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Klotho蛋白在肾脏疾病中研究进展
肾脏疾病已成为威胁人类健康的公共卫生问题之一,其发病机制尚不非常清楚,治疗手段有限.Klotho蛋白是体内Klotho基因编码的一种单向跨膜蛋白,主要在肾小管上皮细胞中表达,可在血液和尿液中检测到.Klotho蛋白具有多种生物学效应,包括调节矿物质代谢、抗凋亡和抗衰老等[1].近年的研究提示Klotho蛋白水平降低可能在急性肾损伤(acute kidney injury, AKI)的发生发展中起着重要作用,并有可能作为AKI诊断和判断预后的一个新的标志物[1].同时Klotho蛋白对钙磷代谢的调节作用也为慢性肾脏病(chronic kidney disease, CKD)的治疗提供了新的方向.本文就近年来Klotho蛋白在肾脏疾病发病机制、诊断和治疗等方面的研究现状作一综述.
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肝再生增强因子在肾间质纤维化中的研究进展
肾纤维化，尤其是肾小管间质纤维化( RIF)是各种肾脏疾病发展致肾衰竭的共同途径[1]，其病变的程度与肾功能的损害程度密切相关。肾间质纤维化是一个缓慢的动态过程，涉及到各种细胞因子的释放、炎症细胞的浸润、肾小管上皮细胞-间充质细胞转分化( EMT)、肾小管上皮细胞( RTEC)的凋亡、细胞外基质的过度积聚及降解失衡等因素。近年来，随着对肾间质纤维化的深入研究，发现ALR在抑制肾间质纤维化病理过程中发挥作用，且受到越来越多学者的关注。
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冬虫夏草治疗肾纤维化研究进展
肾纤维化是肾脏对慢性损伤的病理修复反应,以细胞外基质(extracelluar matrix, ECM)成分在肾脏过度增生与沉积为特征,是多种慢性肾病的共同病理基础与慢性肾病向终末期肾衰竭进展的重要途径.肾纤维化发生在肾间质和肾小球等部位,分别表现为肾间质纤维化与肾小球硬化.肾纤维化病理机制复杂,但主要在于肾脏ECM生成细胞的活化.肾脏ECM生成细胞包括肾间质成纤维细胞、肾小球系膜细胞与肾小管上皮细胞,这些细胞在氧自由基、细胞因子、内皮素与血管紧张素等多种因子的刺激下,发生活化或转分化,细胞表型改变,均表现为表达α-平滑肌肌动蛋白的肌成纤维细胞(myofibroblast, MFB)[1].
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具有线粒体保护作用的中医药及其在慢性肾脏病中的应用
慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）是指各种原因引起的慢性肾脏结构或功能障碍且病史大于3个月的肾脏疾病。目前，已经成为我国的一个公共卫生问题，其临床主要表现为肾脏病理损伤，血液或尿液成分异常及影像学检查异常，或肾小球率过滤下降［1］。近年来的研究发现，线粒体功能障碍能够通过诱导足细胞的损伤、肾小管上皮细胞的凋亡及促进肾间质纤维化等途径参与 CKD 的进展［2］，因此，有效地保护线粒体功能对于延缓 CKD 的进展有着重要的意义，研究发现，中医药在线粒体功能保护方面显示出了巨大的潜力，本文将就此进行综述。
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Wnt/β-catenin信号途径与肾纤维化的相关研究进展
肾纤维化是各种不同病因的慢性肾脏疾病进行性发展的共同病理改变,是导致终末期肾病的主要病理基础.Wnt/β-catenin信号途径参与了肾纤维化、肾脏发育及肾肿瘤、多囊肾、急性肾衰竭、糖尿病肾病等多种肾脏病的发病.该途径在调控细胞的黏附、迁移、上皮间质转化、生长、分化、凋亡等过程,以及在胚胎发育、器官发生和维持组织器官内环境稳定中具有重要作用[1].近年来研究证实Wnt信号途径与肾纤维化的形成息息相关,在肾间质纤维化的发生发展中发挥重要作用[2].此外,Wnt/β-catenin信号的异常激活诱导了肾小管上皮细胞、肾小球系膜细胞等肾脏固有细胞的增殖或凋亡,导致多种慢性肾脏病的发生与发展.因而Wnt/β-catenin信号途径在肾脏发育与疾病中的作用日益受到重视.深入研究Wnt信号转导通路及其在肾间质纤维化发生发展中的作用,可为抗肾脏纤维化的治疗提供新的可能途径及干预靶点.
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沉默信息调节因子1在肾损害中的研究进展?
沉默信息调节因子1( silent mating type information regula-tion 1,Sirt 1)是一种依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸( NAD+)的去乙酰化酶,是sirtuins家族中重要成员,其靶蛋白包括组蛋白和p53、FoxO、核因子及HIF2等转录因子,在调节核糖体DNA重组、基因沉默、DNA修复和染色体稳定性中起到重要作用。生理情况下,Sirt1在髓质肾小管上皮细胞高表达,并适度表达于皮质肾小管上皮细胞中,进一步研究表明肾脏Sirt1还可在肾小球系膜细胞、足细胞及肾髓间质细胞表达。当肾脏以上细胞过度表达Sirt1时,则提示肾处于氧化应激状态,故可作为保护和维持肾功能的一个指标。本文针对Sirt1的基本生物学功能及其激活剂、抑制剂,重点对Sirt1在肾脏内的生理作用及其病生理影响,以及在急性肾损伤、肾纤维化、肾衰老中的保护作用的新研究进展加以综述。
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24 p3/NGAL介导铁转运通过抑制肾小管上皮细胞凋亡减少急性肾损伤?
目的：阐明24p3/NGAL介导铁转运对急性肾损伤肾小管上皮细胞的保护作用。方法：用分子克隆的方法构建PcDNA3.1/24p3质粒,采用脂质体转染的方法瞬时转染小鼠胚胎成纤维(NIH/3T3)细胞；实时荧光定量PCR及ELISA验证24p3在 NIH/3T3细胞中的表达,以未转染质粒的空白组和转染空载体质粒组作为对照, RT - PCR 检测各组细胞24p3mRNA水平,ELISA检测各组细胞培养上清中24p3水平,收集各组上清液；用氯化钴缺氧诱导小鼠肾小管上皮(TCMK-1)细胞,用收集的NIH/3T3细胞上清液在正常铁离子浓度下培养,流式细胞仪检测各组TCMK-1细胞凋亡情况。结果：转染PcDNA3.1/24p3质粒后的NIH/3T3细胞24p3mRNA和蛋白表达水平明显增加,证实转染成功；与对照组相比,加入重组质粒转染组上清液的TCMK-1组凋亡细胞数量明显减少(P<0.05)。结论：24p3/NGAL介导的铁转运通过抑制肾小管上皮细胞的凋亡,减少急性肾损伤。
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蝉花菌丝对TGF-β1作用下的肾小管上皮细胞α-SMA等蛋白及mRNA表达的影响
目的:探讨蝉花菌丝对TGF-β1作用下肾小管上皮细胞α-SMA、FN、LN、ColⅢ蛋白及mRNA表达的影响.方法:以TGF-β1剌激下的肾小管上皮细胞为研究对象,采用血清药理学研究方法和免疫组化、RT-PCR检测技术,观察空白对照组、TGF-β1对照组、冬虫夏草组、蝉花高剂量组、蝉花中剂量组和蝉花低剂量组的α-SMA、FN、LN、ColⅢ蛋白及mRNA表达,采用SPSS 11.5统计软件统计分析.结果:TGF-β1剌激下的肾小管上皮细胞α-SMA、FN、LN、ColⅢ蛋白及mRNA的表达与正常组比较明显增加(P<0.01);蝉花大、中、小剂量组均能下调肾小管上皮细胞对α-SMA、LN、FN、ColⅢ蛋白及mRNA的表达,与TGF-β1对照组比较差异有统计学意义(P<0.05~0.01),并且大剂量的蝉花菌丝组优于虫草菌丝组(P<0.05);不同剂量的蝉花菌丝组存在量效依赖关系.结论:本研究表明蝉花菌丝通过下调TGF-β1刺激下的肾小管上皮细胞对α-SMA、LN、FN、ColⅢ蛋白及mRNA的异常表达而发挥抗肾间质纤维化的药理作用.
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白细胞介素18对促进肾小管萎缩和间质纤维化的影响
目的:探讨白细胞介素18(IL-18)对肾小管萎缩和间质纤维化的作用.方法:在体外实验中应用不同浓度的IL-18处理人类近端肾小管上皮细胞株(HK-2).应用Hoechst 33258染色法检测细胞凋亡;应用流式细胞技术和免疫组化技术检测细胞表达α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达和细胞形态学的变化.结果:低浓度短时间 IL-18作用对细胞凋亡无影响,而较高浓度IL-18作用可促使肾小管上皮细胞凋亡;IL-18具有显著促进肾小管上皮细胞表达α-SMA作用,并呈剂量和时间依赖关系,而且表达α-SMA的细胞具有肌成纤维细胞的形态学特征.结论:肾病状态下IL-18可能具有促进肾小管萎缩和肾间质纤维化的作用.
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肝细胞生长因子对人肾小管上皮细胞转分化抑制作用初步研究
目的:晚近研究提示肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)具有减轻实验性肾间质纤维化的作用,但其机制尚不十分清楚;本研究目的在于探讨HGF对人肾小管上皮细胞(HKC)转分化的作用.方法:将体外培养的HKC细胞分为:(1)无血清培养对照组;(2)阳性对照组(MCP-1+AAⅠ);(3)HGF组(HGF浓度为0.01,0.1,1.0,10.0 ng/ml);(4)MCP-1+AAⅠ+HGF组(HGF浓度0.1,1.0,10.0 ng/ml).应用间接免疫荧光法检测HKC细胞内α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、波形蛋白、角蛋白表达的变化.应用流式细胞技术检测α-SMA(+)的HKC细胞百分数.结果:不同浓度HGF分别作用于HKC细胞48 h后,经间接免疫荧光法测定该组HKC细胞角蛋白、波形蛋白及α-SMA抗原表达,与无血清对照组均无显著差异;流式细胞术测得HGF组α-SMA表达阳性HKC细胞百分数,与无血清对照组(平均为3.1%)也无显著差异(P＞0.05).MCP-1+AAⅠ培养HKC 48 h后α-SMA(+)的HKC细胞平均百分数为85.6%.MCP-1+AAⅠ+HGF(0.1,1.0,10.0 ng/ml)培养HKC 48 h后,α-SMA(+)的HKC细胞百分数分别为26.7%,2.0%,13.6%,比阳性对照组显著下降(P＜0.05).结论:(1)HGF对正常HKC细胞转分化无明显影响;(2)HGF对某些因素诱导下发生的增强的HKC细胞转分化可能具有显著抑制作用.
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肾康注射液拮抗马兜铃酸对人近端肾小管上皮细胞作用的研究
目的:探讨肾康注射液(SKI)能否拮抗马兜铃酸钠盐(AA-Na)诱发的人近端肾小管上皮细胞(HKC)的促纤维化效应.方法:AA-Na(10mg/L)或不加SKI(8mg/ml)与HKC孵育,然后检测转化生长因子-β1(TGF-β1)、结缔组织生长因子(CTGF)、金属蛋白酶组织抑制物-1(TIMP-1)及纤溶酶原激活物抑制物-1(PAI-1)的mRNA表达(孵育12 h,RT-PCR方法检测)和蛋白质表达(孵育36 h用免疫印迹法检测胞内CTGF,孵育24 h用ELISA法检测上清中其他因子).结果:AA-Na能显著上调HKC对TGF-β1、CTGF、TIMP-1、PAJ-1的表达,与对照组比较,mRNA表达分别上调1.84,1.58,1.62,1.29倍,蛋白质表达分别上调1.12,1.63,1.42,1.29倍,P均<0.05;加SKI后,上述因子的高表达均被显著抑制,与AA-Na组比较,mRNA表达的抑制率分别为41.6%,43.7%,43.8%及24.4%,蛋白质表达的抑制率分别为34.3%,43.3%,31.1%及21.9%,P均<0.05.结论:AA-Na能刺激HKC显著上调促细胞外基质(ECM)合成因子(TGF-β1、CT-GF) 抗ECM降解因子(TIMP-1、PAI-1)的mRNA及蛋白质表达,而SKI能拮抗AA-Na的上述作用.
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不同病理类型肾综患者尿蛋白对肾小管上皮细胞增殖和凋亡相关蛋白Fas表达的影响
目的:观察不同病理类型肾病综合征(NS)患者尿蛋白对肾小管上皮细胞(RTECs)增殖和凋亡的影响,以进一步明确尿蛋白所致肾小管-间质损害的机制.方法:(1)从局灶-节段性肾小球硬化症(FSGS)、膜性肾病(MN)、微小病变肾病(MCN)三种不同病理类型的NS患者尿液中提取尿蛋白,经成份分析、灭菌等处理后以0.5 mg/ml、1.0 mg/ml、2 mg/ml、4 mg/ml、8 mg/ml浓度分别刺激体外培养的HK-2细胞,另设空白对照组.(2)MTT法检测不同病理类型NS患者尿蛋白刺激后细胞的增殖情况.(3)乳酸脱氢酶(LDH)释放实验检测不同病理类型NS患者尿蛋白的细胞毒作用.(4)Western Blotting法检测Fas蛋白表达.结果:各病理类型所提取的尿蛋白成分相同,主要为白蛋白、转铁蛋白、IgG等,但各病理类型组成比例不同;肾小管上皮细胞MTT值低浓度有明显增殖作用,高浓度时细胞过度增殖则导致凋亡;肾小管上皮细胞LDH释放率和Fas蛋白的表达水平随尿蛋白浓度的升高而升高;以上各项检测指标中FSGS患者尿蛋白对HK-2细胞的作用强,MN次之,MCD弱.结论:在体外条件下,尿蛋白对RTECs呈剂量依赖性的细胞毒作用,低剂量尿蛋白诱导RTECs异常增殖,较高剂量尿蛋白可诱导RTECs凋亡;除尿蛋白的量决定了损伤严重程度外,尿蛋白的性质也决定了损伤的严重程度.
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TLR4介导大鼠肾脏缺氧复氧炎症反应依赖于MyD88
目的:探讨MyD88是否参与了TLR介导大鼠肾脏缺氧复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)引起的炎症反应.方法:体外分离获得Wistar大鼠原代肾小管上皮细胞(proximal tubule epithelial cells,PTECs),建立H/R模型.采用TLR4siRNA干扰PTECs,检测白细胞介素8(interleukin-8,IL-8)和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)的表达.之后,加入髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)的抑制剂ST2825后,检测IL-8和TNF-α的表达.结果:TLR4表达沉默后,IL-8、TNF-α和MyD88的表达均显著下降(P<0.05);加入ST2825后,IL-8、TNF-α和MyD88的表达均显著下降(P<0.05),且抑制MyD88活性后显著降低细胞的凋亡水平(P<0.05).结论:MyD88参与了TLR4介导的大鼠肾脏缺氧复氧引起的炎症反应.
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促红细胞生成素对马兜铃酸致肾小管上皮细胞损伤保护作用的初步观察
目的:探讨促红细胞生成素(EPO)对马兜铃酸(AA)刺激后肾小管上皮细胞再生的影响.方法:以5、10、20 μg/ml AA刺激LLC-PK1细胞株,同时培养体系中加入不同浓度的EPO(5、10、20 U/ml),另设对照组.各组细胞培养24 h后,TUNEL法原位检测细胞凋亡情况,免疫组化检测细胞PCNA的表达.结果:TUNEL结果表明,经AA 5 μg/ml刺激后,核染色阳性的细胞百分比与对照组比较无明显差异,而AA 10 μg/ml、20 μg/ml刺激后,核染色阳性的细胞百分比与对照组比较明显增加(P＜0.05);经EPO干预后,EPO 10 U/ml和EPO 20 U/ml可明显降低AA 10 μg/ml组阳性细胞的百分比(P＜0.05).免疫组化显示:经AA 5 μg/ml刺激后,细胞核PCNA阳性表达增加,而经AA 10 μg/ml、20 μg/ml刺激后,细胞核PCNA阳性表达逐渐减弱;加入不同剂量的EPO后,AA 10 μg/ml组PCNA阳性细胞均增多(P＜0.05).结论:EPO可抑制AA诱导的肾小管上皮细胞凋亡、并促进细胞的再生,这可能是EPO对马兜铃酸致肾小管上皮细胞损伤的保护机制之一,其作用机制有待进一步深入研究.
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丹参对马兜铃酸致肾小管上皮细胞损害的保护作用研究
目的:探讨丹参对马兜铃酸(aristolochic acid,AA)所致肾小管上皮细胞损害的保护作用.方法:以95%DMEM培养液加5%小牛血清培养肾小管上皮细胞株(NRK-52E),加入不同浓度的丹参和马兜铃酸,采用MTT法来观察肾小管上皮细胞存活以及生长的状况;用碘化丙啶(PI)染色方法确认细胞凋亡的发生.结果:马兜铃酸浓度超过10 mg/ml时肾小管上皮细胞的活力显著抑制(P＜0.05).以丹参3.0、15、30、60 mg/ml处理后的肾小管上皮细胞再加入AA(10 mg/ml浓度),则肾小管上皮细胞的活力明显增加,且随着丹参浓度的增加其作用愈趋明显(P＜0.01),丹参明显抑制AA所造成肾小管上皮细胞的凋亡(P＜0.01).结论:丹参(3.0、15、30、60 mg/ml)通过减少马兜铃酸致肾小管上皮细胞的凋亡,可明显保护肾小管上皮细胞,且其作用随着丹参浓度的增加而加强.
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NAC对缺氧复氧后肾小管上皮细胞凋亡的干预作用
目的:研究缺氧复氧后肾小管上皮细胞凋亡的表达及N-乙酰半胱胺酸(NAC)对其的影响.方法:选用人肾小管上皮细胞(HK2)建立缺氧复氧损伤模型,设正常对照组、单纯缺氧复氧组、不同浓度(1 mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L)NAC干预组.流式细胞术检测细胞内氧化应激水平与细胞凋亡表达.结果:缺氧复氧后HK2细胞内氧化应激水平提高,HK2细胞凋亡细胞和死亡细胞数量增多,且随缺氧时间的延长,细胞内氧化应激水平逐渐升高,凋亡细胞和死亡细胞数量逐渐增多;NAC呈剂量关系抑制细胞内氧化应激水平,同时呈剂量关系减少凋亡细胞和坏死细胞的数量.结论:缺氧复氧诱导细胞内氧化应激的产生,诱导HK2细胞凋亡和死亡;NAC可以通过抑制细胞内氧化应激减少细胞和坏死细胞的数量.
关键词： 肾小管上皮细胞 缺氧复氧 细胞凋亡N-乙酰半胱胺酸(NAC) -
青藤碱对肾小管上皮细胞转分化相关基因表达的影响
目的:探讨青藤碱干预炎症介质诱导的肾小管上皮细胞转分化及其相关基因的表达作用.方法:IL-1β(10 ng/ml)诱导体外培养的小鼠肾小管上皮细胞株(MCT),同时用青藤碱(10 μmol/L、100μmol/L、500μmol/L和1000μmol/L)进行干预.应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)分别测定细胞平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、转化生长因子β(TGF-β)和纤连蛋白(Fn)的基因表达.结果:结果:IL-1β能够显著诱导肾小管上皮细胞α-SMA的基因表达上调,同时伴随着TGF β和Fn的基因表达显著上调;而青藤碱各个浓度均具有显著抑制肾小管上皮细胞转分化作用,TGF-β和Fn的基因表达也随之下调.结论:青藤碱可显著抑制IL-1β刺激下的肾小管上皮细胞转分化标志物和细胞外基质的基因表达,其机制可能与部分下调TGF-β的表达有关.
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制大黄-川芎药对对造影剂肾病大鼠肾小管上皮细胞凋亡的影响
目的:探讨制大黄-川芎药对对造影剂肾病(CIN)大鼠肾小管上皮细胞凋亡的影响及机制.方法:将32只雄性SD大鼠分为正常组(A组)、模型组(B组)、药对高剂量组(C组)、药对低剂量组(D组).C、D组于造模前7天每日灌胃药对水煎液,灌胃量分别为成人标准体重(60kg)常规用量50、20倍.造模后24h处死动物,测定血清肌酐、尿素氮,HE染色观察肾脏病理改变,TUNEL染色检测肾小管上皮细胞凋亡,western印迹检测肾组织Caspase-3表达.结果:建模后24h与A组相比,B组血清肌酐、尿素氮均明显升高(P<0.01);病理形态学检测提示模型大鼠发生明显肾间质水肿、肾小管上皮细胞胞浆空泡样变、肾小管上皮细胞凋亡(P<0.01),Caspase-3蛋白表达显著增多(P<0.01).与B组相比,C、D组血清肌酐、尿素氮明显回落(P分别<0.01or<0.05),肾脏病理改变显著为轻,肾小管上皮细胞凋亡指数显著减少(P<0.01),Caspase-3蛋白表达明显降低(P<0.01).结论:caspase3依赖的肾小管上皮细胞凋亡参与了大鼠造影剂肾病的发生,制大黄-川芎药对能通过抑制caspase3抑制肾小管上皮细胞凋亡,并进而保护CIN大鼠肾功能.
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Lck反义RNA重组腺病毒载体的构建及其对肾小管上皮细胞Lck表达的影响
目的:观察淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(Lck)在肾小管上皮细胞中的表达及Lck反义RNA对其表达的影响.方法:采用RT-PCR方法从肾小管上皮细胞中获得Lck目的基因片段,将目的基因片段反向插入pDC 316质粒中,构建Lck反义RNA穿梭质粒(pDC 316-antisenseLck),经PCR、酶切及测序鉴定正确后,将此穿梭质粒与辅助质粒pBHGloxΔE1,3Cre 共转染HEK 293细胞,重组产生Lck基因反义RNA腺病毒载体(Ad-antisenseLck).用此重组腺病毒感染体外培养的肾小管上皮细胞,Western blotting方法观测此重组腺病毒载体对IL-2诱导的Lck蛋白表达的影响.结果:构建出Lck反义RNA重组腺病毒载体,此重组腺病毒载体感染培养的肾小管上皮细胞后可明显抑制IL-2诱导的Lck蛋白表达(P<0.05),抑制率可达47%.结论:成功构建出Lck反义RNA重组腺病毒载体,此载体可在肾小管上皮细胞内发挥生物学作用,显著阻抑肾小管上皮细胞的Lck蛋白表达.
关键词： 淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶 肾小管上皮细胞 反义RNA 重组腺病毒 -
丹参注射液对造影剂诱导的肾小管上皮细胞损伤的保护作用
目的:研究丹参注射液对造影剂碘海醇诱导的肾小管上皮细胞损伤的保护作用并对其作用机制进行探讨.方法:体外培养的人肾小管上皮细胞(HK-2细胞),分为正常对照组、甘露醇对照组(与碘海醇渗透压相当)、造影剂对照组(碘海醇100 mg/ml)、丹参防治组(碘海醇100 mg/ml+丹参注射液15 mg/ml).比色法测定细胞培养上清液LDH水平,MTT法测定细胞增殖活力,DCFH-DA荧光探针测定细胞内活性氧(ROS),硫代巴比妥酸法测定细胞内MDA含量,黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性,RT-PCR测定细胞内血红素加氧酶-1(HO-1)mRNA表达,Western blot检测细胞内HO-1蛋白表达.结果:碘海醇100 mg/ml可明显抑制HK-2细胞增殖、引起培养液中LDH水平上升、促使细胞内ROS和MDA含量增高而细胞内SOD活性下降,同时碘海醇可诱导HO-1 mRNA和蛋白表达上调.加入丹参可明显降低培养液中LDH水平,促进细胞增殖,同时抑制细胞内ROS的产生,降低细胞内MDA含量,保护细胞内SOD活性,并使HO-1mRNA和蛋白表达进一步增强.结论:丹参对造影剂碘海醇所致肾小管上皮细胞具有明显的保护作用,其作用机制与其抗氧化能力及诱导HO-1表达有关.
