489bp的承载蛋白编码序列,用化学合成法获得该序列并将之克隆到pQE-32中构建成表达载体,进一步将肽抗生素hPAB-β基因插入上述表达载体,肽抗生素基因位于承载蛋白编码序列3'-端,两者构成融合基因.将含融合基因的表达载体转化大肠杆菌JM109,筛选阳性重组子,并用阳性重组子表达融合蛋白.结果设计的承载蛋白为163个氨基酸,分子量17668.80, 等电点5.621.用承载分子与肽抗生素hPAB-β构建的融合蛋白表达载体转化细菌后,筛选到4个阳性重组子,均能高效表达肽抗生素融合蛋白,融合蛋白的产量占细菌总蛋白的40%～45%.结论设计的承载蛋白分子能够实现肽抗生素的高效表达.
-
M istic融合蛋白促进ω-3脂肪酸去饱和酶 Fat-1在大肠埃希菌中高效表达
目的：构建真核膜蛋白ω‐3脂肪酸去饱和酶Fat‐1基因在大肠埃希菌中的高效表达质粒。方法利用分子克隆技术构建携带Fat‐1基因的重组原核表达质粒pET32a‐Fat‐1和插入膜蛋白表达分子伴侣Mistic基因的pET32a‐Mistic‐Fat‐1；将两种重组质粒转化大肠埃希菌株BL21（DE3），IPTG诱导表达Fat‐1蛋白和M110‐Fat‐1蛋白，通过十二烷基‐聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS‐PAGE）灰度分析其表达量，蛋白免疫印迹法（Western blot）进一步鉴定蛋白表达。结果经酶切鉴定和测序证实成功构建了pET32a‐Fat‐1和pET32a‐Mistic‐Fat‐1原核表达载体；SDS‐PAGE和Western blot证实ω‐3脂肪酸去饱和酶Fat‐1在原核表达系统中没有明显诱导表达，而M 110‐Fat‐1融合蛋白在大肠埃希菌中获得了高效表达，占全细胞蛋白总量的15％。结论ω‐3脂肪酸去饱和酶Fat‐1基因与Mistic基因融合表达，实现了在原核宿主中高效表达真核膜整合蛋白ω‐3脂肪酸去饱和酶Fat‐1。
关键词： M istic ω-3脂肪酸去饱和酶Fat-1基因 膜蛋白 高效表达 -
流行性乙型脑炎病毒E蛋白基因的克隆及高效表达研究进展
流行性乙型脑炎(Epidemic Encephalitis B)是乙型脑炎病毒Iencephalitis B Vims),又称日本脑炎病毒(Japanese EncephalitisVirus,JEV)引起的中枢神经系统的急性传染病.
-
抗氯霉素单链抗体的高效生产
[目的]建立抗氯霉素单链杭体(scFvCAP)的大肠杆菌高效生产体系.[方法]采用重叠延伸PCR法组装scFvCAP,并通过优化5端序列实现高效表达,采用β-环糊精人工伴侣系统实现SDS变性蛋白的复性.[结果]成功组装scFvCAP基因(Genebank ID:GU258048).在强启动子T7驱动下,scFvCAP基因独立表达时未见显著表达,而通过同义突变所得突变基因scFvCAP(Genebank ID:GU258048 )即可高效表达.高效表达所形成的包涵体蛋白可溶于1%SDS-8 mol/L尿素溶液,经β-环糊精人工伴侣系统复性后所获scFvCAP具有与母本单克隆抗体相似的亲和力.[结论]成功建立了基于大肠杆菌基因工程系统的scFvCAP高效生产体系.
-
幽门螺杆菌omp22基因工程菌蛋白表达条件优化、纯化及活性鉴定
[目的]优化幽门螺杆菌omp22基因工程菌(pMAL-c2X-omp22-TB1)的表达条件,并对目的蛋白进行纯化和免疫活性鉴定. [方法]在不同诱导时机、诱导剂(IPTG)浓度、诱导时间下诱导pMAL-c2X-omp22-TB1的表达,测定目的蛋白的表达量.在优化条件下诱导工程菌表达,采用SDS-PAGE方法对表达产物分析;Amyloss树脂预装柱对可溶性OMP22蛋白进行分离、纯化,对纯化蛋白做Westem blot分析. [结果]工程菌培养2 h时加入IPTG(终浓度为0.3mmol/L)诱导4 h,目的蛋白表达量达到菌体总蛋白的25%以上;经纯化得到了较高纯度(>90%)的目的蛋白,并具有良好的免疫原性. [结论]建立了从TB1(pMAL-c2X-omp22)可溶性表达产物中纯化较高纯度OMP22融合蛋白的方法,为进一步的动物实验和诊断性抗原的研制以及工程菌高效表达生产工艺的研究打下了基础.
-
抗CEA嵌合抗体在CHO细胞中的高效表达
目的 为了在CHO-dhfr细胞中高效表达有活性的抗人CEA鼠-人嵌合抗体。方法 构建抗CEA嵌合抗体的真核高效表达载体，转染CHO-dhfr细胞，通过加入MTX进行基因扩增表达，获得高产细胞株。采用Western bolt、ELISA、体内放射免疫实验等方法鉴定所表达的嵌合抗体的生物学特性。结果 获得产量可达60μg/ml的细胞株。Western blot、ELISA、体内放射免疫实验证明所表达的嵌合抗体的确含人抗体的恒定区，并特异地与CEA结合。结论 成功地在真核细胞CHO-dhfr中高效表达了抗CEA嵌合抗体，并具有良好的生物活性。
