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携带幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白活减毒鼠伤寒沙门菌口服重组DNA疫苗株的构建
目的:构建携带人幽门螺杆菌(Hpylori)中性粒细胞激活蛋白HP-NAP)基因(napA)的重组活减毒鼠伤寒沙门菌口服DNA疫苗.方法:应用基因工程技术扩增全长napA,测序并同源性分析后,将其亚克隆入真核表达载体pIRES,鉴定正确后将重组质粒转化活减毒鼠伤寒沙门菌.结果:重组质粒经PCR及双酶切,证实成功构建了携带HP-NAP基因的重组真核表达质粒pIRES-napA,后者成功转化活减毒鼠伤寒沙门菌SL7207.所克隆435bp napA与GenBank中SS1-napA核苷酸和蛋白质的同源性均为98%.结论:成功构建并鉴定了携带HP-NAP基因的重组活减毒鼠伤寒沙门菌口服DNA疫苗,为多价抗Hpylori口服DNA疫苗的研制奠定了基础.
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溶血磷脂酸受体基因在大鼠心肌细胞的表达分析及3型受体亚型的克隆鉴定
目的 确定5种亚型溶血磷脂酸受体(LPAR)基因在大鼠心肌细胞中的表达,针对主要分布亚型LPAR3基因构建重组质粒.方法 利用实时荧光定量PCR和Western Blot检测LPA受体亚型在原代培养乳鼠心肌细胞的表达量;克隆LPAR3基因的编码区全序列,构建重组质粒.结果 在5种LPAR亚型中,LPAR3在心肌细胞中的表达高,其次为LPAR1,LPAR4和LPAR5在心肌细胞中的表达较低,而LPAR2则未检测到;Western Blot检测显示LPAR3的表达明显高于LPAR1的表达.对LPAR3基因进行序列分析,结果显示GenBank中序列号为NM_023969.1的序列与其它物种的该序列比较,缺失了一段保守的碱基片段;根据另一条序列(AB051164.1)设计引物,成功扩增LPAR3全基因片段,构建重组质粒.结论 LPAR3是大鼠心肌细胞中主要的溶血磷脂受体亚型; GenBank中序列号为NM_023969.1的LPAR3基因序列存在碱基缺失,大鼠中编码LPAR3的正确序列为AB051164.1.
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重组人白细胞介素24对肺癌A549细胞生长和肿瘤血管生成影响的实验研究
白细胞介素24(IL-24)即黑色素瘤分化相关基因7(mda-7),除具有免疫刺激应答功能外,还有抑制肿瘤细胞生长、促进其凋亡和抑制肿瘤血管生成的作用,被认为是一种新的抑癌基因.本研究观察了pET-21a-IL-24重组质粒表达系统的表达产物--部分纯化人重组IL-24(rhIL-24)蛋白,在体内外对肺癌A549细胞、瘤体生长的抑制作用和抗肿瘤血管生成作用.
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Wnt5a对非小细胞肺癌细胞侵袭能力的影响
Wnt5a是Wnt家族中的重要成员之一[1,2],在肺的发育及其分化过程中起着重要作用[3],并可能参与非小细胞肺癌(non-small cell-lung cancer,NSCLC)的发生与发展[4].我们通过构建Wnt5a基因正义及RNAi重组质粒并将其导入NSCLC细胞株H157和A549,观察Wnt5a基因表达的变化对NSCLC细胞侵袭及迁移等行为的影响,探讨Wnt5a在NSCLC发生与发展中的作用及机制.
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口服接种乙型肝炎病毒核酸疫苗诱生小鼠体液免疫应答的初步研究
接种乙型肝炎疫苗(乙肝疫苗)是控制乙型肝炎病毒感染的根本措施.近年来正在大力研制核酸疫苗,以补充现行乙肝疫苗的不足并开发用于治疗性疫苗[1].但一般疫苗多为注射方式接种,给被接种者带来疼痛与不便;因此,疫苗剂型口服化一直是新型疫苗的研制方向之一[2].一、材料和方法1. 口服剂型乙肝核酸疫苗(NVO-HB/s)的制备:将HBsAg的编码基因S插入真核细胞表达质粒pRc/CMV,获得重组质粒pRc/CMV-S,可高效表达HBsAg主蛋白[3];用以转化各载体菌株:伤寒杆菌基因工程减毒株CVD908、嗜酸乳杆菌La1株(均系中国预防医学科学院流行病学研究所徐建国教授惠赠)及酵母菌Z97株.各转化菌分别抽提、纯化获得质粒DNA,经鉴定确认转化成功;将上述各转化菌用磷酸盐缓冲液(PBS,pH7.4)定容至所需浓度与剂量;即为口服剂型乙型肝炎病毒核酸疫苗(NVO-HB/s).
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铜绿假单胞菌外膜蛋白OprH原核表达载体的构建与表达
目的:克隆铜绿假单胞菌外膜蛋白OprH基因,构建其原核表达载体并鉴定其表达。方法从铜绿假单胞菌中提取基因组DNA进行PCR扩增OprH基因;采用T-A克隆技术构建pMD19T-OprH重组质粒,并经酶切和序列测定后,获得OprH片段插入到原核表达载体pET28b中,以构建pET28b-OprH重组表达质粒,并在表达宿主菌E?Coli BL21中经IPTG诱导表达及通过SDS-PAGE电泳鉴定。结果 pET28b-OprH原核表达载体构建成功;重组表达质粒经IPTG诱导后表达外膜蛋白OprH。结论成功克隆了OprH基因并获得原核表达物,为进一步研究快速检测该菌的方法奠定了基础。
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改良型TAT-VP3基因表达对人膀胱癌细胞凋亡的诱导作用
VP3来源于鸡贫血病毒(CAV),又被称为凋亡素[1].TAT能够跨膜导入细胞内部.我们利用分子克隆方法构建了重组质粒PcDNA3-TAT-VP3,观察改良型TAT-VP3基因在人膀胱癌BIU-87细胞中的表达及诱导凋亡的效应.
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免疫球蛋白基因SNC66和SNC73在正常肠粘膜和大肠癌组织中表达的研究
SNC66基因和SNC73基因是采用减式杂交技术,从正常人大肠粘膜cDNA文库中筛选得到的两个大肠癌负相关基因[1]。为进一步明确免疫球蛋白基因SNC66和SNC73在正常大肠粘膜和大肠癌组织中的表达情况,了解它们的生物特性[2,3],我们采用cRNA/mRNA原位杂交技术,对这2个基因在大肠癌组织及同一患者的正常粘膜中的表达情况作了配对研究,观察它们在正常粘膜与肿瘤之间,以及粘膜上皮与间质或淋巴组织之间的表达情况,以明确此两基因与大肠癌的相关性。 1.材料与方法:浙江大学医学院附属第二医院手术切除的大肠癌标本及同一患者相应的正常大肠粘膜组织共收集37例。其中男性26例,女性11例,中位年龄57岁。其中29例临床病理资料完整。探针的制备及原位杂交:用SNC66基因和SNC73基因的在IgA1同源区的部分序列,构建出重组质粒pGEM7SNC66和pGEM7SNC73,各合成出地高辛标记的一对cRNA探针,其中之一为与目标mRNA互补的有效的反义探针,作为实验探针;另一为与目标mRNA同序的正义探针,作对照探针。配对材料进行原位杂交[4],在光学显微镜下观察,紫蓝色为阳性信号。统计学处理采用χ2检验。
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肝癌HepG2和Hep3B细胞系SNF5表达及定位
目的 染色质重塑因子SNF5在肝细胞肝癌中的生物学功能仍有待深入研究,本研究检测SNF5在HepG2和Hep3B肝癌细胞系中的表达及亚细胞定位,并构建Flag-SNF5真核表达质粒.方法 提取HepG2和Hep3B两种肝癌细胞系的总蛋白,蛋白质印迹法检测SNF5内源性表达;应用共聚焦激光扫描显微镜观察Hep3B细胞SNF5蛋白定位;提取HepG2总RNA,反转录为cDNA,PCR扩增SNF5全长编码序列,亚克隆至含有Flag标签的真核表达载体中;将构建的重组质粒测序并转染到Hep3B细胞中,提取细胞蛋白进行蛋白质印迹检测,验证其表达情况;使用免疫沉淀的方法纯化Flag-SNF5融合蛋白.结果 在HepG2及Hep3B两种肝癌细胞系中,均检测到了SNF5蛋白的内源性表达.在Hep3B细胞中,SNF5主要定位于细胞核.将SNF5蛋白全长编码区成功克隆到pcDNA3-Flag载体中.重组质粒转染入Hep3B细胞后,检测到融合蛋白Flag-SNF5的表达,相对分子质量约为39×103,并对Flag-SNF5融合蛋白进行了纯化.结论 SNF5蛋白在HepG2及Hep3B两种肝癌细胞系中均有表达,且在Hep3B细胞中主要定位于细胞核.成功地构建了Flag-SNF5的真核表达质粒,验证了重组质粒的表达,并纯化了该融合蛋白.
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黏附调节因子p120ctn1A细胞核定向表达质粒的构建及鉴定
目的:构建并鉴定p120ctn 1A细胞核定向表达质粒pCMV/p120ctn 1A.方法:采用PCR的方法扩增人p120ctn 1A活性片段,将其插入细胞核定向表达载体pCMV/myc/nuc/GFP,构建重组质粒pCMV/p120ctn 1A,经脂质体介导转染肺癌细胞系SPC-A-1,用荧光显微镜观察绿色荧光信号,免疫细胞化学及蛋白质印迹法鉴定其在肺癌细胞SPC-A-1中的表达与定位,用Transwell小室法监测细胞侵袭能力的变化.结果:限制性双酶切及DNA测序分析结果显示,插入pCMV/p120ctn 1A的片段为2 798 bp左右,与预期p120ctn 1A基因片段大小相同.转染pCMV/p120ctn 1A质粒后,荧光显微镜观察到绿色荧光信号特异性定位于细胞核内.免疫细胞化学结果显示,SPC-A-1细胞核内p120ctn的表达量显著增强.蛋白质印迹法检测证实,转染pCMV/p120ctn 1A质粒后的p120ctn 1A蛋白表达量显著上调.体外侵袭实验结果证实,转染后SPC-A-1细胞的侵袭能力明显增强.结论:成功构建了p120ctn 1A细胞核定向表达载体pCMV/p120ctn 1A,为深入研究p120ctn的核内功能提供了有力的实验工具.
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APC蛋白功能区域重组质粒的构建及其在结肠癌细胞株HCT-116中的表达
目的 构建并鉴定含有APC蛋白不同功能区域的真核细胞表达载体pEGFP-N3-APC1~5,转染人类结直肠癌细胞HCT-116,观察重组质粒在细胞内的表达.方法 根据APC基因的功能结构以及APC突变簇集区的特点,设计特异性引物扩增APC基因特异性的功能区域片段.将扩增出的5个APC片段克隆到pEGFP-N3载体的N端,经测序分析对重组质粒pEGFP-N3-APC1~5进行鉴定.使用脂质体转染法将重组质粒转染人类结直肠癌细胞HCT-116,通过观察细胞中绿色荧光蛋白的表达情况来检测APC功能区域在细胞内的表达.以RT-PCR法进一步验证重组质粒在细胞中的表达.结果 构建5个pEGFP-N3-APC结构区域的重组真核表达载体,重组真核表达载体转染HCT-116细胞后,细胞中均可见绿色荧光蛋白的表达.RT-PCR结果显示,5个蕈组质粒在HCT-116细胞中均可表达.结论 真核细胞表达载体pEGFP-N3-APC1~5的成功构建,为进一步研究其在细胞内的功能,筛选结直肠癌基因治疗的有效且易于基因操作的靶标片段提供了基础.
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pEGFPN1-GDNF真核表达载体的构建及其表达
目的 构建人胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)基因真核表达载体并观察其在COS-7细胞内的表达.方法 应用RT-PCR从U251细胞总RNA中扩增GDNF cDNA,将其克隆至真核表达载体pEGFPN1,经酶切鉴定及序列分析后,以Fugene HD介导转染COS-7细胞,应用免疫细胞化学和Western blot鉴定其在细胞内的表达.结果 RT-PCR产物为650bp的特异片段,重组质粒pEGFPN1-GDNF经双酶切产生650bp和4.7kb的片段,测序分析结果与文献报道结果完全一致.将其转染COS-7细胞后,免疫细胞化学、Western blot结果表明GDNF蛋白能在COS-7细胞中正确表达.结论 成功构建了pEGFPN1-GDNF真核表达载体,为进一步开展帕金森病的基因治疗研究奠定了基础.
关键词: 胶质细胞源性神经营养因子 真核表达 重组质粒 转染 -
反义缺氧诱导因子抑制胶质瘤的实验研究
研究表明许多人类肿瘤内都有显著的缺氧区域.处于缺氧状态的肿瘤细胞仍能不断增殖、浸润,许多基因表达的改变依赖于缺氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor,HIF-1)所调节[1].HIF-1是DNA结合的异质二聚体,由HIF-1α和HIF-1β构成.作者构建了反义HIF-1α(antisense hypoxia inducible factor 1α,aHIF)重组质粒,建立裸鼠C6胶质瘤皮下模型,研究aHIF对胶质瘤血管生成、细胞凋亡和生长的影响作用,并对其作用机理做了初步探讨.
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含变链菌PAc蛋白编码基因保守区重组质粒pCIA-P的亚克隆构建
人类致龋菌变形链球菌(S.mutans)的一种表面蛋白PAc,由于参与介导细菌对牙面的粘附而被视作S.mutans的重要毒力因子,因此成为研制防龋疫苗的主要备选抗原.我们选择pac基因中编码PAc主要免疫活性区域的DNA序列, 制备出待表达DNA片段, 经亚克隆至pGEM-T质粒后,再克隆到高效哺乳动物表达质粒pCI中构建成含pac基因重要抗原决定簇编码区域的重组质粒,从而为防龋DNA疫苗的免疫实验研究完成了重要准备.
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变形链球菌AI-2活性测定及luxS基因同源重组质粒的构建
目的 构建用于转化变形链球菌的luxS基因缺失的同源重组克隆载体.方法 利用哈氏弧菌(Vibrio harveyi)BB170作为报告菌株,对变形链球菌在不同生长时期诱导生物发光的能力进行测定,然后分别PCR扩增变链菌luxS基因上下游片段及质粒PJT10的红霉素抗性基因片段,采用分子克隆技术将基因片段依次双酶切后连接入载体pUC19,构建luxS基因缺失的重组质粒,转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞经筛选后,抽提重组质粒,进行酶切鉴定.结果 变链菌国际标准株可诱导哈氏弧菌BB170的生物发光现象,提示变链菌中存在AI-2数量感应通路.构建的重组质粒pUCluxKO经PstⅠ-BamHI双酶切,产物电泳在大约1000 bp和5000 bp处各见一条特异条带;经BamHI-KpnI双酶切,产物电泳在大约1500 bp和4500 bp处各见一条特异条带;经KpnI-EcoRI双酶切后,产物电泳在大约1000 bp和5000 bp处各见一条特异条带.结论 变链菌luxS基因同源重组质粒构建成功,为进一步通过同源重组法构建变链菌luxS基因缺陷株奠定基础.
关键词: 链球菌 变异 自身分泌性细胞间通讯 基因 重组质粒 -
猪牙胚釉原蛋白成熟肽基因原核表达克隆的构建
目的 克隆猪釉原蛋白(pAm)成熟肽编码区基因片段,并构建含有该基因的重组原核表达质粒,为制备基因工程化的重组pAm奠定基础.方法 从新生小猪牙胚组织中抽提总RNA,逆转录合成牙胚cDNA,通过PCR扩增pAm成熟肽编码序列(约540 bp),所得目的 基因插入表达载体质粒PGEX4T1,转化大肠杆菌DH5α.重组质粒PGEX4T1-pAm经双酶切和核苷酸序列分析鉴定.结果 重组质粒PGEX4T1-pAm经双酶切和测序鉴定证实载体质粒PGEX4T1中插入的基因片段与pAm成熟肽基因序列完全相同.结论 从发育期猪牙胚组织中克隆到釉原蛋白成熟肽编码序列可成功构建含有pAm成熟肽基因的重组表达质粒.
关键词: 釉原蛋白 逆转录聚合酶链式反应 重组质粒 -
重组pEGFP-C1-CXCL1真核表达载体构建及其对内质网应激下人肝癌细胞HepG2的增殖作用
目的 构建pEGFP-C1-CXCL1真核表达载体,研究过表达CXCL1对内质网应激(ERS)下肝癌细胞增殖作用.方法 以HepG2细胞的cDNA文库为模板,通过PCR扩增CXCL1编码序列,并将其插入pEGFP-C1空载体,构建pEGFP-C1-CXCL1真核表达载体,随后将其瞬时转染到293 T细胞中,通过荧光显微镜和蛋白质免疫印迹法检测CXCL1在真核细胞中的表达情况,将pEGFP-C1-CXCL1转染至HepG2细胞中,CCK8检测CXCL1对TM诱导下的ERS肿瘤增殖的抑制作用.结果 菌液PCR和测序结果均证实得到pEGFP-C1-CXCL1真核表达载体,其转染293T细胞后,在荧光显微镜下可观察到绿色荧光,免疫印迹表明CXCL1在293T细胞中表达,CCK8实验表明,ERS条件下肿瘤的增殖受到抑制,而过表达的CXCL1可降低ERS下的HepG2细胞的增殖抑制.结论 成功构建了真核表达质粒pEGFP-C1-CXCL1,并在人胚肾293T细胞中瞬时表达成功,过表达的CXCL1可有效降低由ERS造成的肝癌细胞的增殖抑制.
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重组腺病毒和质粒对心肌缺血治疗效果的比较
目的:研究不同载体对基因治疗效果的影响.方法:采用本实验室建立的犬心肌缺血动物模型,通过冠状动脉造影和TTC染色两种方法比较了携带肝细胞生长因子基因的重组腺病毒Ad-HGF和质粒puDKH对心肌缺血的治疗效果;并且在体外采用绿色荧光蛋白报告基因测定了不同载体对原代心肌细胞的转染率.结果:重组腺病毒Ad-HGF对心肌细胞的转染率和心肌缺血的治疗效果均好于重组质粒puDKH.结论:导入系统是影响基因治疗效果的关键因素之一.
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辐射诱导pEgr-sHemopexin在MCF-7细胞的表达和侵袭能力及人脐静脉内皮细胞小管形成的影响
将治疗基因克隆于可被辐射诱导激活的Egr-1启动子下游,利用Egr-1基因的调控序列可被辐射刺激的特点,形成基因和射线对肿瘤的双重杀伤作用,是近年来放射治疗研究的热点[1-2].下游目的基因的选择,对提高肿瘤基因放射治疗疗效至关重要.基质金属蛋白酶2(MMP-2)C端血色素结合蛋白样片段PEX可阻断血管生成和细胞外基质的降解,从而抑制肿瘤的生长、侵袭和转移[3-5].本研究根据Egr-1基因启动的辐射激活特性和PEX的抗血管生成和阻断细胞外基质的降解作用,将肿瘤抑制基因治疗和放射治疗二者联合起来,在构建pEgr-sHemopexin(pEgr-sPEX)重组表达质粒的基础上,观察体外pEgr-sPEX重组质粒辐射诱导表达特性,检测辐射诱导pEgr-sPEX对MCF-7细胞侵袭能力及人脐静脉内皮细胞(HUVEC)小管形成的影响,探讨抑癌作用.
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pcDNA3.1(+)-SOX6真核表达载体构建及在KYSE-30细胞的表达
目的 构建人性别决定区Y盒6(SOX6)基因真核表达载体并观察其在KYSE30细胞内的表达.方法 将人SOX6cDNA克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,经酶切和测序证实后,以Lipofectamine2000介导转染KYSE30细胞,应用RT-PCR和western blot鉴定SOX6在细胞内的表达.结果 SOX6cDNA为2358bp的片段,重组质粒pcDNA3.1(+)-SOX6经EcoR Ⅰ、Xho Ⅰ双酶切后产生的2400bp和5400bp的片段,DNA测序证实酶切产生的2400bp片段的碱基序列与人类SOX6 cDNA完全一致.将其转染至KYSE30后,RT-PCR和westernblot的结果显示SOX6能在真核细胞中正确表达.结论 成功的构建了pcDNA3.1(+)-SOX6重组质粒,为后续的研究奠定基础.