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鸡贫血病毒衣壳蛋白的表达纯化及多克隆抗体制备
利用PCR技术,以pPrpo-VP1为模板扩增得到鸡贫血病毒的衣壳蛋白基因(VP1),以T4多聚核苷酸激酶磷酸化处理、纯化后,克隆至表达载体pET-30a(+) 中,从而构建了原核表达质粒pET30-VP1.将pET30-VP1转化至感受态细胞E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导后,SDS-PAGE分析,可见约45kDa的目的蛋白获得表达.该蛋白经亲和层析纯化后,免疫6-8w的雌性Balb/c鼠,三次免疫后,采血分离血清,制得抗VP1的多克隆血清.以纯化的VP1为包被抗原,用ELISA方法检测,制备的血清效价达12800×以上.以Western blot 检测,该血清可与目的蛋白发生特异性反应,证明其具有良好的免疫原性.VP1蛋白的成功表达及其多克隆抗体的制备为进一步研究VP1蛋白的功能及开展CAV疫苗及诊断制剂的研制奠定了基础.
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人诺如病毒衣壳蛋白的密码子优化及在昆虫细胞中的表达
诺如病毒是当前在中国引起腹泻的主要人类杯状病毒,其中GGⅡ4、GGⅡ1和GGⅡ3等为主要的流行遗传型.为了提高诺如病毒衣壳蛋白的表达量,我们将其编码基因按杆状病毒喜用密码子进行了优化设计和人工合成.以杆状病毒为载体,在昆虫细胞Sf9中对密码子优化后的诺如病毒GGⅡ1、GGⅡ3、GGH4和GGⅡ7型衣壳蛋白基因进行了表达.结果显示,与野生型基因相比,经过密码子优化的基因在昆虫细胞中的表达水平得到明显提高,并可装配成病毒样颗粒.重组杆状病毒感染Sf9细胞72h表达量达到高峰.这些结果的取得,为我国人杯状病毒免疫学检测试剂和疫苗的开发打下了基础.
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替换HIV-1衣壳蛋白基因SHIV的构建及其活性测定
将猴免疫缺陷病毒(Simian immunodeficiency virus,SIVmm239)中gag基因的衣壳蛋白部分置换成人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus type1,HIV-1 HXBc2)的相应部分,构建出替换了衣壳蛋白基因的人/猿嵌合免疫缺陷病毒(SHIV)原病毒DNA.用此SHIV原病毒DNA转染293T细胞,细胞中能够检测到嵌合病毒基因的转录与翻译;在细胞培养液上清中亦可检测到装配出的病毒颗粒.病毒颗粒形态正常,含有基因组RNA,具有反转录酶活性,嵌合的外源衣壳蛋白能够正确剪切,形成棒状的核心.将此嵌合SHIV病毒感染MT4细胞,病毒能够吸附并进入细胞,能完成反转录过程,但不能增殖.
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牛免疫缺陷病毒基质蛋白和衣壳蛋白的可溶性表达
基质蛋白和衣壳蛋白是BIV的主要结构蛋白,在病毒感染及整个复制周期中起重要作用.本文采用pTXB系统在大肠杆菌中表达出融合状态的牛免疫缺陷病毒BIV基质蛋白MA及衣壳蛋白CA,经几丁质亲合、自剪切纯化后,获得不含融合片段的纯化产物.每克湿菌体MA产量可达毫克级,CA表达量达十毫克级.用原核表达获得的高纯度CA蛋白免疫大白兔获得的抗血清,经Western Blot分析显示能够与病毒颗粒的CA蛋白发生特异反应,证实表达产物具有良好的免疫原性和反应原性,可用于制备相应抗体,为研究BIV相应基因表达变化,进行体外蛋白质相互作用试验提供工具.
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竹花叶病毒卫星RNA及其编码卫星蛋白的结构与功能
竹花叶病毒(Bamboo mosaic virus,BaMV)是目前为止被发现感染竹类惟一的病毒,除了巴西、夏威夷及琉球有过零星报道外,台湾对此病毒有较深入的研究[1～13].BaMV在台湾地区的竹类栽培区普遍发生,可危害4个属、14个种、3个变种和3个栽培种[14,15],其中麻竹(Dendrocalamus latiflorus Munro)和绿竹(Bambusa oldhamii Munro)遭受危害为严重,主要竹产地染病率可高达90%以上,给台湾的竹产业造成了严重危害[16].
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结直肠癌中人微小病毒B19衣壳蛋白的表达与COX-2的关系
目的 检测人微小病毒B19基因与COX-2表达的关系,揭示该病毒在结直肠腺癌中可能的作用机制.方法 选取37例结直肠癌石蜡标本,采用免疫组织化学方法 分别检测B19病毒衣壳蛋白VP1/VP2和COX-2的表达,并进行统计学分析.运用免疫组织化学双标记法检测抗原表达定位关系.采用Western blot方法 检测转染pCDNA3.1/VP1u的结肠癌Lovo细胞COX-2的表达.结果 衣壳蛋白和COX-2在结直肠腺癌组织中表达率的吻合度具有统计学意义.免疫组织化学双标记结果 直观显示两种蛋白表达的定位关系,衣壳蛋白主要定位于细胞核内,COX-2定位细胞质内.Western blot结果 示VP1u细胞转染组COX-2的表达水平明显较空载体转染组上调.结论 人微小病毒319衣壳蛋白的表达与COX-2表达具有相关性,B19病毒可能通过VP1u上调COX-2的表达从而在结直肠腺癌中发挥一定作用.
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一起养老院急性胃肠炎疫情的病原学分析
目的 明确一起养老院感染性腹泻疫情的病原体及其基因型别.方法 通过流行病学调查,查明罹患率.对发病老人和部分工作人员进行肛拭子采样,采用细菌培养检测常规肠道致病菌,应用胶体金法检测轮状病毒,采用实时荧光定量RT - PCR进行诺如病毒核酸检测,应用常规RT- PCR扩增部分NoV阳性株衣壳蛋白的N/S区,PCR产物纯化回收、测序,利用Clustal X、MEGA4.1软件分析其基因序列.结果 21份病例及工作人员肛拭子样本,肠道致病菌和轮状病毒均为阴性,19份样本诺如病毒核酸阳性,毒株排除重组株的可能,测序样本均属GⅡ.4型诺如病毒,其与Hu/NSW696T/2006/AUS(EF684915)的同源性高达99％.结论 经诺如病毒核酸序列分析,该疫情是一起由GⅡ.4-2006b型诺如病毒引起的急性胃肠炎暴发.
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Nef对灵长类慢病毒属病毒感染力增强作用研究进展
灵长类慢病毒属病毒除了编码结构蛋白:衣壳蛋白(Gag)、外膜蛋白(Env)和多聚酶蛋白(Pol),还编码数个辅助蛋白:Rev、Tat、Vif、Vpu、Vpr和Nef,在这些辅助蛋白中Nef的作用机制可能是目前了解少的.
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衣壳蛋白和甲基转移酶对戊型肝炎病毒的基因分型
目的 探讨人戊型肝炎病毒(HEV )的部分编码区序列能否作为其基因组分型的依据.方法 从GenBank中查找并下载全基因组测序完整的能感染人类的 HEV基因组及蛋白序列共35株 ,用Clustal W程序对35株HEV全序列以及部分编码区序列进行多序列比对 ,并用treev 32绘制基因进化树 ,研究其进化关系.结果HEV的基因组全长7 .5 kb ;而衣壳蛋白和甲基转移酶的编码序列分别为1 982 bp和545 bp ,这2种蛋白的多序列比对和进化分析结果与完整基因组的分型结果相符.结论 衣壳蛋白和甲基转移酶可作为 HEV的分型依据 ,且是一种更简便、快捷的方法.
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HIV衣壳蛋白P24与TRIM22在HEK293T细胞中的表达及共定位
目的 观察人类免疫缺陷病毒(HⅣ)衣壳蛋白P24与三基序蛋白22(TRIM22)在HEK293T细胞中的共定位情况.方法 以慢病毒载体pLP1为模板,通过PCR法扩增p24编码序列,克隆至pDsRed-Monomer-N1真核表达载体.经菌落PCR、双酶切及DNA测序进行鉴定.将pDsRed-Monomer-N1-p24与pEGFP-N3-TRIM22载体共同转染HEK293T细胞,用荧光显微镜观察p24-DsRed-Monomer和TRIM22-EGFP的表达及共定位情况.结果 经菌落PCR、双酶切及测序鉴定,成功构建pDsRed-Monomer-N1-p24真核表达载体.通过荧光显微镜检测发现,p24-DsRed-Monomer和TRIM22-EGFP在HEK293T细胞中存在共定位关系.结论 HIV衣壳蛋白P24与TRIM22存在共定位.
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CVB3-VP1 siRNA对CVB3复制的抑制作用
目的:观察柯萨奇B组病毒3型衣壳蛋白1(CVB3-VP1)特征性小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)对CVB3复制及VP1蛋白表达的抑制作用.方法:根据CVB3VP1基因的序列及其结构特征,设计并用化学方法合成小于扰RNA(siRNA).以CVB3感染HeLa细胞,通过脂质体介导以siRNA转染HeLa细胞.48 h后,观察细胞病变的程度,用TCID5o法测定病毒滴度,免疫荧光法测定CVB3-VP1蛋白的表达,RT-PCR法检测CVB3-RNA的水平.结果:化学合成的4对针对CVB3-VP1的siRNA,发现其中有两对(VP1-1、VP1-2)对CVB3的复制具有明显的抑制作用,同时VP1蛋白的表达明显减少;细胞病变的程度也明显减轻.结论:CVB3-VP1siRNA可有效地抑制CVB3在HeLa细胞中的复制及表达VP1.
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沙眼衣原体噬菌体的研究进展
沙眼衣原体(chlamydia trachomatis,CT)是引起性传播疾病的主要病原体之一,能感染并裂解衣原体的一类细菌病毒称为衣原体噬菌体.从不同种类的衣原体中分离出的噬菌体共有6种:Chp1,Chp2,Chp3,Chp4,CPAR39和PhiCPG1.虽然至今未能从沙眼衣原体中成功分离出噬菌体,但关于噬菌体衣壳蛋白Vp1,Vp2及Vp3的研究提示沙眼衣原体噬菌体存在的可能性.有关沙眼衣原体噬菌体的研究可为沙眼衣原体感染的诊断和治疗提供重要的临床思路和方法.
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人食管鳞状细胞癌标本中乳头状瘤病毒DNA的检测
目的 食管鳞状细胞癌有明显的地域性差异，它的发生与遗传、环境、饮食和某些微生物的感染有密切的关系，本研究通过检测食管鳞状细胞癌和相应正常食管组织中HPV-11型和HPV-16型的DNA，阐明HPV与食管鳞状细胞癌的关系.方法 用PCR的方法检测22位食管鳞状细胞癌患者手术切除的癌组织和相应癌旁正常食管粘膜(共44例标本)中的HPV-11型和HPV-16型DNA的存在情况，并对其中1例HPV阳性肿瘤标本的HPV序列进行测定.结果 在本组所涉及的22位患者共计44例标本中，对于HPV-11型，12例癌组织为阳性；有7例癌旁组织为阳性；癌组织和癌旁组织均为阳性的有6例.对于HPV-16型，6例癌组织为阳性；6例癌旁组织为阳性；癌组织和癌旁组织均为阳性的有3例.序列分析结果表明所测定的序列与GeneBank登录的NC001525.1 (HPV-11), M14119.1 (HPV-11)和AF217526.1 (HPV-11)的同源性极高，均为90%.结论 通过实验结果分析，我们认为食管鳞状细胞癌与HPV-11型和HPV-16型主要衣壳蛋白L1基因密切相关，HPV可能在一定的地域环境中与食管鳞状细胞癌的发生具有相关性.
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宿主抗病毒因子与HIV-1的相互作用
人类免疫缺陷病毒1（HIV-1）的感染会引发艾滋病。HIV-1是一种逆转录病毒，由于其具有侵染不分裂细胞的能力，在逆转录病毒的分类上属于慢病毒家族。病毒颗粒的外层是来自宿主细胞的细胞膜，上面含有病毒自身编码的膜蛋白。病毒颗粒内部由一层病毒衣壳蛋白（CA）包裹着一对基因组RNA（gRNA）。gRNA长约9.1kb，在病毒编码的逆转录酶的作用下，逆转录为基因组DNA。病毒DNA病毒编码的整合酶的作用下，整合进宿主细胞的染色质DNA中，利用宿主细胞的转录因子完成病毒 mRNA 的转录。病毒的mRNA经过可变剪切的机制，产生多种病毒蛋白。通过单剪切产生的病毒mRNA,可以翻译出病毒膜蛋白，在细胞膜上分布。由全长mRNA（gRNA）翻译出的结构蛋白Gag在细胞膜上完成多聚化，并特异性的结合gRNA，组成新的病毒颗粒。新组装的病毒颗粒通过出芽的方式，夺取含有病毒膜蛋白的细胞膜，离开细胞。HIV-1的感染会造成细胞损伤，如病毒膜蛋白与细胞的受体CD4的结合而引起的细胞凋亡、病毒蛋白Vpr对细胞周期的干扰作用[1]等。通过长期的进化，宿主细胞发展出了抑制病毒复制的机制，而HIV也进化出了拮抗或逃逸宿主细胞抑制的方法，病毒与细胞的相互作用，成为了人们研究的焦点，为人们认识病毒的复制提供了新的视野。
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靶向小衣壳蛋白 L2的具有广泛保护性的VLP 型 HP V疫苗的临床前优化
理想的预防人类乳头瘤病毒（ HPV）疫苗应该具备以下特性，即能够提供广泛的保护性和持久的免疫应答，能够应对所有高危人乳头瘤病毒类型，单一剂量注射后即产生免疫效果，在无需制冷的条件下能够长期保存。基于以上要求，作者已经研制出由噬菌体病毒样颗粒（ VLP s ）组成的HP V候选疫苗，该噬菌体病毒样颗粒具有广泛的HPV16次要衣壳蛋白L2来源的中和表位。免疫接种16L2 VLPs可诱导出高效价、能够引起广泛交叉中和抗体，该中和抗体能够抵抗多种类型的HPV。在该项研究中，作者介绍了两种改进的候选疫苗，以期提高疗效和在发展中国家的临床适用性。首先评估抗原剂量和加强免疫对免疫原性的作用。用含明矾或不含明矾的剂量为2～25μg的16L2-MS2 VLPs免疫小鼠，结果显示，各种剂量下16L2-MS2 VLPs均具有高度的免疫原性，且小浓度明矾具有佐剂作用。虽说加强免疫可以提高抗体效价，实际上单一免疫接种也能够引起持续时间较长的强烈抗体应答。作者也研制出一种用于提高疫苗稳定性的方法。使用喷雾干粉设备，以多糖和氨基酸的结合物作为蛋白质的稳定剂，制造出L2 VLP s的干粉型疫苗。喷雾干燥型的L2 VLP s并不影响VLP s再建物的完整性和免疫原性。喷雾干燥型的VLP s在室温下稳定，37℃可以保存一个月以上，且该VLPs具有高免疫原性。总之，这些增强改进措施的目的在于，促进实现下一代以VLP 为基础的HP V 疫苗的制备，强调美国和全球在疫苗经济负担能力方面的差异，并且对疫苗在农村或偏远地区人群中的普及性进行评估。
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水泡性口炎病毒载体共表达的热休克蛋白70可以增强抗人诺瓦克病毒的黏膜免疫
作为病原体，人类诺瓦克病毒（ NOV ）占全球非细菌性胃肠炎的95％。目前，没有可用于对抗人类NOV病毒的疫苗，因为它不可培养，而且缺乏小动物模型。近研究表明，表达人类NoV 衣壳蛋白（rVSV-VP1）的重组水泡性口炎病毒（rVSV）在小鼠体内引起强烈的免疫应答。为了进一步改善候选疫苗的安全性和有效性，热休克蛋白70（HSP70）被插入到rVSV-VP1骨架载体。作为双重插入，萤火虫荧光素酶（ luc）基因插入到HSP70，形成第二构建物。相比 rVSV-VP1，所得到的重组病毒（ rVSV-HSP70-VP1和rVSV-luc-VP1）在小鼠体内的细胞繁殖和病毒传播有所衰减。在接种剂量为1．0×106 PFU时，相对于 rVSV-VP1， rVSV-HSP70-VP1触发了显著增高的阴道IgA应答；相对于rVSV-luc-VP1，诱导显著加强的粪便和阴道IgA 应答，尽管血清IgG和T细胞的应答是相似的。在接种剂量为5．0×106PFU 时，rVSV-HSP70-VP1比rVSV-VP1刺激显著增高的T 细胞应答，粪便及阴道 IgA 应答。当rVSV-VP1和rVSV-HSP70构成联合疫苗时，粪便和阴道IgA应答也显著上升。总的来说，这些数据表明：（ⅰ）插入一个附加的基因（ HSP70或 luc ）到rVSV-VP1骨架，可以进一步衰减以VSV为基础的疫苗在体外和体内的毒性，从而提高了候选疫苗的安全性；（ ii ） HSP70增强基于VSV的人NOV疫苗引发的人类NOV病毒特异的黏膜和T细胞的免疫。
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疫苗接种与感染后的抗体应答在病毒中和及表位识别方面表现出明显的差异
猪圆环病毒相关疾病（ PCVAD）包括一组综合征，与感染猪圆环病毒2型（PCV2）相关。基于疫苗接种和感染时的免疫应答在数量和性质上有所不同的假设，本研究的目的是在猪接种PCV2衣壳蛋白（ CP ）后和感染期间分别对其免疫力、病毒复制和疾病保护进行评估。此疾病模型包括了PCV2和猪生殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的双重感染，后者是一个已知其加强疾病进展和严重程度的病毒。PRRSV感染的主要影响是使PCV2病毒血症的峰值增加近40倍，但PCV2未表现出对PRRSV的相互影响。在接种疫苗的猪中，没有任何证据显示在双重病毒攻击后出现疾病或PCV2的复制。疫苗接种后的免疫促成了中和PCV2的活性；而PCV2感染或其疾病则导致非中和抗体的高水平产生，主要是针对CP的C-末端区域的多肽。这些结果支持这一主张，即不能用总抗体应答的量来衡量免疫保护。因此，抵抗疾病的保护作用取决于特定表位的免疫优势。在设计P CV2疫苗时，应考虑抗原表位的特异性。
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对前S1抗原在乙型肝炎临床检测应用中的几点认识
前S1抗原(preS1)是构成乙型肝炎病毒(HBV)衣壳蛋白的重要组成部分.其含有的肝细胞膜受体,在HBV感染肝细胞和机体免疫应答反映中起重要作用,是近年来用于监测乙肝病毒复制和疾病预后的有效指标.通过preS1在实际检测中的应用以及preS1与乙肝血清标志物、血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)的相互对比观察,认为该检测尤其适用于未开展PCR进行HBV-DNA检测的基层医院,现报告如下.
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硫酸乙酰肝素蛋白聚糖在人乳头瘤病毒感染中的作用
人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)是一类无包膜的小DNA双链病毒,其衣壳蛋白由主要衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2组成,高危型HPV的持续感染是诱发宫颈癌的主要原因.HPV吸附入胞伴随着由多种受体引起衣壳蛋白L1和L2的变构,其中衣壳蛋白L1与细胞表面硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(heparan sulfate proteoglycans,HSPG)之间的多重相互作用是病毒入胞的关键.经与HSPG相互作用后,HPV衣壳蛋白L2暴露病毒与入胞受体结合位点,进而介导病毒内吞入胞.因此,阐述HPSG在HPV感染细胞中的作用有助于进一步阐明HPV感染机制及致病机制,为HPV治疗性疫苗的研究提供一定的理论基础.本文就HSPG在HPV感染细胞中的作用进行综述.
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前S1蛋白在乙型肝炎诊疗的作用分析
前Sl蛋白(preS1),前s2蛋白和乙型肝炎病毒s抗原(HBsAg)三者共同构成乙型肝炎病毒(HBV的衣壳蛋白,PreS1含有肝细胞膜受体,在HBV感染肝细胞和机体免疫应答反应中起重要作用.本研究旨在应用酶联免疫吸附试验,基因检测以及病理肝活检等方法,联合动态对比分析乙型肝炎病毒PreSl在诊断乙型肝炎患者预后以及病毒复制中的作用.
