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胶体金免疫层析技术快速定量检测金黄色葡萄球菌肠毒素B
目的 建立胶体全免疫层析技术快速定量检测金黄色葡萄球菌肠毒素B的方法.方法 利用胶体金标记和双抗体夹心免疫层析技术,建立金黄色葡萄球茵肠毒素B的快速检测方法,评价其特异性和敏感性,并拟合检测曲线进行定量检测;在牛奶样品中添加金黄色葡萄球茵肠毒素B作为模拟污染样品进行检测.结果 该法可在5～10 min内完成定性和半定量检测,检出限为8 ng/ml,线性范围8～1000 ng/ml.结论 建立的检测金黄色葡萄球菌肠毒素B的胶体金免疫层析方法,能快速、灵敏、特异、准确地检测样品中的金黄色葡萄球菌肠毒素B,并可实现定量,适用于现场快速检测.
关键词： 金黄色葡萄球菌肠毒素B 胶体金 免疫层析 双抗体夹心 -
安徽省阜阳市10只可疑狂犬脑组织狂犬病病毒抗原检测分析
近年来安徽省阜阳市狂犬病疫情持续上升,为此2004年我们采集疑似狂犬10只,记录其发病症状及咬伤人和动物情况,并取犬头送卫生部武汉生物制品研究所基因工程室做狂犬病实验室检测,死犬其余部分焚烧消毒.抗狂犬病毒核蛋白单克隆抗体、HRP标记的抗狂犬病毒核蛋白单克隆抗体由该室制备[1];异硫氰酸荧光素(FITC)标记羊抗鼠IgG抗体由该所免疫研究室提供.用间接免疫荧光法(IFA)和双抗体夹心ELISA检测样品中狂犬病毒[2].
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双抗体夹心酶联免疫吸附实验检测诺如病毒
诺如病毒属于杯状病毒科,是引起急性非细菌性胃肠炎的主要病原,广泛分布于世界各地[1].虽然诺如病毒胃肠炎是温和的、自限性的疾病,但是它发病率高,感染广泛,导致住院和死亡人数的增加[2].
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甲型H1N1流行性感冒病毒血凝素HA1氨基端的表达及双抗体夹心ELISA法的建立
甲型H1N1流行性感冒（简称流感）病毒是一种人类常见的流感病毒之一,2009年引起流感大流行的病毒并非一种全新的流感病毒[1]，陆一涵等[2]推测可能是北美地区的H1N4病毒发生了一定程度的变异（包括重组和重排）所致。基因组测序发现，该病毒包含禽流感、猪流感和人流感3种流感病毒的基因片段[3-4]，其中血凝素(HA)蛋白来源于猪谱系，一直存在于经典猪流感病毒和三源重排子猪流感病毒中[5]。HA蛋白是流感病毒主要的表面抗原，与病毒吸附穿膜及宿主对病毒易感性有关[6-8],其变异率较高，常通过突变使病毒逃脱宿主免疫引起新的流感大流行。这种变异主要体现在HA1氨基端球形头部的受体结合部位与抗原决定簇氨基酸的改变，因此甲型H1N1病毒HA1氨基端蛋白的表达是建立特异性检测方法的关键。笔者通过原核表达此次甲型H1N1流感病毒血凝素HA1氨基端蛋白，制备多抗血清，建立了特异性双抗体夹心ELISA检测法。
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养阴液对干燥综合征患者肿瘤坏死因子的影响
为了研究中药治疗干燥综合征(SS)的机理,我们自拟养阴液对30例SS患者进行了治疗.同时采用双抗体夹心ELASA法对治疗前后末梢血及尿中的肿瘤坏死因子(TNF-α)水平进行检测.现将结果报告如下.
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颅脑伤患者血清IL-6、IL-8和NSE变化与预后关系
白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)和白细胞介素8(interleukin-8,IL-8)是血清中能测出的少数细胞因子,它不仅参与各种损伤局部炎性反应,而且在复杂的细胞因子网络中处于中心地位[1].神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase,NSE)是烯醇酶的γγ同工酶,主要存在于大脑神经元和神经内分泌细胞内并参与糖酵解的特异性酶.血清NSE含量变化是检测脑中神经元损伤的客观指标[2-3].本实验应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定血清IL-6和NSE水平,探讨炎性介质IL-6和IL-8及NSE与脑神经元损伤的相关性及临床意义.
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SARS冠状病毒核壳蛋白单克隆抗体的制备及鉴定
目的制备严重急性呼吸道综合征(SARS)冠状病毒(CoV)核壳(N)蛋白单克隆抗体,为寻求SARS早期诊断的方法及深入研究SARS疾病提供有力的工具.方法以重组SARS-CoV N蛋白免疫小鼠,采用甲基纤维素半固体培养基法制备单克隆抗体.通过间接酶联免疫分析、间接免疫荧光、免疫双向扩散等方法鉴定抗体的特异性、亲和力、类型及亚类、配对效果等.结果共获得15个阳性克隆,其中10个与天然SARS-CoV呈阳性反应.10株单抗的相对亲和常数在108～109mo1/L-1之间;10株中有1株为IgG2b、1株为IgG3,其余均为IgG1;10株单抗中有8株与12种肺炎相关的病原体无交叉反应,1株与流感病毒A、B,副流感病毒有交叉反应,l株与流感病毒A、B有交叉反应;10株单抗中的5株可形成5种配对,其中两种配对用于检测重组SARS病毒N蛋白,灵敏度可达1 μg/L.结论获得了特异性针对SARS冠状病毒N蛋白的单克隆抗体,并初步建立了检测SARS-CoV N蛋白的酶联双抗体夹心法,为SARS的早期诊断、蛋白质组学的研究奠定了基础.
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高效检测人降钙素原化学发光免疫分析方法的建立与评价
目的 重组原核表达人降钙素原(PCT)蛋白,制备抗人PCT单克隆抗体,建立高效检测PCT化学发光免疫分析方法. 方法 根据NCBI提供的PCT基因序列,按照大肠埃希菌偏爱密码子优化后进行全基因合成,通过BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切将其构建到pET32a载体上;将pET32a PCT质粒转化至大肠埃希菌BL21(DE3),用异丙基βD硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,采用Western blot法分析重组蛋白表达情况;用镍亲和纯化柱纯化重组蛋白,以此为抗原免疫BALB/c小鼠.取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤SP2/0细胞融合,采用间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞,有限稀释法进行克隆化后再用间接ELISA法筛选阳性单克隆细胞;将阳性单克隆细胞接种于小鼠腹腔内,制备腹水单抗,经Protein A/G纯化后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定,采用间接ELISA方法对抗体的特异性、灵敏度以及亲和力进行鉴定;用NaIO4氧化HRP法标记单克隆抗体,通过棋盘法筛选配对单克隆抗体,以筛选的配对抗体为捕捉抗体,建立双抗夹心化学发光免疫分析的血清学检测体系,检测临床150例血清标本,其中PCT升高(＞0.05 ng/ml) 120例,PCT阴性(＜0.05 ng/ml)30例. 结果 共筛选出6株抗人PCT蛋白的单克隆细胞,制备的腹水效价均大于4×10-6;通过棋盘法筛选得到2对能够进行双抗夹心配对的单抗,其中1对亲和力较高,其亲和力常数分别为2.39×108 L/mol和2.91×108 L/mol.双抗夹心化学发光免疫分析方法检测线性范围为0.06～8 ng/ml,其中阳性检出率为96.6％,阴性符合率为100％,与临床检测数据相比,相关系数R2=0.9737. 结论 建立的双抗夹心ELISA方法灵敏度高、特异性强、稳定可靠,可用于细菌、寄生虫等病原体感染患者的PCT血清学定量检测.
关键词： 单克隆抗体 人降钙素原(PCT) 双抗体夹心 定量检测 -
双抗体夹心ELISA测定人血浆可溶性血管内皮钙粘蛋白方法的建立及其应用研究
目的:建立测定人血浆可溶性血管内皮钙粘蛋白(sVE-cadherin)浓度的双抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)方法,并探讨其临床应用价值.方法:应用原核表达的人VE-cadherin重组蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠制备单克隆抗体,采用棋盘格滴定法筛选出佳双抗体组合,其中检测抗体采用辣根过氧化物酶(HRP)标记,建立检测人血浆sVE-cadherin双抗体夹心ELISA方法,并进行方法学评价.同时采用该法检测28名健康体检者和60例肿瘤患者的血浆sVE-cadherin浓度.结果:经筛选共获得6株单克隆抗体,通过筛查配对,成功建立检测人血浆可溶性VE-cadherin的双抗体夹心ELISA方法.该方法的检测限为24.7 pg/ml,批内变异系数(CV)为4.1％-7.7％,批间CV为8.7％-10.8％,平均回收率为96.7％.用该法检测28名健康体检者血浆VE-cadherin浓度为262.1±11.75 pg/ml,而用该方法检测24例白血病患者血浆VE-cadherin浓度为173.9±17.98 pg/ml,显著低于正常人(P＜0.叭),14例胃癌患者血浆VE-cadherin浓度为311.7±25.24 pg/ml(P＞0.05),11例肺癌患者血浆VE-cadherin浓度为206.8±25.01 pg/ml,均低于正常人(P＜0.05),11例其他肿瘤(9例乳腺癌,1例胶质瘤,1例肝癌)患者血浆VE-cadherin浓度为310.7±11.82 pg/ml(P＞0.05).结论:建立的双抗体夹心ELISA试剂盒有较好的灵敏度及特异性,可用于人血浆中可溶性VE-cadherin含量的检测,并可作为肿瘤诊断的一种新检测指标.
关键词： 血浆可溶性血管内皮钙粘蛋白 单克隆抗体 双抗体夹心 酶联免疫吸附试验 -
检测禽流感病毒抗原的双抗体夹心ELISA方法的建立
禽流行性感冒(avian influenza,AI)简称禽流感,是由正粘病毒科流感病毒属A 型流感病毒引起的禽类传染病.高致病性禽流感(highly pathogenic avian influenza,HPAI)被世界动物卫生组织(world organization for animalhealth,OIE)列为A 类传染病.我国也把禽流感列为一类动物疫病.禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)可感染几乎所有野生禽及家禽,AI 的暴发和流行,给养禽业造成了巨大的经济损失[1],且和其他动物流感有紧密联系,并威胁着人类的健康[1-2].1997 年在香港[2]、2003 年在荷兰[3]、2004 年以来每年在东南亚都有人感染AI 而死亡的报道,因此防控禽流感已成为全世界的一项重要任务.
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儿童幽门螺杆菌感染根除前后IL-18、IFN-γ水平变化
儿童幽门螺杆菌(Helicobactor pylori, Hp)感染已经日益引起了人们的重视.Hp是儿童慢性活动性胃炎的致病菌,与儿童十二指肠炎、消化性溃疡密切相关.IFN-γ是T、NK细胞分泌的细胞因子,其主要功能是免疫调节作用.Rieder等发现Hp感染后,IFN-γ mRNA水平增高,且mRNA表达水平与黏膜炎症程度呈正相关.IL-18是一种具有强烈IFN-γ诱导活性的促炎细胞因子,动物研究表明过量的IL-18产生可加剧肠道黏膜的炎症损伤.用特异的抗体中和IL-18能够减轻实验性结肠炎的严重程度.本研究对66例4～14岁儿童患者采用快速尿素酶试验和胃黏膜涂片用Giemsa染色镜检Hp联合检测判定Hp感染状态,并采用双抗体夹心ELISA法测定了儿童Hp感染根除治疗前后胃窦黏膜IL-18、IFN-γ水平,旨在探讨两者在Hp致病机制中的作用.
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双抗体夹心ELISA检测屋尘螨2组变应原方法的建立
过敏性疾病是临床上的多发病和常见病,尘螨是常见的过敏原.业已清楚尘螨主要的致敏成分是Der 1、Der 2变应原,近年文献报道发现Der 2变应原比Der 1变应原更稳定及耐降解,Der 2与Der1的含量一样高[1],从而引起了对Der 2的更深入的研究,并认为对环境中尘螨含量的监测及评价回避措施有效性等方面用Der 2含量更合适[2].
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一种双抗体夹心ELISA检测热休克融合蛋白方法的建立
MUC1蛋白在乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌等多种肿瘤细胞都呈现高水平表达.MUC1蛋白的表位肽VNTR,是诱生MUC1特异性免疫应答的靶点;采用MUC1 VNTR多肽研制出的生物制剂能刺激小鼠抑制表达MUC1肿瘤细胞的生长[1].
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残余卵清蛋白ELISA定量检测方法建立及初步验证
卵清蛋白(ovalbumin,OVA)作为异源物质,接种人体后易引起过敏副反应.因此残余OVA含量检测是生物制品尤其是以鸡胚为培养基质的流感疫苗生产过程中必须监控的指标之一[1].本研究在建立定量检测OVA双抗体夹心ELISA两步法后,对此方法进行优化,建立双抗体夹心ELISA一步法.通过与德国Seramun试剂盒对比,考察此检测方法的适用性.
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联合检测血清和腹水IL-6、IL-2、TNF-α对肝硬化合并SBP的诊断价值
采用ABS-ELISA法(药盒由比利时Innogentics公司提供)和双抗体夹心ELISA法(药盒由法国Immunotech公司或军事医学科学院提供)对46例肝炎肝硬化进行了血清和腹水中IL-6、IL-2、TNF-α的测定.
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精浆内前列腺素D合成酶双抗体夹心酶联免疫吸附法的建立及其应用
前列腺素D合成酶(L-PGDS)是一种双功能蛋白,它能转运、催化前列腺素D的合成[1-3].我们已用真核表达了人L-PGDS[4]、制备了小鼠抗人L-PGDS单克隆抗体.本研究在此基础上,建立L-PGDS双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA),分析精浆中L-PGDS与精子密度和精子活力间的相关性,以探讨L-PGDS在不同类型男性不育患者精浆内的表达差异[5].
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检测乙型肝炎表面抗原的一步法试剂的钩状效应分析
卫生部下发的<血站管理办法(暂行)>中规定,对献血者血液乙型肝炎病毒(HBV)检测的质量标准是"HBV表面抗原(HBsAg)酶免疫吸附法(ELISA):阴性",但未要求用一步法还是二步法检测.目前,国内检测HBsAg绝大多数采用ELISA中的双抗体夹心双位点一步法.用该方法检测HBsAg,当标本中的HBsAg浓度过高时,会因钩状效应(Hook)现象出现假阴性,而造成漏检,增加输血传播HBV的风险度,严重威胁输血安全.HBVe抗原(HBeAg)和HBV核心抗体(HBcAb)两项阳性时,大多数HBsAg都为阳性,但HBsAg阴性也可能存在漏检问题.为此,我们将对HBeAg和HBcAb两项阳性的血清标本进行不同比例稀释后,再用一步法和二步法进行分别检测及比较,以探讨一步法试剂的HOOK在HBsAg检测的漏检情况和二步法的临床应用意义及价值.
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白血病患者血清中可溶性细胞间黏附分子的检测及临床价值
可溶性细胞间黏附分子(soluble intercellular adhesion molecule-1, sICAM-1)属免疫球蛋白超家族,在多种造血及非造血细胞表面表达,与其配体淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)结合后,在血细胞与血管内皮细胞黏附,淋巴细胞活化及免疫应答等过程中起重要作用[1],sICAM-1在多种恶性血液病如恶性淋巴瘤慢性淋巴细胞白血病,急性淋巴细胞白血病的过度表达及其与疾病分期和预后相关.本检测通过应用双抗体夹心ELISA法检测127例不同时期的白血病患者血清中sICAM-1的浓度,以探求sICAM-1在白血病的临床诊断预后中的价值.
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双抗体夹心酶联免疫吸附法检测IgG0的研究及应用
类风湿关节炎(RA)患者IgG分子糖链末端2个半乳糖缺失(称为IgG0)[1],缺失后,N-乙酰葡萄糖(GlcNAc)暴露.本研究用特异性识别GlcNAc的蘑菇凝集素(PVL),建立一种检测IgG0的双抗体夹心酶联免疫吸附试剂(ELISA)检测法,并对正常人和RA患者进行检测.
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双抗体夹心酶联免疫吸附试验检测粉尘螨2组变应原方法的建立
尘螨是常见、主要的过敏性疾病变应原[1].螨体中主要的致敏成分是1组和2组变应原(Der 1、Der 2).酶联免疫吸附测定(ELISA)是检测尘螨变应原含量应用广泛的方法,但国内定量检测尘螨变应原的方法学研究鲜见报道.本研究用重组粉尘螨2组Der f 2(rDer f 2),制备免疫血清,建立一种以辣根过氧化物酶系统为基础的双抗体夹心ELISA,以快速检测Derf 2,现报告如下.
