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胃肠道平滑肌细胞作为eNOS基因转移靶细胞的研究
目的:构建内皮型一氧化氮合酶(eNOS)腺病毒表达载体,介导eNOS在胃肠道平滑肌细胞中稳定表达并评价表达产物eNOS的酶学活性.方法:构建牛eNOS的重组腺病毒表达载体Ad-eNOS,感染体外培养的猫下段食管及胃底部平滑肌细胞,采用Western blot、RT-PCR技术检测eNOS在平滑肌细胞中的表达,测定基因转移后NOS活性以及一氧化氮(NO)产量,并研究不同施加因素对NOS活性及NO合成的影响.结果:Ad-eNOS可高效感染体外培养的胃肠平滑肌细胞(MOI=50,感染效率=74%),Western blot、RT-PCR结果证实eNOS在平滑肌细胞中高效表达.Ad-eNOS感染细胞后基础NOS活性比感染前显著增高(93±13 vs 47±13 nkat/L,P<0.05),培养液中累积的NO增加了3倍(45±13 vs16±7μmol/L,P<0.05).分别加入L-精氨酸(10-4mol/L)、钙离子(10-4 mol/L)、EGTA(钙离子螯合剂,10-4 mol/L)及L-NAME(NOS抑制剂,10-3mol/L)后,NOS活性分别为94±8,173±25,29±6,58±11 nka/L,NO含量分别为48±14,106±18,6±2,17±11 μmol/L.结论:构建的重组腺病毒Ad-eNOS能够高效介导eNOS基因在消化道平滑肌细胞中表达,表达产物eNOS活性受钙离子浓度调节,其作用底物L-精氨酸并不是NO合成的限速步骤.
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Clostridium difficile细胞毒素B羧基末端功能区的克隆与表达
目的:克隆并表达Clostridium diifficile(C difficile)细胞毒素B羧基末端功能区基因,为探索高效的防治C difficile感染的疫苗和诊断抗原奠定基础.方法:提取C difficile染色体基因,用PCR方法扩增ToxinB3基因,将其克隆至表达载体PET22b(+),用重组质粒转化大肠杆菌[E.coli BL21(DE3)],并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达.用 SDS-PAGE方法对表达产物进行分析.结果:从C difficile基因组DNA中成功地克隆了毒素B的羧基末端重复区域的1848 bp基因,经过双酶切、PCR和测序鉴定分析,插入到载体的基因与GenBank中公布的C difficile VPI10463的ToxinB3基因序列的同源性为99%.SDS-PAGE显示,目的基因表达产物的分子质量为71.3 ku,利用表达载体PET22b(+)表达出蛋白质,重组蛋白表达量占菌体总蛋白的34.8%.结论:含C difficile Toxin B3基因的PET22b(+)重组质粒能高效表达目的基因.该重组子的构建为Clostridium diffiicile相关性疾病的诊断及后期制备疫苗,提供了有力的保障.
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HCV-Fc融合基因疫苗真核表达载体的构建及表达
目的:构建能表达HCV C-Fc融合基因的真核表达载体,为进一步修饰和转染树突状细胞,制备能高效表达HCV C和Fc基因的树突状细胞疫苗做准备.方法:用分别含有Kpn Ⅰ和XholⅠ酶切位点的HCV C区基因上、下游引物,以含有HCV H株基因序列的质粒pBRTM/HCVl-3011为模板,通过PCR扩增获得HCV C区基因片段回收后,以Kpn Ⅰ和Xhol Ⅰ双酶切,定向插入到含IgGl Fc基因的质粒pIgC3双粘端位点之间,获得重组表达质粒pHCVFc.通过Kpn Ⅰ双位点酶切、PCR及插入片段序列测定对质粒进行了鉴定.以抗HCV C单克隆抗体为一抗,利用间接免疫荧光法检测了pHCV-IgFc在人肝癌细胞7 721中的瞬时表达.结果:酶切、PCR及测序鉴定证实,pHCV-IgFc插入片段为HCV C区基因片段,免疫荧光法检测表明其可以在7 721细胞中瞬时表达.结论:构建的质粒pHCV-IgFc可以在7721细胞中瞬时表达HCV C区基因,为研究HCV C-Fc融合基因修饰的树突状细胞的功能奠定了基础.
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胃癌相关基因GCRG224的克隆及其在大肠杆菌中的表达
目的:利用硫氧还蛋白融合表达系统表达胃癌相关基因GCRG224.方法:采用PCR技术从pGEM-T质粒上扩增出含完整ORF的GCRG224 cDNA序列,将其克隆至硫氧还蛋白融合表达载体pET102/D-TOPO中,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达重组融合蛋白,SDS-PAGE分析表达产物.结果:高效表达出相对分子量约16 800的重组融合蛋白.薄层凝胶扫描显示,其表达量占菌体总蛋白质的22.3%.结论:在大肠杆菌中成功表达了GCRG224重组融合蛋白.
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表达幽门螺杆菌热休克蛋白60克隆的构建
目的:构建含Hp热休克蛋白60(Hsp60)基因的重组载体并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,为进一步研究Hsp60的佐剂功能和免疫原性奠定基础.方法:提取Hp染色体基因,用PCR方法扩增Hsp60基因,将其克隆至表达载体pET-22b(+),转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达并通过免疫印迹实验研究其免疫原性.结果:分离得到了1.6kb的Hsp60基因片段,并在大肠杆菌中实现了该基因的高效表达,在37℃诱导表达3 h后,表达产物占细菌总蛋白的27.2%.表达以可溶性蛋白和包涵体两种形式存在,其中主要是包涵体的形式,目的蛋白占不溶性蛋白的76.6%.经免疫印迹证实该重组蛋白可以被Hp感染患者血清所识别.结论:成功地克隆并表达Hp Hsp60基因,为Hp疫苗的研制打下了基础.
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安徽克隆出实体瘤克星
据健康报 (记者冯立中)一种能切断癌组织的,"后勤补给线"让癌细胞"饿死"的抗肿瘤药物-内抑素(Endostatin)的研究在我国获得重大突破.安徽桑尼生物技术研究所的科研人员成功地克隆出人内抑素,并使之在大肠杆菌中得到了高效表达科研人员又独创性地解决了这种蛋白的水溶性和稳定性这一世界难题,为工业化生产创造了条件.在安徽省科委近日主持的鉴定会上,与会专家对这一成果给予了高度评价.
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NF-κB的活性与急性胰腺炎
急性胰腺炎具有病情重、发病率高的特点,死亡率约占发病人数的10%左右.常见的死亡原因为多器官功能不全综合征(MODS),急性呼吸窘迫综合征(ARDS)以及全身炎症反应综合征(SIRS).目前急性胰腺炎引起远隔器官组织损伤的发病机制仍然不清,但近几年一系列实验证明与多种细胞因子(IL-1,IL-6,和TNF-α)引起的局限性和全身性组织损伤有关.经研究发现,核因子-κB(nuclear factor-kappB,NF-κB)在急性胰腺炎中高效表达并与其他因子一起对急性胰腺炎的发生及相关基因转录起着重要作用[1].同时近几年已证实细胞凋亡(apoptosis)也参与了急性胰腺炎的病理生理过程.而研究NF-κB在急性胰腺炎中基因表达及细胞凋亡的关系,为我们进一步探讨急性胰腺炎的发病机理及治疗措施提供了依据.
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肝癌基因治疗研究进展
肝癌是世界上恶性程度极高,且预后极差的恶性肿瘤之一,每年全球约有125万人患病。在我国肝癌目前已处于恶性肿瘤死亡率的第二位,每年至少有10万名新发现病人,和11万名肝癌病人死亡〔1〕。尽管目前肝癌的治疗方法有许多种,但治疗效果都十分有限,并未显著延长病人的生存期。大部分肝癌病人对化疗及放疗等治疗均不敏感,能手术根治的病人仅占15%。随着分子生物学和免疫学理论及技术的不断发展和对肿瘤发病机制的不断认识,人们可以利用基因工程的手段进行肝癌的基因治疗,且在该领域已显示出一定的临床治疗效果。如Habib等〔2〕使用野生型p53基因治疗原发性肝细胞癌的临床治疗试验,取得了很大的成功,引起人们的普遍关注。本文就目前肝癌基因治疗的研究现状和发展趋势作一综述。 一、肝癌基因治疗中所使用的载体系统和治疗途径的选择 目前在肝癌基因治疗实验当中使用多的是病毒载体系统,包括腺病毒载体〔3〕、逆转录病毒载体〔4〕、腺相关病毒载体〔5〕等,非病毒载体系统主要是使用脂质体〔2,6〕介导,且已进入临床试验阶段。在肿瘤基因治疗中,腺病毒载体系统具有许多优点,如制备容易,能获得高纯度、高滴度的腺病毒体;无遗传毒性,以游离型状态存在,不整合进入宿主DNA中;表达时间相对短暂,一般15~20 d左右,不会造成对免疫系统的长期慢性刺激〔7〕;感染宿主范围相对较广,尤其是能感染复制、分裂期的细胞。近几年临床上使用腺病毒载体治疗恶性肿瘤的例子越来越多〔8〕。体外实验证实,数个人的肝癌细胞系HepG2、Hep3B、Hnh7、HLE、HLF、SK-HEP-1和大鼠肝癌细胞系McA-RH7777等,均对腺病毒十分易感,50MOI可使近100%的细胞被感染〔9〕。作者曾在军事医学科学院百环生物医学研究中心吴祖泽院士指导下,以腺病毒载体介导绿色荧光蛋白基因作为标记基因,也证实3个人的肝癌细胞系HepG2、SMMC7721、BEL-7402,一个胆管癌细胞系QBC939,一个正常肝细胞系L02,均对腺病毒易感,50MOI可使90%左右的靶细胞受感染。Castell等〔10〕利用携带LacZ基因的腺病毒体,感染体外原代培养的正常肝细胞,结果证实:肝细胞对腺病毒十分易感,15MOI感染1 h,可使80%的肝细胞受感染,20MOI感染1 h可使100%的肝细胞受感染;导入的目的基因可以在肝细胞内高效表达;感染腺病毒后,并不影响肝细胞的正常生化功能,如肝细胞的尿素合成、胞膜蛋白合成、生物转化活性等,认为使用腺病毒载体进行肝脏疾病的基因治疗,是十分有效的工具载体。但有实验表明大剂量腺病毒载体对肝功能还是有影响的〔11〕,随感染病毒量的加大,肝脏的毒性作用也加大,且感染腺病毒的靶细胞刺激机体产生免疫反应,从而使腺病毒的转化效率降低,限制了重复使用。使用逆转录病毒载体进行肝脏疾病的基因治疗,也有其有利之处:因逆转录病毒只感染处于复制、分裂期的细胞,而处于非复制期的细胞则不受感染。因肿瘤细胞多处于分裂期,而肿瘤周围的正常肝细胞多处于静止期,故逆转录病毒载体具有一定的靶细胞特异性〔4〕。Kitten等〔12〕使用逆转录病毒载体,通过门静脉注入大鼠肝内,有46%±17%的肝细胞受到感染,随病毒滴度的升高,细胞的转导效率也 增加。虽然逆转录病毒载体能将目的基因有效地导入肝癌细胞内,对肝脏这样的低分裂组织局部应用较为合适,但系统体内(in vivo)法应用,就会对骨髓、生殖细胞、肠上皮细胞等分裂增殖旺盛的组织,产生致死性杀伤作用,有产生与放、化疗相似副作用的危险。对于原发性肝细胞癌,癌细胞的增殖生长一般比较缓慢〔12〕,因此使用逆转录病毒载体可能转化效率较低,但对于肝转移癌,因为细胞增殖较为旺盛,故使用逆转录病毒载体较为合适。对于使用腺相关病毒载体进行肝癌的基因治疗,目前还研究较少,但腺相关病毒无致病性,有广泛的宿主范围,能感染不分裂的S期细胞,并能整合到宿主DNA的特异部位中,故减少了发生插入突变的危险性。Su等〔5〕使用AAV介导AFP/HSV-TK基因,证实目的基因能在肝癌细胞中高效表达,并具有杀伤肝癌细胞的作用。
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肝癌相关抗原HAb18G对小鼠成纤维细胞分泌基质金属蛋白酶2、9的影响
HAb18G为高特异性地表达于肝癌细胞膜表面的一种膜抗原[1,2],本研究将HAb18G全长cDNA直接转染入小鼠成纤维细胞株NIH/3T3,建立高效表达HAb18G的小鼠成纤维细胞株,观察其对基质金属蛋白酶(MMPs)的分泌所产生的影响,研究肝癌易于浸润转移的机制.
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血管内皮生长因子基因促心肌血运重建的实验研究
采用猪慢性心肌缺血模型,用携带人类血管内皮生长因子165(VEGF165) cDNA(hVEGF165)的高效表达质粒载体pcDND3.1直接注入缺血心肌,评估VEGF基因促进心肌血运重建的疗效.
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兔同种异体原位肾脏移植早期热休克蛋白70的表达
热休克蛋白(HSP)是细胞在一些应激条件时高效表达的一族蛋白,具有重要生理功能,高度保守的蛋白质分子家族.Morimoto等[1]将主要的HSP分为HSP90、HSP70、HSP60及小HSP等4个家族.其中,相对分子质量为70000的诱导型HSP(iHSP70)因其在应激状态下可显著升高[2]成为受关注、研究深入的一种.本研究于2001年至2002年在南方医科大学通过免疫组化法对兔同种异体原位肾脏移植后早期iHSP70的表达进行了初步研究,现将结果报告如下.
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寡核苷酸Dbait乏氧放射双表达对人宫颈癌细胞的乏氧放射增敏效应
基因-放疗是将放射敏感性调控序列与治疗基因和药物相耦联,在肿瘤放疗同时诱导目的基因和药物在肿瘤内高效表达,从而提高肿瘤放射敏感性,它是近年来肿瘤放疗新策略[1].早期生长反应-1(early growth response-1,Egr-1)启动子在电离辐射诱导下能增强下游基因表达,并可提高放疗效果;乏氧反应元件(hypoxia response elements,HRE)在乏氧条件下可增强下游基因表达水平.
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恶性疟原虫Pfs25蛋白在毕赤酵母中高效分泌表达策略的研究
目的:探索Pfs25蛋白在毕赤酵母中高效分泌表达策略,提高Pfs25蛋白的表达量.方法:本研究主要通过4个方面深入研究Pfs25蛋白的高效表达策略.①构建Pfs25蛋白的诱导型表达重组株pPICZαA-Pfs25/GS115和组成型表达重组株pGAPZα A-Pfs25/GS 115,并比较两酵母菌株的表达量差异.②从培养基、pH值、表达时间等方面入手,分别对诱导型和组成型分泌表达条件进行研究,寻找适合Pfs25蛋白表达的佳条件.③利用pAO815表达载体构建Pfs25多拷贝重组酵母菌株pAO815-(α-Pfs25) n/GS115,通过提高pfs25基因拷贝数来提高表达量.④将毕赤酵母中蛋白二硫键异构酶(PDI)基因引入Pfs25重组酵母中,以提高Pfs25蛋白的分泌表达.结果:本研究成功构建了Pfs25诱导型和组成型表达重组酵母菌株,实现了Pfs25的诱导型和组成型表达,组成型表达量略高于诱导型.并通过对各种表达条件的比较研究,找到了适合Pfs25蛋白在毕赤酵母中高效分泌表达的条件.结论:通过对Pfs25蛋白高效表达策略的研究,显著提高了Pfs25蛋白在毕赤酵母中的分泌表达水平,使其表达量提高了约5倍.
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肝癌自杀基因治疗新进展
自杀基因治疗是指利用基因工程技术将某些细菌或病毒基因<目的基因)与载体相结合,并导入肿瘤细胞中,在一定条件下目的基因持续高效表达,从而杀伤肿瘤细胞,所以又称为"病毒导向酶解药物前体疗法.这些病毒或细菌的基因表达产物(酶)能导致受体细胞的死亡,因此将这些基因称为自杀基因.本文就肝癌自杀基因治疗的新进展作一综述.
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人钙调素基因表达研究及应用
主要获得以下成果:1.用基因重组技术在大肠杆菌DH5α中高效表达并纯化重组人钙调素(rhCaM)蛋白.
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重组人粒细胞集落刺激因子注射液(粒生素)的研制和应用
本项目是用基因工程的方法生产粒细胞集落刺激因子(G-CSF),属生物技术领域.产品是癌症化疗、放疗后首选升白细胞(造血恢复)制剂,作为有效的支持药物可显著地降低病人的感染发生率、住院天数、抗生素使用天数及因中性粒细胞减少并发的发热.该药为销售额大、市场增长快的生物技术药物.项目包括以下几个部分:①基因的克隆及高表达菌株的构建;②中试及生产工艺的研究;③临床前药理、药效、毒理学评价;④临床多中心评价;⑤项目的推广应用.项目主要技术关键是克隆人G-CSF基因并在大肠杆菌系统中获得稳定、高效表达,特点及技术创新点在于菌株G-CSF表达率达30%以上,高于国外同类产品水平.
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真核细胞表达基因工程抗体的研究进展
大肠杆菌E.coli表达系统是非常常用、有效和方便的表达系统,可以进行许多异源蛋白的高效表达.然而原核细胞系统表达蛋白时,存在多种缺陷:真核基因通常含有内含子,原核细胞不能对其进行正确的剪切和拼接;缺乏真核生物的蛋白翻译后修饰和加工;表达产物多以包涵体形式存在,复性困难且效率很低;背景杂蛋白多、不易于纯化等,因此不可避免地对利用原核细胞表达基因工程抗体造成一定影响.
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干细胞移植治疗糖尿病下肢血管病变的研究进展
干细胞移植治疗的基础研究北京医科大学血管外科研究所、首都医科大学实验中心崔世军等关于是VEGF-bFGF基因治疗家免慢性肢体缺血的实验结论为:VEGF、bFGF和VEGF-bFGF真核表达载体可以获得局部高效表达,刺激体内新生血管生成,建立侧枝循环,改善慢性肢体缺血的效果.
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芍药Actin基因在大肠杆菌中的高效表达
目的 构建芍药Paeonia lactiflora Actin (PlActin)基因原核表达载体,优化PlActin基因在大肠杆菌中的高效表达体系.方法 基于PlActin基因cDNA序列及原核表达载体pET-32a(+)多克隆位点序列,设计一对5'末端分别插入BamHⅠ和Hind Ⅲ酶切位点的特异性PCR引物,基于RT-PCR技术亚克隆P1Actin基因;用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切重组质粒pMD 18-T-PlActin和原核表达载体pET-32a(+),胶回收纯化目的基因和空载体,连接、转化后应用菌落PCR、质粒PCR和双酶切鉴定出重组子pET-32a (+)-PlActin,转化BL21 (DE3)菌株获得基因表达工程菌;分别设置诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)浓度梯度、诱导的菌体起始密度梯度及表达时间梯度,诱导PlActin基因在大肠杆菌中表达,SDS-PAGE电泳、考马斯亮蓝R250染色后制备干胶并比较重组Actin蛋白的表达量.结果 亚克隆测序结果表明PlActin与目的序列完全一致,且其编码区序列(CDS)上下游成功插入了BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位点;成功构建了芍药原核表达载体pET-32a(+)-PlActin;诱导剂IPTG的佳浓度为0.1 mmol/L,诱导的菌体起始密度(A600)为0.4~0.6,佳表达时间为4h.结论 构建了P1Actin基因原核表达载体pET-32a (+)-P1Actin,建立了P1Actin基因在大肠杆菌中的高效表达体系.
关键词: 芍药 actin 大肠杆菌 SDS-PAGE电泳 高效表达 -
高效绿色荧光蛋白基因标记系统的建立及其初步应用
逆转录病毒载体编码的众多报告分子被广泛用于分析基因转导率、分选或示踪基因修饰靶细胞,特别在改进基因转导条件、阐明造血干细胞(HSC)生物学特性和判定白血病复发的细胞来源等方面发挥了重要作用[1,2].作为新一代的报告分子,增强型绿色荧光蛋白(EGFP)近已被用于造血细胞的基因转移和示踪肿瘤转移与血管形成等研究[3].我们曾建立双启动子逆转录病毒载体介导的EGFP基因转移系统,但发现转导靶细胞后荧光强度较低[4].为提高靶细胞EGFP的表达,我们构建了仅携带EGFP单基因的逆转录病毒载体GIFP,并在不同类型靶细胞获得高效表达,为在体内进行基因标记研究提供了一种有效的工具.