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HPLC波长切换法同时测定清清颗粒中9个成分的含量
目的:建立HPLC波长切换法同时测定清清颗粒中9个活性成分(白芍苷、芍药苷、甘草苷、甘草酸、小檗碱、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素)的含量.方法:采用Promosil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),以乙腈(A)-0.1％磷酸水溶液(B)为流动相,梯度洗脱(0 ～ 10 min,18％ A→23％A;10 ～ 20 min,23％A→30％A;20 ～ 35 min,30％A→48％A;35 ～ 40 min,48％A→1 8％A),流速1.0mL·min-1,柱温30℃,变换波长检测(230 nm,白芍苷、芍药苷;237 nm,甘草苷、甘草酸;345 nm,小檗碱;280 nm,黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素).结果:白芍苷、芍药苷、甘草苷、甘草酸、小檗碱、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素9个成分的线性范围分别为0.007 ～0.14 μg(r =0.999 6)、0.011 ～0.22μg(r =0.999 9)、0.011 2 ～0.224 μg(r=0.999 6)、0.030 6 ～0.612μg(r =0.999 9)、0.002 4 ～0.048 μg(r =0.999 8)、0.107 2～2.144 μg(r =0.999 9)、0.017 9 ～0.358 μg(r =0.999 9)、0.005 12 ～0.102 4μg(r=0.999 9)、0.002 7～0.054 μg(r =0.999 6);平均加样回收率(n=6)为95.7％～101.0％.3批样品中上述9个成分的含量分别为0.289 ～ 0.312、0.515 ～ 0.539、1.031～1.047、2.494～2.518、1.960 ～2.020、9.970 ～10.02、2.190 ～2.300、0.559～0.570、0.609 ～0.612 mg·g-1.结论:本文建立的方法符合方法学验证要求,可用于清清颗粒的9个指标性成分的同时测定.
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HPLC法测定黄连、黄芩药对提取物中11个成分的含量
目的:建立高效液相色谱法测定黄连、黄芩药对提取物中11个成分(药根碱、表小檗碱、黄连碱、巴马汀、小檗碱、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、白杨素、千层纸素A)的含量.方法:采用Phenomoil 5μ C18 BDS(250 mm×4.6 mm,5μm)色谱柱,流动相为乙腈-水(37:63,内含磷酸二氢钾0.3400 g,十二烷基硫酸钠0.1700 g,磷酸调pH约为4),流速1.0 mL·min-1,检测波长349 nm,柱温30℃,对药对中黄连进行测定;采用Agilent ZORBAX SB-C1s(250 mm ×4.6 mm,5 μm)色谱柱,以乙腈(A)-0.3％磷酸三乙胺(B)水溶液为流动相,梯度洗脱,流速1.0 mL· min-1,检测波长为275 nm,柱温30℃,对药对中黄芩进行测定.结果:药根碱、表小檗碱、黄连碱、巴马汀、小檗碱、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、白杨素、千层纸素A进样量分别在0.015～0.15 μg(r =0.9997)、0.033～0.33 μg(r =0.9993)、0.17～1.7 μg(r=0.9991)、0.079 ～0.79μμg(r =0.9991)、0.31 ～3.1 μg(r=0.9991)、0.42～4.2 μg(r =0.9992)、0.078 ～ 0.78 μg(r =0.9995)、0.053 ～0.53 μg(r =0.9993)、0.016～0.16μg(r =0.9993)、1.2×10-3 ～0.012 μg(r =0.9991)、0.010～0.10g(r =0.9994)范围内呈良好线性关系;平均回收率(n=5)分别为100.1％、97.7％、97.6％、102.2％、99.4％、99.3％、99.9％、99.8％、101.1％、101.1％、100.3％,RSD分别为2.1％、1.1％、1.2％、0.9％、1.2％、1.8％、1.8％、2.2％、2.0％、1.9％、2.3％.结论:该方法为黄芩、黄连药对提取物的质量综合评价提供了科学依据.
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荧光探针测定雷尼替丁、尼扎替丁和西咪替丁
目的:建立一种测定雷尼替丁、尼扎替丁和西咪替丁3种H2组胺受体药物的高灵敏度的荧光探针新方法.方法:本方法是基于小檗碱和葫芦[7]脲生成稳定的包合物并使其荧光强度显著增强,当加入3种药物中的任何一种均能使葫芦[7]脲/小檗碱包合物的荧光显著猝灭.据此建立了一种以小檗碱为荧光探针测定3种H2组胺受体药物的新方法.结果:药物在一定的浓度范围内与其相应的荧光猝灭值△F之间呈良好的线性关系,雷尼替丁、尼扎替丁和西咪替丁检测限分别为0.007,0.007,0.020μg·mL-1,比一般的光谱方法高2个数量级.同时对药物制剂和加标尿样进行测定,获得了满意的回收率.结论:该方法可用于药物制剂和生物体液中上述3种H2组胺受体药物的测定.
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黄连4种饮片特征图谱研究及生物碱含量测定
目的:建立黄连4种不同炮制品的特征图谱,探讨饮片炮制前后化学成分的变化规律,并采用HPLC法对其中木兰碱、药根碱、黄连碱、巴马汀、小檗碱5个生物碱类成分进行定量分析比较.方法:采用Kromasil-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm)；流动相乙腈-50 mmol·L-磷酸二氢钾溶液(磷酸调pH 3.0)(45∶55),内含十二烷基硫酸钠12.5 mmol·L-1；检测波长275 nm；流速1 mL·min-1；柱温为30℃；进样量10μL.结果:所建立的特征图谱信息丰富,5个生物碱成分在测定范围内线性关系较好(r ＞0.9994),平均回收率分别为102.8％,96.9％,98.4％,104.8％,103.7％.结论:初步实验表明,黄连不同炮制品的特征图谱有所差别,相关成分在炮制前后发生了量变和质变,并呈现一定的变化规律.
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明目上清丸质量标准改进
目的:对明目上清丸(大黄、黄连、栀子、赤芍、当归和黄芩)的质量标准进行改进.方法:采用TLC法鉴别处方中的栀子、赤芍、当归、黄芩和黄连;采用HPLC法,以甲醇-0.2％磷酸水溶液为流动相,梯度洗脱的方法测定大黄中大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚,以乙腈-0.04 mol· L-1磷酸二氢钾溶液为流动相,测定黄连中巴马汀和小檗碱.结果:薄层色谱中特征性斑点明显,分离度好,阴性对照无干扰;大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚分别在6.5～162.8 ng(r=1.000 0)、12.4～311.0 ng(r=1.000 0)、13.8～345.4ng(r=1.000 0)、3.2～80.8 ng(r=0.999 8)范围内与峰面积均呈良好的线性关系;平均回收率(n=9)分别为97.0％、98.0％、100.2％和101.4％,RSD分别为1.2％、1.2％、1.4％和1.5％;盐酸巴马汀和盐酸小檗碱分别在13.1～326.4 ng(r=0.999 9)和42.8～1 070.0 ng(r=0.999 9)范围内与峰面积均呈良好的线性关系,平均回收率(n=9)分别为101.9％和97.6％.样品中大黄酸、大黄素及大黄酚的含量测定总和为0.23～0.84 mg·g-1,大黄酸、巴马汀和小檗碱(以盐酸巴马汀和盐酸小檗碱计)的含量测定结果分别为0.027～0.259、0.591～0.896和2.57～3.90 mg· g-1.结论:鉴别方法专属性强、灵敏度高;定量方法简便快速,结果准确且重复性好.经方法学验证,本法可作为明目上清丸的质量控制方法.
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UPLC-MS/MS法测定中成药及保健品中添加的16种降糖类化学药物
目的:建立快速、准确检测中成药及保健品中非法添加的16种降糖类化学药物的方法.方法:采用UPLC-MS/MS法,使用Waters Acquity BEH-C18(1.7 μm,2.1 mm ×50 mm),以0.1％甲酸甲醇溶液(A)-0.1％甲酸水溶液(B)为流动相,梯度洗脱(0 ～3 min,32％A→50％A;3 ～6 min,50％ A→60％ A;6 ～9 min,60％A→70％A;9 ～ 11 min,70％A→90％A;11 ～ 12 min,90％A→90％A;12～13 min,90％A→32％A);流速:0.2 mL·min-1;柱温:40℃;选择ESI离子源、正离子扫描、多反应离子监测(MRM)模式测定16种降糖类化学药物.通过比较MRM通道中样品峰与对照品峰的分子离子峰,二级碎片离子峰、色谱保留时间等信息确定添加的化学药物,并根据外标法以质谱峰面积计算添加药物的准确量.结果:在上述色谱及质谱条件下,二甲双胍、丁二胍、苯乙双胍、罗格列酮、小檗碱、吡格列酮、氯磺丙脲、甲苯磺丁脲、妥拉磺脲、格列吡嗪、格列齐特、瑞格列奈、格列苯脲、格列美脲、那格列奈、格列喹酮等16种药物的分离度良好,方法定量下限(LOQ)均在0.2～1.5 ng· mL-1之间,标准加样回收率均在88.6％ ～ 116.9％之间.结论:本法快速准确,灵敏度高,可作为中成药及保健品中非法添加降糖类化学药物的定量测定方法.
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保健食品中添加小檗碱的检测方法研究
目的:建立降糖类保健食品中非法添加小檗碱的检测及含量测定方法.方法:采用薄层色谱法,以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(15∶7∶1∶1)为展开剂,置紫外光灯(365 nm)下检视;采用高效液相色谱法,使用Kromasil C18色谱柱(4.6 mm ×250 mm,5μm),以甲醇-离子对溶液(庚烷磺酸钠0.5056 g,加三乙胺1.4 mL,加水至1000 mL,用磷酸调pH至3.5±0.05)(60:40)为流动相,流速0.8 mL·min-1,检测波长为348 nm;液相色谱-质谱联用法采用电喷雾电离,正离子检测模式进行检测,一级全扫描及二级选择离子扫描.结果:薄层色谱鉴别,青藤碱在365 nm下斑点清晰,Rf值适中;液相色谱法测定,小檗碱浓度在3.435 ～ 69.70 μg·mL-1范围内线性关系良好(r=0.9998),平均加样回收率在101.2％,能够满足日常检验筛查的要求.结论:本研究建立的方法选择性强,灵敏度高,可用于检测保健食品中非法添加的小檗碱.
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LC-MS/MS同时测定一清胶囊9个成分的含量
目的:建立运用液相色谱-串联质谱法同时测定一清胶囊中9个成分(黄芩苷、汉黄芩苷、黄连碱、药根碱、巴马汀、小檗碱、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚)含量的分析方法.方法:采用Agilent SB-C18色谱柱(2.1 mm×50mm,1.8μm),以水-甲醇为流动相,梯度洗脱(0～4.5 min,20％B→70％B;4.5 ～8 min,70％B→95％B;8～8.5 min,95％B→20％B),流速0.3 mL·min-1,柱温为室温;采用电喷雾离子源(ESI),动态多反应监测扫描模式(DynamicMRM)进行定量分析,干燥气温度350℃,干燥气流量10 L·min-1,雾化器压力275.8 kPa,毛细管电压4 kV.结果:黄芩苷、汉黄芩苷、黄连碱、药根碱、巴马汀、小檗碱、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的质量浓度分别在2.712～27.12μg· mL-1(r=0.9989)、0.8800 ～8.800 μg·mL-1(r =0.9991)、0.5280～5.280 μg·mL-1(r=0.9982)、0.1272～1.272 μg·mL-1(r =0.9977)、0.3024～3.024 μg·mL-1(r=0.9979)、1.196～11.96 μg·mL-1(r =0.9995)、33.28～ 332.8 ng·mL-1(r=0.9988)、32.40～324.0 ng·mL-1(r=0.9974)、8.800 ～88.00 ng·mL-1(r=0.9977);平均加样回收率(n=6)均在97.5％ ～ 101.9％范围内,RSD均小于2.4％.结论:该分析方法特异、快速、灵敏,重复性好,可为一清胶囊的质量控制提供依据.
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RP-HPLC法同时测定芎菊上清丸中绿原酸、盐酸小檗碱和黄芩苷的含量
目的:建立RP-HPLC法同时测定芎菊上清丸中绿原酸、盐酸小檗碱和黄芩苷的含量.方法:采用DIKMA Platisil ODS色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),柱温30℃,以甲醇(A)-0.1％磷酸水溶液(B)为流动相,梯度洗脱(0～5 min,40％A;5 ～20 min,40％ A→60％A;20 ～ 30 min,60％A),流速1 mL·min-1,变换波长检测(327 nm,绿原酸;345 nm,小檗碱;278 nm,黄芩苷).结果:绿原酸、盐酸小檗碱和黄芩苷的线性范围分别为0.11 ～2.2 μg(r =0.9997)、0.021 ～0.42 μg(r =0.9999)、0.03 ～0.6 μg(r =0.9998),平均回收率在98.45％和99.07％之间.结论:该法检测效率高,专属性强,重复性好,可用于芎菊上清丸中绿原酸、盐酸小檗碱和黄芩苷的含量测定及其质量控制.
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UPLC-MS/MS法研究小檗碱、巴马汀和药根碱在大鼠体内的组织分布
目的:建立UPLC-MS/MS同时测定大鼠组织中小檗碱、巴马汀和药根碱3个生物碱成分的分析方法,并应用于这3个成分在大鼠体内的组织分布研究.方法:采用BEH C18色谱柱(2.1 mm× 50 mm,1.7μm),以乙腈-0.1％甲酸水溶液(20∶80)为流动相,流速0.3 mL· min-1,正离子多离子反应监测(MRM)检测.组织样品匀浆后乙腈沉淀蛋白供测定.结果:在线性范围内3个成分的线性关系良好,准确度、日内和日间精密度、稳定性、提取回收率均符合生物样品的分析要求.3个生物碱成分在大鼠体内分布广泛,胃、小肠和肝组织中浓度较高,在心脏中的分布浓度低.结论:本文方法可用于黄连提取物在大鼠体内的组织分布研究.
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介质环境对小檗碱荧光光谱影响的研究
目的:探讨介质环境对小檗碱荧光光谱性质的影响.方法:配制在不同溶剂及pH条件下的2×10-5 mol·L-1小檗碱溶液,测定其荧光光谱.结果:随着溶剂极性的降低,其荧光发射光谱紫移并且荧光强度显著提高.但在不同的pH条件下,荧光光谱几乎不变.结论:小檗碱所具有的特殊荧光性质,可作为生物荧光探针的优选试剂.
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黄连愈伤组织的诱导及小檗碱和药根碱的含量测定
不同生长季节的黄连外植体在一系列培养基上诱导产生愈伤组织.经高效液相色谱法测定愈伤组织内小檗碱和药根碱的含量.结果表明,幼叶柄外植体在67-V 0.5mg/L 2,4-D上产生的愈伤组织的小檗碱和药根碱含量明显高于对照组.花苔外植体在67-V 0.5mg/L 2,4-D上诱导的愈伤组织小檗碱含量高于对照组.
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吉林省不同产地关黄柏药材质量的灰色关联度法综合评价
目的:建立吉林省不同产地关黄柏药材的质量评价方法并为药材道地性选择提供参考依据.方法:根据《中华人民共和国药典》2015年版关黄柏常规检测内容与方法,对吉林省不同产地关黄柏药材的水分、总灰分、浸出物和小檗碱、巴马汀的含量进行测定,并采用灰色关联度分析法,以相对关联度为测度,构建灰色关联质量评价模型.结果:不同产地关黄柏药材相对关联度值的范围为[0.420 2,0.566 2],说明各产地关黄柏的质量存在一定差异,药材质量优劣次序为龙井＞图们＞九台＞永吉＞柳河＞磐石＞公主岭.结论:灰色关联度分析法综合评价可以为吉林省不同产地关黄柏药材的质量评价提供参考依据;结果提示吉林省龙井产关黄柏为优势特色药材.
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黄连配伍肉桂对小檗碱大鼠肝代谢的影响及其机制探讨
目的:考察大鼠经口给予黄连配伍肉桂的制剂后对小檗碱肝脏代谢的影响及其肝药酶的变化,探讨黄连-肉桂药对的配伍机制.方法:以HPLC法测定大鼠肝微粒体温孵体系中小檗碱的含量,考察小檗碱在肉桂、黄连和黄连-肉桂(10∶1)诱导组及溶媒对照组大鼠肝微粒体系中的代谢变化;采用Nash显色,分光光度法测定空白组、黄连组、肉桂组和黄连肉桂配伍(10∶1)组大鼠肝微粒体中红霉素N-脱甲基酶(ERD)活性.结果:与空白对照组相比,小檗碱在各给药组大鼠肝微粒体温孵液中的代谢速率均有显著下降(P＜0.001),各组代谢速率从小到大的顺序为黄连-肉桂配伍组,肉桂组,黄连组,空白对照组.与空白组比较,肉桂组和黄连-肉桂配伍组ERD活性均明显受到抑制(P＜0.01);黄连组对ERD活性作用不明显(P＞0.05).结论:黄连-肉桂配伍合用通过抑制大鼠肝药酶ERD活性降低黄连主要有效成分小檗碱的肝脏代谢,这可能是黄连-肉桂配伍相互作用的重要机制.
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2D-HPLC结合捕集柱同时测定黄连药材中6个生物碱
目的:建立二维高效液相色谱法(2D-HPLC)结合捕集柱同时测定黄连药材中非洲防己碱、药根碱、表小檗碱、黄连碱、巴马汀和小檗碱的含量.方法:第一维液相色谱系统色谱柱为Kromasil-C18(100 mm ×4.6 mm,5μm),流动相为100 mmol·L-1磷酸二氢铵溶液(pH为5.30)-乙腈(50∶50);第二维液相色谱系统色谱柱为Ultimate XB-Phenyl柱(250 mm×4.6 mm,5μm),以100 mmol·L-1磷酸二氢铵溶液(用磷酸调节pH为3.30)(A)-乙腈(B)为流动相进行梯度洗脱(1～2 min,36％B→30％B;2～10 min,30％B→34％B;10 ～ 16 min,34％ B→64％B).采用“中心切割”模式及捕集柱转移目标物,检测波长345nm,柱温40 c℃.结果:不同产地黄连药材中非洲防己碱、药根碱、表小檗碱、黄连碱、巴马汀和小檗碱在19 min内完成分析,含量分别为3.8 ～4.4、3.3 ～4.0、10.1 ～ 11.2、18.9 ～ 20.8、14.4 ～ 16.6、55.6～61.3 mg·g-1.6个生物碱的平均回收率为95.5％～104.2％,RSD为0.23％ ～ 1.4％.结论:该方法能同时测定黄连药材中非洲防己碱、药根碱、表小檗碱、黄连碱、巴马汀和小檗碱的含量,可用于黄连药材的质量评价.
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健康志愿者口服盐酸小檗碱后尿中三个硫酸结合型代谢产物的鉴定
目的:分离和鉴定健康志愿者口服盐酸小檗碱后尿中的未知代谢产物.方法:用大孔树酯柱层析方法分离和纯化代谢产物,电喷雾-离子化质谱(ESI-MS)及1H核磁共振(1H NMR)进行结构分析.结果:三个未知代谢产物(M1,M2和M3)被分离纯化,它们均对芳基硫酸酯酶敏感.电喷雾质谱中分别可见准分子离子峰[M+H]+417.9,404.0和402.0,以及脱SO3片段的特征离子峰[M-80+H]+.测得各自的1H NMR谱,参考盐酸小檗碱的质子信号,确定了M1,M2和M3的质子信号归所及取代基的位置.结论:M1,M2和M3的结构可分别推定为药根碱-3-硫酸酯(M1)、脱亚甲基小檗碱-2-硫酸酯(M2)和Thalifendine-l0-硫酸酯(M3).其中M2为主要代谢产物.
关键词： 小檗碱 生物转化 代谢 活质分子核磁共振 电子喷雾离子化质量光谱法 -
小檗碱对心肌细胞IK1、IK及HERG通道的抑制作用
目的:研究小檗碱(Ber)对豚鼠心室肌细胞钾通道和动作电位作用,以及在蛙卵中表达的人的HERG通道的作用.方法:酶解方法分离单个心肌细胞,采用全细胞膜片箝方法记录钾离子电流及动作电位,基因箝技术研究HERG通道电流.结果:Ber可显著延长动作电位时程,并呈剂量依赖性.Ber 100μmol/L使APD90由对照的(450±48)ms延长至(888±90)ms(n=6,P＜0.01).Ber对IK1及IK呈剂量依赖性抑制作用.Ber100μmol/L对IK1的抑制率达65%±7%(n=6,P＜0.01).Ber50μmol/L对IK的抑制率达57%±6%;对IKtail的抑制率达53%±6%.Ber对IK作用呈现电压依赖性.Ber对在蛙卵中表达的HERG通道具有很强的阻断作用,IC50为75μmol/L,此阻断作用也呈电压依赖性.结论:Ber可使动作电位时程明显延长,对IK1及IK具有阻断作用.Ber可显著抑制HERG通道.Ber抗心律失常的机制与其抑制IK1、IK及HERG通道密切相关.
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黄连素在心血管疾病治疗中的应用研究
黄连素又名小檗碱,是从黄连、黄柏、三颗针、唐松草等植物中提取的生物碱,也可人工合成,为广谱抗生素,抗菌作用较强,临床多用于清热解毒及抗肠道细菌感染.目前,黄连素的临床应用范围逐渐扩展,如其能增加心肌收缩力,改善心肌供血,改善心功能[1-2],抗心律失常,调脂,降压[3]等.现将黄连素在心血管疾病治疗中的临床应用研究综述如下.
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小檗碱诱导耐药急性淋巴细胞白血病细胞株EU-4凋亡及其机制
目的 探讨小檗碱对耐药急性淋巴细胞白血病细胞株EU-4的凋亡诱导作用及其机制.方法 0、10、1 00 μmol／L小檗碱作用EU-4细胞72 h,采用流式细胞术检测细胞凋亡,免疫印迹法检测Caspase-3、PARP及X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)的蛋白表达,比色法检测Caspase-3的活性变化,基因沉默技术观察降低XIAP表达对于细胞凋亡的影响.结果 0、10、100μmol／L小檗碱作用EU-4细胞72 h后凋亡率分别为(9.08±1.20)％、(22.36±2.16)％、(59.81±4.17)％,呈剂量-效应关系.凋亡过程中Caspase-3的活性增强,分别为1.70±0.25、1.92±0.10、2.89±0.25.小檗碱抑制EU-4细胞XIAP的表达(P＜0.05),并呈剂量和时间依赖关系.单纯下调XIAP蛋白的表达引起细胞凋亡,对照siRNA转染组和XIAP siRNA转染组细胞凋亡率分别为(9.23±1.66)％和(22.15±0.63)％.结论 小檗碱可以诱导急性淋巴细胞白血病EU-4细胞凋亡,XIAP下调引起的Caspase-3的激活参与了EU-4细胞的凋亡.
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小檗碱诱导白血病Molt-4细胞株凋亡及对NF-κB/p65、Caspase-3表达的影响
[目的] 研究小檗碱对急性T淋巴细胞白血病细胞株Molt-4增殖的抑制作用及其机制探讨.[方法] 将0、10、100 μg/ml小檗碱作用于Molt-4细胞后,经细胞形态学观察、流式细胞术、DNA凝胶电泳检测细胞凋亡情况,用免疫印迹法检测NF-κB及Caspase-3的表达.[结果] 小檗碱作用于Molt-4细胞后,光镜下可见形成凋亡小体,流式细胞术可见存在G2/M期增加和S期减少,DNA凝胶电泳出现典型的DNA梯形条带.Western blot法检测发现部分Caspase-3酶原被激活,而细胞核中p65表达降低.[结论] 小檗碱可导致白血病细胞Molt-4细胞凋亡,而NF-κB、Caspase-3可能参与了Molt-4细胞凋亡的调控.
关键词： 小檗碱 白血病 细胞凋亡 NF-κB 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3
