首页 > 文献资料
-
脂联素基因修饰的脂肪干细胞对野百合碱诱导的肺动脉高压大鼠的影响及机制
目的：观察脂肪干细胞（ADSC）移植和脂联素（APN）基因修饰的ADSC移植对野百合碱（MCT）诱导的肺动脉高压（PAH）大鼠心肺结构、功能、代谢模式的影响及其机制。
方法：将过表达APN的慢病毒载体导入ADSC，ELISA测ADSC上清液APN含量，激光共聚焦检测其在肺组织的定位。80只SD大鼠，随机分为正常组（NC组）、PAH组、ADSC组、导入空载慢病毒的ASDC（ADSC-V）组和APN基因修饰的ASDC（ADSC-APN）组。PAH、ADSC、ADSC-V和ADSC-APN组给予腹腔注射MCT 40 mg/kg。14 d后，3个治疗组分别经颈外静脉注1×106/ml的ADSC、ADSC-V和ADSC-APN。移植3 W后，测平均肺动脉压（mPAP）、右心室肥厚指数（RVHI），HE染色观察并计算肺小动脉管壁厚度指数（WT%）及管壁面积指数（WA%），离体血管环张力评估肺小动脉功能，超声心动图测右心功能。核磁共振（NMR）测血中代谢物浓度并行PLS-DA分析。用BMP抑制剂、AMPK抑制剂干预PAH大鼠肺动脉平滑肌细胞（PASMC），Western blot测BMP2、Smad1/5/8、AMPK蛋白的表达，CCK-8检测细胞增殖。 -
激动Nrf 2对氧化应激所致血管平滑肌细胞损伤的影响
目的：探讨激动Nrf2对氧化应激诱导的大鼠血管平滑肌细胞（VSMCs）损伤的影响。
方法：原代培养大鼠VSMCs，随机分为4组：对照组、氧化损伤组、Nrf2激动剂组、Nrf2干扰慢病毒组。Western blot检测Nrf2蛋白表达变化，MTT法检测各组细胞活力，Hoechst 33342法及Annexin V/FITC法检测各组细胞凋亡情况。 -
逆转录病毒与慢病毒介导HSV-TK/GCV防治移植物抗宿主病的比较研究
移植物抗宿主病(GVHD)是限制异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)临床应用的主要并发症,现有的防治方法均不理想,应用自杀基因系统防治GVHD是一个新的尝试.本实验将携带单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)基因的逆转录病毒和慢病毒分别感染供鼠(C57BL/6小鼠)脾细胞,感染后细胞与供鼠骨髓细胞混合移植到经Co60γ射线照射后的受鼠(BABL/C小鼠),移植后分别给受鼠腹腔注射更昔洛韦(GCV),初步观察HSV-TK/GCV系统控制GVHD的效果,并在体内外实验中对两种载体进行比较研究.
-
三种不同方法转染THP-1巨噬细胞效果比较
目的 探讨通过腺病毒,慢病毒,脂质体2000三种方法转染THP-1巨噬细胞的佳方法.方法 采用腺病毒,慢病毒,脂质体2000三种方法分别转染THP-1巨噬细胞,并用荧光显微镜观察细胞转染荧光表达情况,流式细胞仪检测THP-1细胞转染效率,台盼蓝染色检测细胞病死率.结果 腺病毒对THP-1巨噬细胞转染效率可在对细胞损伤较小的情况下达较高水平,但可能对细胞免疫状态影响大.MOI=200时,转染效率较低,仅为(29.81 ±2.50)％,细胞病死率为(5.17±0.44)％;MOI=800,转染效率高,EGFP阳性率可达(86.49 ±6.11)％,细胞病死率为(8.80±0.54)％;MOI升至1200后,EGFP阳性率为(77.88±5.77)％,细胞病死率上升明显(14.50±0.77)％(P＜0.05);慢病毒转染效率高及细胞毒性较腺病毒低,但因其病毒产量低,实验消耗病毒量大,因而影响其应用.当MOI=10时,EGFP阳性率仅为(28.09±1.67)％,细胞病死率为(4.74±0.31)％;MOI=60时,转染率高,EGFP阳性率为(91.96±1.66)％,细胞病死率升至(7.25±0.50)％,此时病死率才有统计学意义(P＜0.05).脂质体2000对THP-1巨噬细胞毒性较大,细胞死亡率高,转染效率极低,不适合转染.结论 腺病毒与慢病毒转染THP-1巨噬细胞各存在一定优劣,在实验中需酌情选择,脂质体2000不适宜转染THP-1巨噬细胞.
-
Chemerin过表达致3T3-L1脂肪细胞葡萄糖消耗减少
目的 应用重组慢病毒构建3T3-L1脂肪细胞chemerin过表达模型并进一步探讨其对糖代谢的影响及可能机制.方法 构建鼠chemerin过表达重组慢病毒,并设对照慢病毒,感染3T3-L1细胞,实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)法检测转染后chemerin表达水平;应用胰岛素、3-异丁基1-甲基黄嘌呤、地塞米松诱导3T3-L1前脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞,油红O染色鉴定;诱导分化第8天加入慢病毒重组体,继续培养5d,葡萄糖氧化酶法检测各组葡萄糖消耗;RT-PCR法检测各组胰岛素受体底物1(IRS1)、胰岛素受体底物2(IRS2)、蛋白激酶B1 (Akt1)、叉头状转录因子O1 (FoxO1)基因表达水平;Western-blotting检测chemerin、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Akt)、磷酸化丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(pAkt)、FoxO1、磷酸化叉头状转录因子O1 (pFoxO1)蛋白水平.两组数据比较应用t检验.结果 Chemerin过表达慢病毒感染3T3-L1细胞72 h后细胞中可见红色荧光,RT-PCR结果显示:过表达组与空载对照组相比chemerin基因表达明显增加(分别为3.04±0.19比1.01±0.11,t=15.65,P＜0.05);chemerin过表达组葡萄糖消耗减少[分别为(3.30± 1.44)比(6.07±1.15) mmol/L,t=-0.35,P＜0.05];RT-PCR结果显示:IRS1、IRS2基因水平无明显变化(均P＞0.05),Akt1基因表达下降(分别为0.76±0.08比1.07±0.15,t=-3.11,P＜0.05),FoxO1基因表达上调(分别为1.53±0.30与1.03±0.21,t=2.34,P＜0.05).Western-blotting结果显示:Chemerin过表达后chemerin蛋白水平增加(相对表达量分别为1.08±0.06比0.72±0.03,t=-10.12;P＜0.05);Akt、pAkt蛋白水平均降低(分别为0.74±0.21比1.23±0.20,0.58±0.17比0.92±0.07;t=2.81、3.17,均P＜0.05),FoxO1蛋白水平升高(分别为1.04±0.09比0.76±0.14,t=-2.91,P＜0.05)、pFoxO1蛋白水平降低(分别为0.61±0.13比0.89±0.10,t=2.93,P＜0.05).结论 Chemerin可能通过下调Akt1 mRNA使3T3-L1脂肪细胞葡萄糖消耗减少.
关键词： 慢病毒 Chemerin 过表达 3T3-L1脂肪细胞 葡萄糖消耗 -
慢病毒载体在肿瘤免疫治疗中的应用
慢病毒载体感染的宿主广,不仅可以高效感染分裂期细胞,而且可以感染非分裂期细胞,可作为肿瘤免疫治疗的工具.与其他逆转录病毒载体相比,慢病毒载体具有许多优点,携带的外源基因在宿主中表达时间长、毒性低、可携带的外源基因片段大、不易诱发宿主免疫反应.本文对携带肿瘤相关抗原基因的慢病毒载体疫苗以及DC疫苗在肿瘤免疫治疗中的应用及安全性问题进行了综述,讨论慢病毒载体作为肿瘤免疫治疗的临床应用前景.
-
腺相关病毒和慢病毒作为小干扰RNA转运载体的比较
目的 观察以腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)和慢病毒(Lenti virus)为载体、含有针对大鼠金属蛋白酶组织抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinase,TIMP)-1、具有较强抑制作用的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)感染大鼠肝星状细胞系(hepatic stellate cell,HSC)-T6的感染效率和其对TIMP-1的表达抑制作用.方法 挑选针对大鼠TIMP-1基因具有较强抑制作用的siRNA序列,在体外构建为短发夹表达载体后,将其包装为重组AAV/siRNA-TIMP-1/GFP和Lenti/siRNA-TIMP-1/GFP,同时包装阴性对照AAV/GFP和Lenti/GFP,并以MOI=10感染大鼠肝星状细胞系HSC-T6,感染后72 h,通过流式细胞仪及荧光显微镜观察病毒的感染效率.在感染后7 d,应用Western bloting方法检测TIMP-1蛋白表达情况.结果 感染HSC-T6后细胞形态、增生速度未发生明显变化.通过流式细胞仪及荧光显微镜证实感染效率分别为:空载体AAV/GFP和Lenti/GFP组分别为72.7%和70.0%,AAV/siRNA.TIMP-1/GFP和Lenti/siRNA-TIMP-1/GFP感染组分别为64.58%和61.86%.与正常细胞相比,感染后7 d,siRNA感染组TIMP-1蛋白表达均下降约40.0%,但两组siRNA感染组下降幅度无统计学意义.结论 构建的重组AAV/siRNA-TIMP-1/GFP和Lenti/siRNA.TIMP-1/GFP均可有效感染大鼠HSC-T6,感染效率相近,且均可在短期内有效抑制大鼠肝星状细胞系HSC-T6 TIMP-1蛋白的表达.
关键词： 腺相关病毒 慢病毒 小干扰RNA 金属蛋白酶组织抑制因子-1 肝星状细胞 -
慢病毒介导生存素基因转染反分化早期和晚期椎间盘髓核细胞生物学效应的比较
目的 研究慢病毒介导生存素基因(Lentivirus-Survivin)对早、晚期反分化人椎间盘髓核细胞的生物学效应.方法 应用组织块法分离培养人椎间盘髓核细胞,采用绿色荧光素标记法检测慢病毒载体对其转染效率.通过免疫荧光法、MTT法、Western-Blot法和Antonopulos法检测比较Lentivirus-Survivin对反分化早期和晚期椎间盘髓核细胞Survivin 表达、细胞活性、Ⅱ型胶原和蛋白多糖合成的影响.结果 反分化早期髓核细胞中存在Survivin的表达,而反分化晚期髓核细胞中则极少表达.Lentivirus-Survivin可高效转染反分化早期和晚期椎间盘髓核细胞,并促进细胞中Survivin表达.对于反分化早期椎间盘髓核细胞,Lentivirus-Survivin可增强髓核细胞活性以及细胞外基质(Ⅱ型胶原和蛋白多糖)的合成;对于反分化晚期髓核细胞,其反而抑制细胞活性以及细胞外基质的合成.结论 Lentivirus-Survivin适用于反分化早期椎间盘髓核细胞,而不适用于反分化晚期的髓核细胞.
-
NgR特异性siRNA筛选及其慢病毒表达载体构建①
目的：筛选出高效的NgR（Nogo受体）特异性siRNA，并构建其慢病毒表达载体。方法：按照E1bashir等设计原则和siRNA的要求，设计、合成4对siRNA，转染体外培养大鼠原代皮层和海马细胞，筛选出基因高沉默效率的NgR特异性siRNA；将获得的高沉默效率siRNA克隆入慢病毒质粒pRNAT-U6．2/Lenti（SD1259），构建NgR特异性siRNA慢病毒表达载体，然后进行酶切鉴定及基因测序。结果：在4对siRNA中筛选出高沉默效率的NgR特异性siRNA199序列，将该序列的发卡式RNA成功克隆入载体pRNAT-U6．1/Neo，构建成NgR特异性siRNA199表达载体，酶切鉴定及基因测序表明设计序列完全相符，目的基因序列准确无误。结论：NgR特异性siRNA199及其慢病毒表达载体构建成功，为进一步观察NgR特异性慢病毒载体RNA干扰抑制大鼠NgR mRNA表达的神经元细胞实验奠定了基础。
-
慢病毒载体GV115介导Caspase-3 siRNA转染人椎间盘髓核细胞的生物学效应
目的:研究慢病毒载体GV115介导Caspase-3 siRNA转染人椎间盘髓核细胞的生物学效应.方法:采集12例外伤致脊柱爆裂性骨折患者(22～36岁)术中切除的椎间盘髓核组织,采用组织块法分离培养髓核细胞并传代.取第2代髓核细胞,分为GV115-Caspase3 siRNA组、GV115组和对照组,各组12个细胞培养孔.在荧光显微镜下观察计数阳性髓核细胞,计算GV115-Caspase3 siRNA对人椎间盘髓核细胞的转染效率;采用免疫荧光法检测三组髓核细胞中Caspase-3表达;采用MTT法检测三组髓核细胞活性;采用Western-Blot法和Antonopulos法分别检测三组髓核细胞的Ⅱ型胶原和蛋白多糖含量.结果:椎间盘髓核细胞被成功分离培养,培养1周后细胞达到80％融合,进行传代培养.转染后1周(85.6±1.3)％的髓核细胞可被GV115-Caspase3 siRNA转染而表达绿色荧光素.GV 115-Caspase3 siRNA组Caspase-3免疫荧光阳性细胞率[(19.4±3.2)％]较GV115组[(84.3±9.2)％]和对照组[(83.9±8.7)％]明显减少(P＜0.05),OD值(1.56±0.21)较GV115组(0.91±0.15)和对照组(0.92±0.17)高(P＜0.05),Ⅱ型胶原免疫印迹染色强度(1.32±0.09)较GV115组(0.81±0.05)和对照组(0.79±0.04)高(P＜0.05),蛋白多糖含量(0.56±0.09)较GV115组(0.35±0.06)和对照组(0.34 ±0.05)高(P＜0.05).结论:GV115-Caspase3 siRNA可高效转染人椎间盘髓核细胞,增强髓核细胞的生物活性,并促进细胞外基质的合成.
-
慢病毒介导的miPSC－EC YAP基因过表达及稳定感染细胞系的建立
目的：建立稳定过表达Yes 相关蛋白（YAP）的小鼠诱导性多能干细胞来源的内皮细胞（miPSC－EC）系，为 miPSC－EC 过表达 YAP 基因的体内外实验研究奠定基础。方法将模板质粒（pCMV－Flag－YAP2－5SA）改建成慢病毒表达质粒（pPGK－2Flag－YAP2－Puro）；将慢病毒表达质粒与包装质粒组成共包装系统转染293FT细胞；包装慢病毒，收集病毒原液，超滤浓缩，测定滴度。诱导miPSC分化为EC，观察其形态特征，并行组织化学鉴定。包装好的慢病毒感染miPSC－EC，嘌呤霉素筛选稳定感染的细胞系 miPSC－EC／YAP，并用 RT－PCR 及 Western blot 方法验证。结果慢病毒表达质粒（pPGK－2Flag－YAP2－Puro）构建成功，并成功包装 YAP 基因过表达慢病毒，滴度达到1．2×109 TU／ml。miPSC诱导分化所得细胞符合EC 形态特征，几乎都表达EC 标志CD31。转染YAP的miPSC－EC 中YAP mRNA表达水平较未转染细胞明显升高，YAP蛋白高表达（未转染细胞中YAP蛋白几乎不表达）。结论成功构建YAP基因慢病毒过表达载体，诱导miPSC分化为EC，成功建立YAP基因稳定感染细胞系miPSC－EC／YAP。
-
肝癌特异性多靶点慢病毒的体外实验研究
目的 研究anti-AFP scFv(抗AFP单链抗体)介导的慢病毒(lentivirus)载体对表达AFP肝癌细胞特异性基因转移以及双靶点基因系统对肝癌细胞生长的抑制作用.方法 用脂质体Lipofectamine 2000将目的基因转移载体、包装结构及包膜结构质粒共转染包装细胞293T,大量收集病毒上清,过滤、浓缩.用携带AFP-WtP53-pPRIME-miR30-shRNA-IGF1R融合基因的慢病毒体外转染培养的肝癌细胞HEP3B.荧光显微镜下观察感染效果,用PCR、Western blotting鉴定WtP53、miR30-shRNA-IGF1R在细胞中的整合转录结果.CCK8观察重组慢病毒对肝癌细胞生长的影响,TUNEL检测细胞凋亡.结果 成功构建anti-AFP scFv介导的慢病毒；滴度为4.58×109 PFU/ml;PCR、Western blotting均显示阳性条带,证明anti-AFP scFv介导的慢病毒在靶细胞中整合且转录表达.重组慢病毒对肝癌细胞的生长有明显的抑制作用且有促进细胞凋亡的作用.结论 anti-AFPscFv介导的慢病毒可将双靶点基因系统高效靶向性转染、杀伤肝癌细胞.
关键词： 肝癌细胞 人胰岛素样生长因子1类受体 野生型p53 慢病毒 -
慢病毒介导siRNA 沉默EGFR 基因及其对胰腺癌细胞增殖和凋亡的影响
目的探讨利用慢病毒介导小干扰核糖核酸(siRNA)沉默表皮生长因子受体(EGFR)基因的可行性及其对胰腺癌细胞增殖和凋亡的影响.方法构建慢病毒表达载体LV-shEGFR,包装慢病毒表达载体及制备慢病毒颗粒EGFR-shRNA.实验分为Panc-1 组(空白组)、绿色荧光蛋白(GFP)-Panc-1 组(对照组)及siEGFR-Panc-1 组(干扰组)共3 组.空白组使用未经处理的对数生长期的胰腺癌细胞株Panc-1 细胞,对照组使用不含siRNA 片段的慢病毒颗粒及干扰组使用制备好的EGFR-shRNA 慢病毒颗粒感染对数生长期的Panc-1 细胞.采用实时聚合酶链反应(real-time PCR)检测EGFR 基因表达量(以与β- 肌动蛋白相对浓度比值表示),采用蛋白质印迹法(Western-blot)检测细胞中EGFR 蛋白表达(以灰度值表示),采用噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖情况,采用流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡情况.3 组EGFR 表达、吸光度(A)值、细胞凋亡率、细胞周期比较采用单因素方差分析和t 检验.结果干扰组EGFR 基因相对含量为0.20±0.04,明显低于对照组(1.00±0.15)及空白组(1.13±0.13),差异有统计学意义(LSD-t=7.865,7.668;P<0.05).干扰组EGFR 蛋白表达量为0.185±0.009,与对照组(0.801±0.087)及空白组(0.825±0.092)相比,干扰组EGFR 蛋白表达明显降低(LSD-t =4.216,3.975;P<0.05).干扰组细胞增殖受抑制,生长速度较对照组生长缓慢.干扰组G2/M 期细胞比率为(8.87±0.29)%,与空白组(20.00±1.88)%和对照组(21.48±2.13)%比较明显减少,比较差异有统计学意义(LSD-t=2.015,2.323;P<0.05),干扰组S 期细胞比率为(50.97±3.04)%,与空白组(36.67±6.18)%和对照组(39.91±2.09)%比较明显增加,比较差异有统计学意义(LSD-t=1.987,2.251;P<0.05).干扰组细胞凋亡率为(18.4±2.3)%明显高于对照组(7.4±1.4)%和空白组(7.7±1.2)%,比较差异有统计学意义(LSD-t=2.585,2.667;P<0.05).结论慢病毒介导siRNA 可以沉默EGFR 基因,抑制胰腺癌细胞增殖,阻滞细胞在S 期和促进细胞凋亡.
-
人PKD2基因慢病毒的构建及其对常染色体显性遗传性多囊肾病小鼠肾脏上皮细胞多囊蛋白-2和Wnt/β-catenin信号通路的修复作用
目的 构建携带入PKD2基因的重组慢病毒载体,并探讨该载体对Pkd2缺失小鼠肾脏上皮细胞中多囊蛋白-2(PC2)的表达,以及对下游Wnt/β-catenin信号通路的作用.方法 2016年8月至2017年2月采用Xba Ⅰ和Xho Ⅰ酶将PKD2基因从已有pcDNA3.1-TM-PKD2质粒中切出,并插入慢病毒空载体pLV-sfGFP_ 2A_Puro,测序验证后获得重组慢病毒载体pLV-sfGFP-PKD2.然后,将重组慢病毒载体与包装质粒共脂质体转染293T细胞,包装病毒,获得病毒浓缩液.按照实验组(pLV-sfGFP-PKD2病毒感染)、对照组(pLV-sfGFP病毒感染)和空白组(未感染)进行分组,分别处理携带Pkd2基因的B3、D3细胞(Pkd2+-)和Pkd2缺失的B2、E8细胞(Pkd2-/-),采用蛋白质印迹法、免疫荧光染色法检测PC2表达情况.后,选取B3和B2细胞,利用增殖细胞核抗原(PCNA)荧光染色检测细胞增殖活性,实时荧光定量PCR检测PKD2下游Wnt/β-catenin信号通路的变化.结果 重组慢病毒载体酶切后凝胶电泳结果显示插入片段与PKD2基因一致,基因测序结果显示PKD2插入方向正确.经pLV-sfGFP-PKD2病毒感染后,实验组B2和E8细胞的PC2表达量分别为0.668±0.013和0.763±0.021,空白组B3和D3细胞的PC2表达量分别为0.687±0.015和0.776±0.008,差异均无统计学意义(P=0.164,P=0.409).实验组B2细胞增殖活性(0.573±0.010)明显低于空白组(0.848±0.031),差异有统计学意义(P＜0.01);与空白组B3细胞(0.585±0.017)比较差异无统计学意义(P =0.369).实时荧光定量PCR检测结果显示,实验组B2细胞中的Wnt7a和β-catenin基因表达量分别为0.037±0.005和0.554±0.008,与空白组B3细胞的0.037±0.004和0.571±0.013比较差异均无统计学意义(P =0.969,P=0.640).结论 本研究成功构建携带人PKD2基因并具有感染能力的重组pLV-sfGFP-PKD2慢病毒,慢病毒可重建PKD2基因缺失的小鼠肾脏上皮细胞PC2的表达,使过度激活的Wnt/β-catenin信号通路恢复正常,进而降低PC2缺失所导致的细胞异常增殖活性.
关键词： 多囊肾 常染色体显性 Wnt/β-catenin信号通路 转基因 慢病毒 -
人胸腺素β4RNA干扰载体的构建及其对293T细胞目的基因表达的影响
目的 探讨人胸腺素β4(thymosin β4,TMSB4)基因RNA干扰慢病毒载体的构建,观察病毒感染293T细胞后TMSB4 mRNA和蛋白表达,为进一步研究TMSB4基因的功能提供基础.方法 设计特异性干扰人TMSB4基因的小发卡RNA序列,合成含有干扰序列的双链DNA oligo,与经Age I和EcoR I双酶切后的pGCSIL-GFP载体连接产生慢病毒载体.转化感受态大肠杆菌DH5a并对阳性克隆进行PCR扩增测序鉴定.慢病毒载体、包装系统质粒共转染包装细胞293T细胞,产生慢病毒颗粒并测定病毒滴度.将获得的慢病毒感染293T细胞,分别采用实时定量PCR和免疫细胞化学染色方法 观察 TMSB4mRNA和蛋白的表达情况,利用生成的 TMSB4 shRNA慢病毒感染原代成纤维细胞.结果 感染重组慢病毒的293T细胞与空病毒转染阴性对照细胞的TMSB4 mRNA表达分别为0.56±0.11和1.00±0.06(P=0.0006),实验组细胞的敲减率为44%.实验组TMSB4蛋白表达水平0.042±0.007比阴性对照组细胞0.093±0.009的表达降低55%(H=461.342,P<0.001).感染重组慢病毒的原代培养的成纤维细胞与空病毒转染的对照细胞相比,TMSB4蛋白表达水平亦明显降低.结论 TMSB4基因干扰慢病毒构建成功并能显著降低TMSB4基因和蛋白在293T细胞中的表达,成功感染原代成纤维细胞使其目的 基因蛋白减少,为进一步研究TMSB4基因的功能奠定研究基础.
关键词： Thymosin β4 293T细胞 RNA干扰 慢病毒 -
神经生长因子β亚基基因修饰大鼠脂肪源干细胞的构建
目的 构建过表达神经生长因子β亚基(hNGFβ)大鼠脂肪源性干细胞(ADSCs),为基因修饰ADSCs移植治疗神经损伤性勃起功能障碍(ED)大鼠模型提供种子细胞.方法 获取人NGFβ基因,并与线性化的慢病毒载体pLV5-EGFP定向克隆连接.构建pLV5-hNGFβ-EGFP穿梭质粒转染HEK293T细胞,采用Western Blot检测hNGFβ基因在HEK293 T细胞中的表达情况.利用LV5慢病毒包装系统包装产生重组慢病毒,包装后扩增纯化并测定病毒滴度.hNGFβ基因重组慢病毒转染大鼠ADSCs,观察EGFP表达情况,用Western Blot检测hNGFβ基因表达情况.结果 经实时荧光定量(PCR)鉴定、限制性酶切分析、测序鉴定和目的质粒Western Blot表达检测鉴定,证实pLV5-hNGFβ-EGFP重组慢病毒载体构建成功.重组慢病毒包装成功且病毒滴度为1.0×109 PFU/ml.Western Blot于大鼠ADSCs中检测到约13.5 KDa大小条带,其与hNGFβ蛋白分子量大小相一致.结论 hNGFβ基因修饰的ADSCs构建成功,从而为基因修饰ADSCs移植治疗ED提供了良好的基因工程细胞.
-
慢病毒介导酸性成纤维细胞生长因子基因对脂肪干细胞增殖及周期的影响
目的 探讨慢病毒介导酸性成纤维细胞生长因子1 (FGF1)基因转染脂肪干细胞(ADSC)对ADSC增殖及周期的影响.方法 取健康脂肪抽吸者脂肪混悬液分离提取ADSC,做ADSC培养、鉴定、成骨细胞诱导分化.将含有目的基因载体质粒pWPXLd-FGF1与辅助质粒psPAX2,pMD2.G共转染293T细胞,获得编码FGF1慢病毒,使用慢病毒转染体外培养的ADSC,荧光显微镜下观察细胞表达绿色荧光蛋白情况,并用蛋白质印迹法检测FGF1在ADSC表达.流式细胞仪检测转染FGF1后ADSC周期情况,EDU法检测转染FGF1后ADSC增殖情况.结果 获得编码FGF1慢病毒.编码FGF1慢病毒感染ADSC后,约70％ ADSC出现绿色荧光,蛋白质印迹法显示编码FGF1慢病毒感染ADSC后FGF1蛋白高表达.与对照组相比,FGF1高表达后ADSC的G2/M期细胞数增加48％,细胞增殖增加75％ (P＜0.05).结论 FGF1基因可促使ADSC进入G2/M期增多,促进ADSC增殖.
-
慢病毒介导的 Sox-9基因转染对大鼠关节软骨细胞炎性反应的影响
目的：评价 Sox-9基因过表达对IL-β诱导的大鼠关节软骨细胞（RCs）炎性反应的影响，为临床提供参考依据。方法通过慢病毒（Lv-Sox-9）感染的方法在RCs细胞中过表达Sox-9，RT-PCR ，Western blot检测病毒感染后大鼠软骨细胞中 Sox-9、CollagenⅡ基因mRNA及蛋白含量；将细胞分为3组，细胞对照组，IL-1β诱导组，对照病毒感染且IL-1β诱导组和Sox-9过表达且IL-1β诱导组，将软骨细胞或者病毒感染后的软骨细胞接种于纳米孔氧化铝膜上，正常条件培养24 h后，诱导组细胞培养液中添加5μg／L的IL-1β，继续培养3 d ，CCK-8法检测细胞增殖活性变化、扫描电镜观察细胞形态及代谢变化。结果通过慢病毒感染的方法可以在大鼠关节软骨细胞中有效上调Sox-9基因的表达，病毒感染后72 h ，Lv-Sox-9感染组细胞内Sox-9 mRNA和蛋白含量均显著高于细胞对照组和对照病毒组；检测结果还显示，Rcs细胞内CollagenⅡ基因在转录和蛋白表达水平均与Sox-9正相关。结论 Sox-9可以作为抗炎治疗的潜在目标基因。
-
慢病毒介导CX43基因修饰小鼠骨髓间充质干细胞体系的建立及鉴定
目的 建立慢病毒介导间隙连接蛋白43(CX43)基因修饰小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)体系并进行鉴定,为研究CX43过表达BMSCs在移植物抗宿主病中的作用奠定实验基础.方法 采用全骨髓贴壁分离培养法获取小鼠BMSCs,流式细胞术检测细胞表面标志和成骨、成脂、成内皮细胞诱导分化能力;重组慢病毒载体pHBLVTM-CX43-GFP、pHBLVTM-GFP转染BMSCs,未转染慢病毒的BMSCs为空白对照,应用细胞免疫荧光、免疫组化法和Western blot方法检测各组CX43的表达.结果 流式细胞术检查示BMSCs表达CD73,CD44,CD29和CD90,不表达CD34,CD105;成骨诱导21d茜素红染色呈红色结节,成脂诱导分化14d可见明显脂滴并油红染色阳性,成内皮细胞诱导分化21d免疫荧光示内皮细胞标识CD31,CD34表达明显增加,接种于Matrigel基底胶上具有成小管能力;免疫荧光、免疫组化和Western blot方法均显示CX43基因修饰的BMSCs 的CX43蛋白表达明显增加.结论 成功建立了小鼠BMSCs分离培养法和CX43基因体外转染BMSCs体系.
-
过表达FAF1基因慢病毒构建及对人胃癌细胞凋亡影响
目的:构建过表达FAS相关因子1(fas-associated factor 1,FAF1)基因的慢病毒载体,探讨其对胃癌细胞凋亡的影响.方法:RT-PCR法扩增FAF1 cDNA,亚克隆至GV218质粒中,经酶切及DNA测序鉴定正确以后,把含有FAF1基因的重组质粒与pHelper1.0和pHelper2.0载体质粒转染至293T细胞包装慢病毒.用包装好的慢病毒感染人胃癌细胞HGC-27,Real time PCR和蛋白质印迹法检测转染前后FAF1基因和蛋白的表达,流式细胞仪检测细胞凋亡的改变.结果:FAF1基因扩增产物长度为1 996 bp,酶切及测序结果鉴定GV218-FAF1质粒构建正确,成功包装的慢病毒滴度为2×108 TU/mL.HGC-27细胞转染FAF1过表达慢病毒48 h后,细胞形态由长梭形变得不规则.过表达FAF1慢病毒转染组FAF1基因mRNA表达水平2.436±0.538,是阴性对照组1.086±0.226的2.24倍,P＜0.001;是空载转染组1.182±0.381的2.06倍,P＜0.001.过表达FAF1慢病毒转染组FAF1蛋白相对表达水平1.515±0.377,显著高于阴性对照组的0,P＜0.001;也显著高于空载转染组的0,P＜0.001.过表达FAF1慢病毒转染组凋亡率(84.66±5.92)％显著高于阴性对照组的(4.60±3.80)％,P＜0.001;也显著高于空载转染组的(7.32±3.82)％,P＜0.001.结论:成功构建并鉴定FAF1基因过表达慢病毒载体,FAF1基因表达上调使胃癌细胞凋亡增加.
