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烧伤前后大鼠血清对骨髓基质细胞生物学行为的影响
目的:观察烧伤前后大鼠血清对体外培养的大鼠骨髓基质细胞的生物学行为的影响,为骨髓基质细胞在创伤修复中的应用奠定实验基础.方法:取Wistar大鼠,处死分离骨髓,原代培养骨髓基质细胞,传代后分别用含有10%胎牛血清、正常大鼠血清、烧伤后3d大鼠血清和烧伤后14d大鼠血清的F-12培养基培养,用MTT法测定其生长曲线,PI染色,流式细胞仪分析细胞周期、DNA含量和细胞凋亡率.结果:用含有10%大鼠血清的F-12培养基传代培养的细胞生长曲线相似,但与含有FCS的F-12培养基传代培养的明显不同.前者倍增时间缩短,N组、B1组、B2组细胞群体倍增时间分别为23.7h、18.6h、20.2h.平台期所能达到的细胞总数明显增加.烧伤后大鼠血清处理过的细胞中G0/G1期细胞比例明显低于其它两组,而S期细胞的比例则相反.正常大鼠血清处理过的细胞中G2+M期细胞的比例则比其它组明显升高.大鼠血清处理过的细胞中DNA含量明显高于胎牛血清培养的细胞,而烧伤后的大鼠血清处理过的细胞中DNA含量则明显高于正常大鼠血清处理过的细胞.而烧伤后3d的大鼠血清处理过的细胞的凋亡率比其它组细胞明显升高.结论:大鼠血清比胎牛血清能更好地促进大鼠体外培养的骨髓基质细胞生长;烧伤大鼠血清内可能含有多种能影响骨髓基质细胞生长的物质,且其含量随烧伤的时间改变而变化,对骨髓基质细胞生长的影响是复杂的.
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BMP-2促进鼠胚成骨细胞VEGF mRNA表达的时间依赖性效应
目的 探讨BMP-2促进鼠胚成骨细胞VEGF表达的时间规律.方法 取19d 胎龄的小鼠胚胎颅骨细胞进行体外培养,采用RT-PCR法检测相同剂量BMP-2(300ng/ml)不同作用时间下对成骨细胞VEGF mRNA表达的影响.结果 RT-PCRIFC法检测表明,BMP-2不同作用时间点VEGF mRNA的表达量不同,呈双对相.6 h时明显升高,约为对照组的2.6倍(P＜0.05).VEGF mRNA 的第2个峰值出现在36 h左右,约为对照组的2倍.48 h时,VEGF mRNA的相对水平仍然保持较高水平.结论 rhBMP-2对VEGF mRNA表达的促进作和呈时间依赖关系,分别在6 h和36 h出现峰值.
关键词： 血管内皮生长因子 重组人骨形态发生蛋白-2 成骨细胞 细胞培养 原代培养 -
鱼藤酮诱导青光眼患者小梁网氧化损伤的研究
目的:原发性开角型青光眼(POAG)是一种发病隐匿的不可逆性致盲性眼病,发病机制有待进一步探讨.本研究通过激光共聚焦显微镜及流式细胞方法检测鱼藤酮对青光眼患者小梁细胞氧化损伤的影响,探讨POAG的发病机理.方法:原代培养POAG患者及正常人小梁网细胞,采用激光共聚焦显微镜、流式细胞技术观察不同浓度鱼藤酮对小梁网细胞内ROS水平的影响.结果:原代POAG患者小梁网细胞内ROS水平明显高于正常人,差异有统计学意义(P<0.05).ROT对GTM小梁网细胞ROS的诱导作用呈时间-浓度依赖性,而正常人原代小梁网细胞NTM经过ROT处理后,结果显示ROT浓度高于5μmol/L时对正常人小梁网细胞内ROS产生有显著诱导作用(P<0.01);而≤5μmol/L时,ROT对NTM细胞内ROS的产生并没有明显诱导作用.在不同浓度下,ROT对原代POAG患者和正常人小梁网细胞ROS的诱导作用相比,均有显著性差异(P<0.01).结论:鱼藤酮诱导小梁网氧化损伤增强,提示线粒体复合物活性下降可能会引起青光眼患者小梁网功能障碍,推测其与眼压升高及POAG发病密切相关.
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青光眼患者小梁网细胞线粒体的电镜观察
目的 原发性开角型青光眼(POAG)是一种发病隐匿的不可逆性致盲性眼病,发病机制有待进一步探讨.本研究通过电镜检测方法从小梁细胞线粒体形态改变及细胞连接的异常认识小梁细胞退行性改变,探讨POAG 的发病机理.方法 原代培养POAG 小梁网(GTM)与正常人的小梁网(NTM)细胞,电镜下对比观察小梁细胞线粒体和细胞连接的形态结构.结果 透射电镜可见培养的NTM 细胞胞质内线粒体数量较多,结构完整,嵴的数目和形态正常,细胞连接以缝隙连接为主,结构完整,并可见丰富的粗面内质网,偶可见高尔基体等细胞器;GTM 细胞线粒体数目少,形状多为空泡状,嵴多不可见,难以找到完整的细胞连接结构,其它细胞器明显减少.结论 (1)POAG 患者小梁细胞的线粒体发生了病理学形态的退行性改变;(2)POAG 患者小梁细胞的细胞连接连接出现了病理学形态的异常.提出POAG 患者小梁细胞线粒体的形态与功能异常以及小梁细胞的细胞连接异常可能导致小梁网功能异常,推测其与眼压升高及POAG发病密切相关.
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三明治构型原代大鼠肝细胞培养细胞极性重建及功能的研究
目的 研究三明治构型培养大鼠原代肝细胞的形态学变化、极性重建过程并对其功能进行测定.方法 改良原位两步法门静脉胶原酶灌注分离单肝细胞,三明治构型培养肝细胞,观察肝细胞的形态学变化,测定特异性膜区域蛋白的重新分布,检测白蛋白mRNA及肝细胞功能.结果 平均每个鼠肝可获取(2～3)×108个肝细胞,活率在93%±3%,纯度在96%±3%.培养6～8 h后,肝细胞排列成肝索样结构.3 d后,白蛋白mRNA表达明显增强.4 d后,DPPIV几乎完全集中在胆小管膜区.5 d后,胆小管完全连接成网络.形态维持达49 d以上.结论 三明治构型肝细胞培养体系更接近于肝细胞体内生长环境.肝细胞可在较长时间内保持良好的形态结构和功能.
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大鼠良性增生前列腺腺上皮细胞系的建立
目的 探讨大鼠良性增生前列腺腺上皮细胞系的建立方法. 方法 2011年12月至2012年12月选取13周龄雄性自发性高血压大鼠20只,屏障环境下常规饲养至29周龄.取大鼠前列腺组织行苏木精-伊红染色鉴定前列腺上皮增生情况.取前列腺腹侧叶组织,剪碎后用Ⅰ型胶原蛋白酶消化,收集细胞,分别使用WAJC-404、PrEGM培养液进行体外培养14 d并传代.免疫细胞化学方法(CK8/18)鉴定原代培养的增生前列腺腺上皮细胞的特异性表达.绘制细胞生长曲线,比较两种培养基培养前列腺腺上皮细胞的生长情况. 结果 采用WAJC-404、PrEGM培养基体外原代培养自发性高血压大鼠前列腺腺上皮细胞均达14 d,并成功纯化和传代.免疫细胞化学实验证实原代培养的增生前列腺腺上皮细胞特异性表达细胞角蛋白CK8和CK18.细胞生长曲线显示:PrEGM培养基培养的腺上皮细胞与WAJC-404培养基相比,细胞形态更好,细胞活力更为旺盛,进入对数生长期的时间更短(4d与7d),细胞生长曲线平均峰值更高(15.3× 104/ml与12.8× 104/nl). 结论 大鼠良性增生前列腺腺上皮细胞系可体外构建,PrEGM培养基比WAJC-404培养基更适合该细胞系的建立.
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烧伤血清对大鼠主动脉血管内皮细胞活力影响的实验研究
目的 检测烧伤血清培养大鼠主动脉血管内皮细胞不同时间后血管内皮细胞活力的变化.方法 制做大鼠30％总体表面积Ⅲ度烫伤模型,制取烧伤血清备用;应用大鼠主动脉血管内皮细胞原代培养技术培养血管内皮细胞,随机数字表法分为14份、共2组:对照组和烧伤血清组,对照组用正常大鼠血清培养,烧伤血清组采用烧伤血清培养.运用四甲基偶唑氮法结合酶标仪测定两组大鼠主动脉血管内皮细胞培养0.5、1、2、4、6、8、10 h后吸光度值表示血管内皮细胞的细胞活力,并计算细胞增殖抑制率.结果 烧伤血清组大鼠主动脉血管内皮细胞经烧伤血清培养0.5、1、2、4h后,其细胞活力与对照组相比,差异均有统计学意义(P均小于0.05),烧伤血清组大鼠主动脉血管内皮细胞经烧伤血清培养6、8、10 h后,其活力与对照组相比较,差异均无统计学意义(P均大于0.05),细胞增殖抑制率分别为22％、18％、25％、23％、3％、2％、5％.结论 烧伤血清对血管内皮细胞作用一定时间内细胞损伤较为明显,而超过一定时间后细胞损伤变小.
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辛伐他汀对成骨细胞骨形态发生蛋白表达及碱性磷酸酶活性的影响
近来有研究发现目前广泛用于治疗高胆固醇血症的他汀类药物可以引起成骨细胞系骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)的高表达[1].在临床的回顾性研究中发现,他汀类药物可以有效地降低股骨颈骨折的发病率[2],但具体作用机理尚不清楚.辛伐他汀对原代培养的成骨细胞BMP-2表达及碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性的影响如何.
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肠上皮细胞缺血缺氧凋亡模型的实验研究
我们建立了以体外人工基底膜为表衬的肠上皮细胞(IEC)原代培养,模拟临床缺血缺氧损伤后IEC的脱落凋亡变化的实验模型,报道如下.
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脂肪来源的干细胞研究现状及应用
白癜风是皮肤科门诊的常见疾病,发病率约1 %～2 %,因为病因不明,所以白癜风的治疗在临床上一直是一个棘手难题.对白癜风的治疗有多种选择,但疗效大都不令人满意.黑素细胞(melanocyte,MC)移植是国内外比较前沿的治疗方法,特别是通过原代培养获得一定数量的MC,治疗面积较大的白癜风.
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表皮黑素细胞专用培养基组分与细胞外信号调节激酶蛋白磷酸化关系初步观察
目的 了解表皮黑素细胞专用培养基HU16中维持细胞生长的主要物质人重组碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、FBS和环腺苷酸激动剂与细胞外信号调节激酶(ERK1/2)蛋白磷酸化的关系.方法 从环切包皮原代培养人表皮黑素细胞,用western blot检测去bFGF、去FBS以及去环腺苷酸激动剂培养基培养后ERK1/2蛋白磷酸化水平的改变.结果 去bFGF和去FBS处理后,表皮黑素细胞ERK1/2蛋白的磷酸化水平明显下降(P<0.05),恢复完全培养基培养后0.5 h,ERK1/2蛋白的磷酸化水平即重新上升至处理前水平.去环腺苷酸激动剂处理后,ERK1/2蛋白的磷酸化水平无明显改变.结论 HU16培养基中bFGF和FBS的浓度可影响体外培养的人表皮黑素细胞中ERK1/2蛋白的磷酸化水平.
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应用微小组织块法培养和胰酶滤纸片克隆消化法建立人子宫内膜癌细胞系的研究
目的 探讨联合应用胰酶消化+微小组织块法培养及胰酶滤纸片克隆消化法纯化建立人子宫内膜癌细胞系方法的可行性.方法 取3例子宫内膜癌患者的子宫内膜腺癌组织,采用胰酶消化+微小组织块法进行原代培养,并通过胰酶滤纸片克隆消化法提纯腺上皮癌细胞继续培养;在倒置显微镜下观察细胞形态,行HE和免疫荧光染色对细胞进行鉴定,绘制生长曲线.结果 3例患者均1次成功提纯癌细胞,其中1例传代至第5代,1例传代至第3代.1例子宫内膜低分化腺癌细胞体外培养成功,命名为EAG3,并子宫内膜稳定生长传代至20代,细胞生长曲线为“S”形.通过HE染色与原组织病理学比较及免疫荧光细胞法检测角蛋白CK表达阳性,均证实原代细胞为腺上皮恶性肿瘤来源.结论 应用胰酶消化+微小组织块培养能缩短原代细胞贴壁时间,应用胰酶滤纸片克隆消化法可以更快捷完成子宫内膜腺癌细胞纯化建系的过程.
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新生大鼠海马神经元细胞体外培养方法改良研究
目的：探讨改良的新生大鼠海马神经元细胞体外培养方法，为新生儿缺血性脑损伤模型等海马神经元相关疾病研究奠定基础。方法采用本研究自行设计的改良新生大鼠海马神经元细胞的体外培养方法，进行新生大鼠海马神经元细胞的体外培养。判断新生大鼠原代海马神经元细胞体外培养成功的标准为：荧光显微镜下，可见微管相关蛋白(MAP)2在海马神经元细胞体和树突中表达。该改良方法具体为：①以 L-多聚赖氨酸和鼠尾胶原作为神经元细胞体外培养的生长基质，分离出生24 h 内新生 SD 大鼠海马结构。将其运用单一胰蛋白酶水浴振荡消化后，吹打成细胞悬液，将海马神经元细胞以适当的密度种植于含10%胎牛血清 DMEM 培养基中，贴壁培养4 h 后，更换为Neurobasal 维持培养基继续培养，以后每3 d 更换1/2培养液。②采用抗 MAP2-5-异硫氰酸荧光素(anti-MAP2-FITC)免疫荧光法，对所获得的海马神经元细胞进行鉴定。结果①新生大鼠海马神经元细胞的体外培养结果显示，新生大鼠海马神经元细胞于培养30 min 时，大部分细胞贴壁生长，培养2 h 后，细胞贴壁明显，少数细胞开始长出突起。于培养5 d 后，神经元突起进一步增多，并形成神经细胞网络，培养7 d 后，神经元细胞分化更加成熟，神经元细胞之间的突起联系更加紧密，可见密集的神经细胞网络。海马神经元细胞体外培养至第21天后，神经元细胞开始退化、变性，细胞体皱缩，残留细胞体痕迹，周围光晕消失，折光性减弱，突起融合而粗大杂乱，神经细胞网络粗大老化。②anti-MAP2-FITC免疫荧光法对所获得的海马神经元细胞进行鉴定的结果显示，在所有细胞中，免疫荧光染色 MAP2阳性新生大鼠海马神经元细胞纯度达96.3%。结论通过上述改良方法培养获得的新生大鼠海马神经元细胞生长状态良好，并具有较高的纯度，可为进一步进行新生儿缺血性脑损伤模型等海马神经元相关疾病的研究提供实验条件。
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人卵巢上皮癌微血管内皮细胞分离培养与鉴定
目的:建立人卵巢上皮癌微血管内皮细胞的原代分离纯化及培养方法.方法:收集2012-03-01-2012-10-31山东省肿瘤医院妇瘤科手术切除的卵巢上皮癌标本21例,采用胶原酶消化法分离人卵巢上皮癌微血管内皮细胞,免疫磁珠法提取纯化内皮细胞.采用形态学观察,免疫荧光技术及自发管腔形成实验对提取的内皮细胞进行鉴定；流式细胞仪检测细胞纯度；MTT法测定细胞增殖并绘制细胞生长曲线.结果:提取人卵巢微血管内皮细胞呈圆形或类圆形,周围有抗CD31免疫磁珠附着,活细胞计数测定＞95％,流式细胞仪检测纯度＞95％,细胞贴壁后呈长梭形、星形或多角形,胞内含有CD31磁珠,3～6 d细胞间互相融合呈单层片状生长,铺满后呈典型铺路石样特征,荧光显微镜下观察表达内皮细胞特异性标志vWF,管腔形成实验证实体外有二维管腔形成.通过观察发现,内皮细胞24 h内贴壁,7～11 d可完全融合并出现接触抑制现象.通过MTT法测定内皮细胞生长分为增殖期、对数增长期和平台期3个阶段,生长曲线为“S”型.结论:应用免疫磁珠法成功建立了一种操作简单,且可获得纯度高和活性好的人卵巢上皮癌微血管内皮细胞分离及原代培养体系.
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X射线对血管平滑肌细胞作用机制的实验研究
目的 研究X射线外照射对体外原代培养的大鼠血管平滑肌细胞（VSMC）生长、增殖的影响及作用机制。方法 体外培养VSMC，给予单次8?MV X射线照射，源皮距为100cm，剂量率400?cGy/min。按照射剂量分为2、5、10、15、20?Gy组，以0?Gy为对照组。分别采用细胞计数法、克隆形成实验、四唑盐（MTT）比色实验、伊红排斥实验、流式细胞术及末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）技术，动态观察对VSMC生长、增殖、死亡率、凋亡的影响。结果 ①照射后24?h VSMC数降低，72?h后明显恢复（P<0.05）。②照射后48?h内VSMC吸光度（A570）值降低，72?h 2、5?Gy组A570值升高，而10、15、20?Gy组升高不明显（P<0.05）。③72?h内10、15、20?Gy组VSMC死亡率较高，6?d后，各剂量组死亡率下降至较低水平（P<0.05）。④克隆形成实验提示X射线照射可直接导致DNA链断裂，引起细胞死亡。⑤碘化丙啶（PI）染色流式细胞仪直方图上可见亚二倍体峰，TUNEL法阳性细胞核呈棕黄色，荧光镜下可见凋亡小体。结论 X射线外照射可抑制VSMC的生长和增殖，可能通过两种不同的机制即致死性和（或）亚致死性损伤及诱导凋亡导致VSMC死亡。为应用放射治疗防治血管成形术后再狭窄提供了理论依据。
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骨髓间充质干细胞对酒精诱导海马神经元损伤的作用研究
目的 通过体外观察骨髓间充质干细胞(BMMSC)对酒精诱导海马神经元损伤的作用,初步探讨BMMSC治疗酒精性痴呆(AAD)的可行性.方法 取胎鼠海马进行原代神经元培养并进行神经元纯度鉴定.酒精组给予100 mol/L酒精37℃培养24h,建立酒精诱导海马神经元损伤模型;BMMSC+酒精组在其培养液中同时加入BMMSC条件培养液(终浓度为50％)及100 mol/L酒精,37℃培养24 h;另设相同浓度的BMMSC条件培养液对照组(BMMSC组)及空白对照组(对照组).采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测各组细胞存活率,以碘化丙啶(PI)/Hoechst33342染色观察细胞形态及凋亡情况.结果 原代培养的海马神经元高表达神经元特异性烯醇化酶(NSE),低表达神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP),提示成功培养了纯度较高的原代海马神经元.酒精组细胞存活率(0.80±0.09)低于对照组(1.00±0.11;t=4.128,P＜0.01)及BMMSC组(1.04±0.07;t=-6.052,P＜0.01);BMMSC+酒精组细胞存活率(0.92±0.11)高于酒精组(t=2.555,P＜0.05).BMMSC组及BMMSC+酒精组细胞存活率与对照组比较差异无统计学意义(均P＞0.05).酒精组可见较多的细胞核呈致密浓染及核碎裂的凋亡细胞,BMMSC+酒精组的凋亡细胞数量明显减少.结论 BMMSC可抑制酒精诱导的海马神经元凋亡发生,提示BMMSC移植治疗AAD可能具有一定可行性.
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不同浓度的Aβ(25～35)对原代培养的大鼠基底前脑胆碱能神经元生长存活及TrkA表达的影响
阿尔茨海默病(AD)是一种中枢胆碱能神经系统退行性变引起的以进行性痴呆为主要临床特征的老年性疾病.
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组胺诱导胶质瘤原代培养细胞凋亡的实验研究
目的观察组胺诱导人脑胶质瘤原代培养细胞凋亡的作用,探讨组胺诱导人脑胶质瘤原代培养细胞凋亡与钙离子内流之间的关系.方法取手术中获得的新鲜脑胶质瘤组织,加入含10%小牛血清的1640培养液中培养;取生长良好的细胞分别加入含0.01mg/ml,0.05mg/ml和0.1mg/ml不同浓度组胺的培养液,进行细胞的原代培养.激光共聚焦显微镜检测细胞膜内游离钙离子浓度;流式细胞仪检测不同浓度组胺作用下细胞的凋亡率.结果加入含0.05mg/ml和0.1mg/ml组胺培养液的人脑胶质瘤原代培养细胞内游离钙离子浓度明显升高,诱导细胞凋亡,细胞凋亡的发生在一定范围内与加入的组胺呈剂量、时间依赖关系.结论组胺通过增加人脑胶质瘤原代培养细胞内游离钙离子浓度诱导细胞凋亡的发生.
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大鼠血管纹边缘细胞的原代培养及IsK的表达
目的为进一步研究内淋巴生成的可能机制以及影响因素,提供可供研究的大量实验材料-边缘细胞(marginal cell,MC),建立大鼠来源的MC的原代培养体系.方法利用大鼠耳蜗的侧壁组织作为组织块种檀培养.从第2天开始每日倒置显微镜观察,选特征性的表现照相.经选择性消化、差异性贴壁等方法抑制FLC生长,纯化MC.经过MC的形态、生长特征的观察;细胞角蛋白18、波形蛋白的免疫细胞化学;扫描及透射电镜;RT-PCR检测IsK蛋白mRNA的表达等方法鉴定MC.结果新鲜组织块淡黄、透明,可见丰富的毛细血管网;但血管纹结构致密,倒置显微镜下不易分辨不同细胞的轮廓.MC从组织块迁移出来多在培养第2天,呈多角形外观、核大而圆、颜色较暗淡,细胞之间连接紧密,形成上皮单层时呈"铺路石样"外观.FLC呈梭形,呈"鱼群样"包绕MC生长,增殖速度快于MC.由纯化的MC构成的上皮单层表面可见由成百上千个MC包绕液体而成的dome,这提示MC净向的跨上皮转运功能.原代MC表达细胞角蛋白和波形蛋白,微绒毛丰富、细胞间连接提示其上皮起源.IsK蛋白mRNA的表达证实了培养上皮细胞的MC起源.结论离体培养的耳蜗边缘细胞具有与其在体相同的形态及生理特征.MC原代培养体系的建立,可为进一步探讨边缘细胞的生理功能及某些内耳疾病的病理机制提供良好的研究材料.
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人Bcl-2基因重组腺病毒的构建及其在螺旋神经节细胞中的表达
目的构建表达人Bcl-2基因的重组腺病毒,并研究其在原代培养螺旋神经节细胞(spiral ganglion cells,SGC)的表达特性.方法采用细菌内同源重组法,从pUC-CAGGS/Bcl-2质粒中获得人Bcl-2 cDNA,克隆到腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV上,后者和腺病毒骨架质粒pAdEasy-1在细菌内同源重组,在HEK293细胞中包装成为重组Ad增强型绿色荧光蛋白/Bcl-2腺病毒,电镜观察病毒颗粒,用病毒感染原代培养的大鼠螺旋神经节细胞,在荧光显微镜下观察感染效率,用逆转录聚合酶链反应方法检测Bcl-2基因在螺旋神经节细胞的转录表达,用Western Blot检测其蛋白的表达.结果经酶切鉴定证实重组腺病毒质粒构建成功,电镜显示包装细胞中有大量病毒颗粒存在,呈规则六边形.荧光显微镜下观测到感染病毒的SGC细胞发出明亮的绿色荧光.分别在mRNA水平及蛋白水平证实有外源性Bcl-2 基因的表达.结论细菌内同源重组法是一种简便、高效的制备方法.构建的重组Ad增强型绿色荧光蛋白/Bcl-2腺病毒能有效的感染SGC,并可在SGC中正确地转录和翻译,为进一步研究腺病毒介导的Bcl-2基因对螺旋神经节损伤的保护作用奠定基础.
