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大鼠耳蜗血管纹边缘细胞原代培养及心钠素的表达
目的 探讨心钠素(atrial natriuretic peptide,ANP)在原代培养大鼠耳蜗血管纹边缘细胞(marginal cell,MC)中是否表达.方法 应用细胞培养技术原代培养MC,并进行鉴定、纯化,应用免疫细胞化学和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测原代培养的MC中ANP及其mRNA的表达情况.结果 培养细胞经免疫细胞化学检测其CK-18蛋白表达阳性,证明其为上皮来源的MC.免疫细胞化学检测在原代培养的边缘细胞胞体内发现ANP免疫反应阳性颗粒,RT-PCR方法扩增出编码ANP的目的 条带.结论 本实验表明原代培养的边缘细胞具有合成和分泌ANP的能力,提示边缘细胞在维持内耳微环境稳定方面具有调节作用.
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心钠素在原代培养大鼠耳蜗螺旋神经元细胞中的表达
目的 观察心钠素(atrial natriuretic peptide,ANP)在原代培养大鼠耳蜗螺旋神经元细胞(spiral gan-glion neurons,SGN)中是否表达.方法 应用细胞培养技术原代培养SGN,并进行鉴定、纯化,应用免疫细胞化学方法和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测原代培养的SGN中ANP的表达情况.结果 原代培养的SGN经免疫细胞化学检测,证实其神经元特异性核蛋白(neuron-specific nuclear protein,NeuN)表达阳性,并且发现近胞核周围的胞质存在ANP免疫反应阳性颗粒,免疫荧光染色检测证实了ANP、NeuN的共同表达,RT-PCR方法检测到ANP-mRNA的存在.结论 本实验表明原代培养的SGN具有表达与合成ANP的能力,提示ANP可能作为内耳SGN神经调节的一种递质或调质,参与其生理活动和突触传递功能的调节.
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大鼠椭圆囊感觉上皮细胞的原代培养及其意义
目的建立大鼠椭圆囊感觉上皮细胞(utricular sensory epithelial cell,USEC)的原代培养体系,为研究毛细胞再生机制提供大量来源一致的细胞.方法取出生1天(postnatal day 1,P1)大鼠的椭圆囊感觉上皮,嗜热菌蛋白酶(thermolysin)消化处理,获得纯椭圆囊感觉上皮,再采用消化法进行原代培养,培养基为DMEM.从第2天开始每日用倒置显微镜观察、照相,对USEC的形态、生长特征进行观察;透射电镜观察;应用细胞角蛋白18及波形蛋白免疫细胞化学方法鉴定USEC来源;应用免疫细胞化学及RT-PCR分别检测毛细胞的特征性标志物calretinin、Brn3.a和AChR α9、myosin Ⅶa mRNA的表达.结果原代培养USEC呈扁平、多角形、核大而圆的上皮细胞形态,细胞之间连接紧密,形成单层时呈"铺路石样"外观,可见由成百个USEC包绕液体而成的dome.原代USEC表达细胞角蛋白,不表达波形蛋白,微绒毛丰富,细胞间连接紧密,提示其上皮起源;表达毛细胞的特征性标志物Brn3.a、calretinin及AChR α9、myosin Ⅶa mRNA,表明培养USEC具有毛细胞前体细胞的特征.结论原代培养的USEC表达毛细胞的特征性标志物,具有毛细胞前体细胞的特征.USEC原代培养体系的建立,为进一步探讨毛细胞再生的机制提供充足的细胞来源.
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同化培养液双界面法培养纯化的视网膜神经节细胞
视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)具有高度分化性,生后一般不再进行有丝分裂,RGCs体外培养属于原代培养;RGCs体外混合培养多能存活4周,而纯化培养大多只能存活48 h.我们采用星形胶质细胞同化培养液双界面法培养纯化的RGCs存活时间≥2周,为纯化RGCs提供较好的实验模型.
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黄芪多糖对大鼠咀嚼肌成肌细胞增殖影响的实验研究
目的:探讨不同浓度黄芪多糖对成肌细胞增殖的影响.方法:5周龄雄性SD大鼠处死后取双侧咀嚼肌组织,应用组织块法得到成肌细胞,经多次差速贴壁提纯成肌细胞,纯化后的成肌细胞经Desmin免疫荧光实验鉴定,传代到p3代用于实验研究,将浓度为0g/L,5g/L,2.5g/L,1.25g/L,312.5mg/L,78.13mg/L,19.53mg/L的黄芪多糖作用于成肌细胞,运用mtt方法测定不同浓度黄芪多糖对成肌细胞细胞的增殖影响.结果:黄芪多糖作用于成肌细胞三天各组才开始观察到有明显的细胞数量的变化,浓度为19.53mg/L的黄芪多糖能促进成肌细胞增殖.78.13mg/L至5g/L的黄芪多糖对成肌细胞增殖有抑制作用.结论:一定程度内,低浓度的黄芪多糖对成肌细胞的增殖起到促进作用,超过一定程度则有抑制作用.
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人口腔粘膜上皮角朊细胞的体外培养
人口腔粘膜上皮角朊细胞的原代培养有许多困难，其中主要是上皮细胞接种成活率、产量和成纤维细胞污染的问题。我们比较酶消化法和组织块法建立口腔粘膜上皮角朊细胞体外培养模型，并用免疫组织化学法进行培养细胞的定性研究。 1．材料：培养物来源于5个月～10岁唇裂患者修复术中的口内粘膜。切取唇内侧粘膜组织修复剩余物若干，每块约0.5 cm×0.5 cm大小。 2．方法：①酶消化法：用D-Hanks液冲洗粘膜块，剪切至0.2 cm×0.2 cm大小。配制0.3 kg/LⅠ型胶原酶和0.4% Dispase消化液的混合液（1∶1）5 ml，将粘膜块放入其中，密闭放入4℃冰箱内12～20 h。将表皮从基底撕脱，放入5 ml 0.25%胰蛋白酶液中吹打5 min，终止消化。低速离心5 min，去上清，加入5 ml含15% 胎牛血清的基础培养液中，制成细胞悬液并调整细胞数目在5×108/L，接种于25 ml培养瓶中。②组织块法：将肉眼可见的粘膜下组织尽量去除。剪切至0.1 cm×0.1 cm大小，用探针将小组织块以0.5 cm的间距放于25 ml培养瓶内用多聚赖氨酸处理过的小盖片。轻轻翻转，放入37℃温箱2～4 h，加入2 ml含15%胎牛血清的基础培养液，轻轻翻转培养瓶，使培养液浸没组织块，静置培养，每周换液2次。
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建模时间及糖浓度对糖尿病大鼠下颌骨成骨细胞培养的影响
目的:探讨建模时间长短及不同糖浓度培养基对糖尿病大鼠下颌骨来源成骨细胞培养的影响为胰岛素经人工种植牙给药建立细胞模型.方法:链脲霉素诱导Ⅰ型糖尿病大鼠模型,建模后10d及40d取其下颌骨,分别于葡萄糖含量为5.5 mmoJL/L(低糖组)和25mmol/L(高糖组)的培养基中进行成骨细胞培养,观察细胞的形态及生长情况.细胞计数法检测生长增殖能力,碱性磷酸酶染色法、茜素红钙结节染色法分别检测分化及矿化能力.结果:细胞增殖能力由大到小依次为建模10d低糖组＞建模10d高糖组＞建模40d低糖组＞建模40d高糖组(P＜0.05),分化能力建模10d低糖组＞建模40d低糖组、建模10d高糖组及建模40d高糖组(P＜0.01).建模10d低糖组可形成钙结节,其他组未能形成钙结节.结论:建模时间延长、高糖培养对糖尿病大鼠下颌骨来源成骨细胞的各项生物学活性指标均产生负面影响,其中建模时间主要抑制了细胞增殖,而高糖培养主要抑制了细胞的分化和矿化.
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应用琼脂糖微球抗体筛选原代乳鼠肺微血管内皮细胞新方法的建立
目的 建立一种简便、高效的原代乳鼠肺微血管内皮细胞(PMVECs)培养新方法.方法 选取小于1周龄的C57BL/6乳鼠,采用琼脂糖微球抗体筛选法分离、培养原代PMVECs.倒置显微镜观察细胞形态,采用CD31、血管性血友病因子(vWF)相关抗原免疫荧光染色以及基质胶体外成血管实验鉴定内皮细胞,采用CCK-8法绘制细胞生长曲线.结果 倒置显微镜下观察培养的原代PMVECs呈短梭形、类圆形,单层融合呈铺路石样排列.CD31相关抗原、vWF免疫荧光染色阳性,阳性率分别为91.35％±3.06％、92.99％±2.67％,证实培养的细胞为PMVECs.PMVECs接种在基质胶上8h后,有血管腔结构形成.CCK-8法绘制的生长曲线显示,琼脂糖微球抗体筛选法提取PMVECs培养2～5d后细胞处于对数生长期.结论 琼脂糖微球抗体筛选法分离、培养乳鼠原代PMVECs简便、高效,是一种值得推广的分离培养乳鼠PMVECs的新方法.
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大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的分离、纯化、原代培养及鉴定
目的 建立大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(alveolar type Ⅱ epithelial cell, AT-Ⅱ)分离、纯化、原代培养及鉴定方法.方法 取Wistar大鼠肺脏,采用胰蛋白酶消化法分离AT-Ⅱ,通过差速离心法、红细胞裂解法、贴壁选择法、免疫黏附选择法纯化AT-Ⅱ,倒置相差显微镜下观察细胞形态,鞣酸染色法进行细胞鉴定.结果 与结论 AT-Ⅱ呈单个或岛状生长,细胞呈圆形或椭圆形,细胞浆内有大量的反差明显的细胞小颗粒,细胞核明显.鞣酸染色法鉴定阳性.通过改进的酶消化法获得的AT-Ⅱ生长状态良好,纯度高,符合体外实验要求.
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神经元损伤修复机制研究的离体模型--体外培养原代神经元损伤模型的建立及损伤后c-Fos蛋白表达
目的:建立一个模拟脊髓全横断损伤后脊髓组分--原代培养的脊髓神经元损伤的模型.方法:取Wistar大鼠(孕14 d)脊髓,培养10～12 d后,采用所设计的标准模板,直视下进行损伤.观察损伤前后不同时间神经元的形态及即刻早期基因c-fos的表达变化.结果:在损伤8～12 h后,损伤两侧存活的神经元突起便开始朝着损伤部位生长,随着时间的延长,神经元突起甚至可跨越损伤处而延伸至对侧.c-fos基因在损伤后10 min即有表达,2 h达到高峰,随后逐渐下降.结论:此模型可用于模拟体外培养的脊髓神经元受到机械损伤以及观察神经元损伤后进行修复的一些分子事件,简便而可靠,实用性较强.
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人血管平滑肌细胞的原代培养及其钙化模型的建立
目的 利用β-甘油磷酸盐处理人血管平滑肌细胞(human vascular smooth muscle cells, HVSMCs )制备体外血管钙化模型.方法 用组织贴壁法从人胚胎脐带动脉中分离原代人主动脉平滑肌细胞,原代细胞通过抗体α-sm-actin 染色鉴定,将传4~6代的细胞分为钙化组和对照组,对照组用正常DMEM培养基培养,钙化组加入10 mmol/L β-甘油磷酸盐诱导细胞钙化,连续培养10 d.茜素红S染色及碱性磷酸酶法鉴定.结果 :分离的原代细胞经S-P染色鉴定为阳性,呈淡黄色.钙化组细胞诱导钙化后,细胞增殖缓慢,并形成囊泡结构,茜素红S染色形成红色的钙化结节,钙化组碱性磷酸酶活性较对照组在不同时间点(4,6,8,10 d)都有所增加(P＜0.01).结论 :β-甘油磷酸盐体外能够诱导HVSMC钙化,此方法诱导的钙化模型是一种良好的研究血管疾病方面的体外模型.
关键词： 人胚胎血管平滑肌细胞 原代培养 钙化模型 -
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幼龄大鼠骨骼肌卫星细胞原代培养的实验研究
目的:为改进大鼠骨骼肌卫星细胞的体外培养方法,获取高纯度的肌卫星细胞.方法:选用幼龄SD大鼠,通过两步消化法和简易的两次差速贴壁法得到高纯度的肌卫星细胞.所得细胞通过免疫组织化学方法加以鉴定.结果:骨骼肌卫星细胞纯化率高,细胞生长良好,后期增殖较快.结论:本实验成功建立了骨骼肌卫星细胞的纯化和鉴定方法,可用于骨骼肌细胞增殖和细胞移破植的相关研究.
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耐力运动促进骨骼肌卫星细胞线粒体能量代谢及其对成肌分化的影响
目的:观察耐力运动训练对骨骼肌卫星细胞线粒体能量代谢的影响,并探讨其对成肌分化的调控机制.方法:C57BL/6小鼠随机分为安静对照组(N组)和运动训练组(T组).12周训练后,两步酶消化法分离骨骼肌卫星细胞,免疫化学染色鉴定卫星细胞纯度.原代培养并体外诱导成肌分化,倒置显微镜观察卫星细胞成肌分化程度.分别在分化0h和24h测定线粒体呼吸功能、ATP合成活力、膜电位和MyHC、COXⅣ、AMPK、p-AMPK、p21蛋白表达量.结果:免疫化学染色显示desmin阳性细胞＞90％,表明获取的卫星细胞纯度高.HE染色结果显示T组腓肠肌肌纤维横截面积显著高于N组(P＜0.05).分化Oh时,T组态3呼吸速率(ST3)、呼吸控制比(RCR)、线粒体ATP合成活力、p21表达较N组显著升高(P＜0.05),p-AMPK表达显著降低(P＜0.05).分化24h时,T组肌管形成数量及MyHC表达较N组显著升高(P＜0.05),ST3、RCR、ATP合成活力、膜电位、p21及COXⅣ表达显著增加(P＜0.05),p-AMPK表达显著降低(P＜0.05).结论:耐力运动训练可提高未分化卫星细胞线粒体能量代谢水平,继而抑制AMPK活化而增加p21表达,从而促进成肌分化的启动和进程.
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胶质瘤中MMP-2活性酶与侵袭力的相关性研究
目的 探讨胶质瘤原代培养细胞中基质金属蛋白活性酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)对肿瘤细胞侵袭力的影响.方法 对21例Ⅳ级胶质瘤组织进行原代培养并传代,通过明胶酶谱检测MMP-2酶原及活性酶含量,Boyden小室侵袭实验检测细胞侵袭力,分析MMP-2酶原及活性酶与肿瘤细胞侵袭能力之间的关系.结果 MMP-2活性酶的含量与肿瘤细胞侵袭力正相关(r>0,P<0.05),pro-MMP-2含量与肿瘤细胞侵袭力的相关性不具有统计学意义(P>0.05).结论 Ⅳ级胶质瘤中MMP-2活性酶是决定肿瘤细胞侵袭力的关键因素.
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齐多夫定对原代大鼠肝细胞毒性作用的研究
目的: 研究齐多夫定对原代大鼠肝细胞的毒性.方法:采用二步灌流法分离Wistar大鼠肝细胞,经台盼蓝拒染试验测定细胞活力,活力＞85%用于实验.实验分4组:药物组、阳性对照组、阴性对照组和空白对照组.肝细胞悬液(3×105个/ml)接种于各培养板:96孔板每孔200 μl,24孔板每孔1 ml,6孔板每孔2.5 ml,各板置37℃、5%二氧化碳培养箱培养4 h,弃上清液.药物组分别加入齐多夫定10、5、3.3、2、0.4、0.08mmol/L,阳性对照组分别加入四氯化碳10、2、0.5 mmol/L,阴性对照组加入含1%二甲基亚砜(DMSO)的DMEM培养液,空白对照组加入DMEM培养液.96孔板于加样后6、12、24 h进行MTT试验测定细胞活性,24孔板于加样后6、12 h测定肝细胞AST、ALT及LDH的释放量,6孔板加样后12 h将细胞苏木素-伊红(HE)染色,观察细胞形态.结果:齐多夫定浓度为3.3 mmol/L、四氯化碳浓度为2 mmol/L时,于6、12、24 h的吸光度(OD)值分别为(1.20±0.17)、(0.99±0.08)和(0.89±0.09)与(1.20±0.13)、(1.01±0.09)和(0.88±0.13),同时间点阴性对照组OD值分别为(1.34±0.08)、(1.11±0.10)和(1.03±0.11).与阴性对照组比较,齐多夫定组、四氯化碳组的细胞活力均显著降低,差异均有统计学意义(均P＜0.05),但10 mmol/L 齐多夫定对细胞活性的影响远低于10 mmol/L 四氯化碳.加3.3 mmol/L齐多夫定后6和12 h,AST释放量为(18.53±2.02) 卡门单位和(26.86±2.61) 卡门单位,ALT的释放量为(15.16±2.18)卡门单位和(27.48±2.27)卡门单位,LDH释放量为(1 681.00±193.98) U/L和(2 708.55±78.73)U/L;阴性对照组同时间点AST释放量为(15.91±1.62)卡门单位和(37.71±2.54) 卡门单位,ALT释放量为(19.66±0.74)卡门单位和(23.42±1.46)卡门单位,LDH释放量为(2 036.39±134.56) U/L和(2 870.21±87.73) U/L;与阴性对照组比较,齐多夫定对AST、ALT及LDH的释放量均有显著影响,差异均有统计学意义(均P＜0.05).齐多夫定浓度≥3.3 mmol/L时,可引起细胞膜破裂、核浓缩,四氯化碳浓度为10 mmol/L时,可使细胞变小、细胞膜破裂及核碎裂.结论:齐多夫定浓度≥3.3 mmol/L时,具有肝细胞毒性作用,齐多夫定的细胞毒性低于四氯化碳.
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利用原代肝细胞模型检测细胞内磷酸化组蛋白H2AX表达筛选遗传毒物的方法验证
目的：验证以原代小鼠肝细胞为受试细胞，以细胞内磷酸化组蛋白H2AX（γH2AX）表达改变为检测指标的体外检测化学物遗传毒性的实验方法。方法采用改良的两步胶原酶灌注法分离获取小鼠肝细胞，并运用三明治法体外培养肝细胞。选择4种已知的遗传毒物平阳霉素、苯并芘、苯乙烯和氧化苯乙烯及2种非遗传毒物硫唑嘌呤和环孢素A作为受试物，用受试物0~40μmol·L-1处理原代培养肝细胞0~24 h， CCK-8法检测细胞毒性，并用流式细胞术检测γH2AX的表达水平。结果利用所建立的方法筛选上述4种遗传毒物均获得阳性结果，2种非遗传毒物均呈阴性反应。直接遗传毒物平阳霉素和氧化苯乙烯作用3 h，间接遗传毒物苯并芘和苯乙烯作用6 h时，γH2AX表达量高（P<0.01）。4种遗传毒物处理组在适时间点（直接遗传毒物：3 h；间接遗传毒物：6 h）及适作用浓度（10μmol·L-1）诱发细胞γH2AX的表达水平依次为25.7，18.4，12.4和14.2（平均荧光强度），分别为DMSO溶剂对照组的18，12，8和10倍（P<0.01），且γH2AX的表达水平与遗传毒物浓度呈显著正相关（P<0.01）。非遗传毒物硫唑嘌呤和环孢素A处理组与DMSO溶剂和空白对照组相比，γH2AX的水平均无明显变化。结论利用原代肝细胞模型检测γH2AX表达水平可在无S9的情况下有效区分遗传毒物与非遗传毒物和直接遗传毒性与间接遗传毒性。γH2AX表达水平可作为鉴别遗传毒物与非遗传毒物的有效参考指标。
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黏膜上皮细胞培养模型及其在给药系统评价中的应用
目的综述黏膜上皮细胞培养模型的建立、评价、实验方法及在给药系统中的应用,为此方面的研究工作提供参考.方法查阅、总结近年来国内外有关文献.结果黏膜上皮细胞培养模型可在体外有效地研究药物及制剂的摄取、代谢、排放、转运以及生物黏附等过程.结论黏膜上皮细胞培养模型被广泛用于多种给药系统研究中.
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原代培养舌癌细胞对抗癌药物敏感性观察
舌癌是头颈部常见的恶性肿瘤,其病因和发病机制尚不清楚,对其生物学特性的了解还不完善,因而影响治疗效果.目前研究表明,恶性肿瘤应进行综合治疗,其中,化疗药物治疗是其重要组成部分之一,但是化疗的疗效除受肿瘤组织学类型影响外,常存在个体差异,致使相同的治疗却结果不同.因此,本研究应用手术切除的新鲜舌癌组织制备单细胞进行培养,以MTT(噻唑蓝)比色法和流式细胞术法,观察临床常用化疗药物的敏感性,为临床化疗提供依据.
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银杏叶提取物对缺氧复氧致神经细胞凋亡中Bax基因表达的影响
为探讨缺氧复氧致原代培养的大鼠大脑皮质神经细胞凋亡中,Bax基因的表达及银杏叶提取物(EGB)对其的调节作用,用胎龄16～17 d Wistar大鼠的大脑皮质神经细胞进行原代分离培养.采用原位末端标记法(TUNEL)透射电镜技术确立缺氧复氧神经细胞凋亡病理模型,并应用免疫组织化学方法显示缺氧复氧不同时间Bax基因的表达.结果:缺氧复氧可以使大鼠大脑皮质神经细胞发生凋亡,随缺氧时间的延长,凋亡细胞数逐渐增多,至缺氧8 h,复氧18 h达高峰,银杏叶提取物预保护可使凋亡细胞数减少;同时随着缺氧时间的延长,Bax基因表达逐渐增高,EGB可逆转缺氧复氧时Bax的表达.提示:EGB对缺氧复氧时Bax的表达具有明显的抑制作用,这可能是EGB对抗缺氧复氧时胎鼠大脑皮质神经细胞发生凋亡的机制之一.
