hBMP-2转染自体兔骨髓基质细胞附和异体兔脱钙骨基质的成骨实验研究

目的探讨人骨发生蛋白2(hBMP-2)转染兔自体骨髓基质细胞(rMSCs)的骨生成诱导作用以及附和异体兔脱钙骨基质(DBM)后的成骨效能.方法取兔自体骨髓基质细胞培养扩增,用脂质体介导的方法转染人骨发生蛋白2基因,将转染和未转染人骨发生蛋白2基因的自体骨髓基质细胞附和于异体兔脱钙骨基质形成新的生物植骨材料,连同空白及单纯脱钙骨基质对照组植入兔前肢肌袋和桡骨缺损.2、4、6、8周分别取材进行大体、放射线和病理观察.结果肌袋试验6周后,转染人骨发生蛋白2基因的自体骨髓基质细胞附和异体兔脱钙骨基质材料中出现骨组织细胞,未转染组和单纯异体兔脱钙骨基质组为纤维组织.骨缺损试验中,三组均能产生骨的形成和缺损的修复,但仍然是转染复合材料组的骨修复再生能力大.结论局部应用hBMP-2基因转染的rMSCs-DBM材料可以诱导骨形成促进骨修复.

hBMP-7基因直接体内转染修复兔桡骨缺损实验研究

目的探讨含人骨形态发生蛋白7(hBMP-7)基因逆转录病毒液与左旋聚丙交酯(PLLA)生物材料复合后修复兔桡骨缺损的效果.方法制备含hBMP-7真核细胞表达载体的逆转录病毒液PT-PLNCX2-BMP7.制备新西兰大白兔桡骨1.5 cm缺损模型,修复实验分为4组:PT-PLNCX2-BMP7+PLLA修复组,空载体(PT-PLNCX2)+PLLA修复组,单纯PLLA生物材料修复组,空白组.每组6个样本.分别于术后8、12、16周进行大体观察、X线检测和组织学检测.结果PT-PLNCX2-BMP7重组病毒液与生物材料复合修复组可见在骨缺损处有骨性连接形成,组织学观察见有大量新生骨组织形成,而PT-PLNCX2病毒液修复组、单纯材料修复组和未修复组均未见骨性连接形成,仅在部分骨缺损两断段形成少量骨组织.结论利用hBMP-7基因体内局部、直接转移的方法能够用于兔桡骨缺损的修复.

重组人IL-1Ra与TGF-β1联合基因体外转染兔膝关节软骨细胞的研究

背景:多基因联合转染具有增强功能基因协同效应、消除短板差异等作用,因而目前被受到广泛重视.目的:观察以逆转录病毒(RV)为载体,介导白介素-1受体拮抗蛋白(IL-1Ra)基因单独转染及其与转化生长因子-β1(TGF-β1)基因共同转染兔膝软骨细胞后的表达,及对其增殖代谢的影响.方法:构建逆转录病毒载体PLNCX-IL-1Ra-GFP与PLNCX2-TGF-β1-RFP,将其转染至包装细胞PT67,待形成阳性克隆后扩增培养,收集病毒上清,并计算病毒上清滴度.将体外培养的软骨细胞分为空白转染组、PLNCX2空载体转染组、IL-1Ra单基因转染组及IL-1Ra+ TGF-β1双基因转染组.酶联免疫吸附分析法(ELISA)进行瞬时基因表达(细胞转染后48h)及稳定基因表达(筛选后4周)的检测；免疫组织化学染色法检测各组IL-1Ra、TGF-β1及Ⅱ型胶原的表达；流式细胞仪检测各组细胞生长周期比例.结果:PLNCX2-IL-1Ra-GFP与PL NCX2-TGF-β1-RFP转染包装细胞后分别有绿色荧光与红色荧光表达；空白组与PLNCX2空载体转染组的上述指标无统计学差异(P＞0.05)；ELISA检测示基因转染组有明显基因表达；与空白组及PLNCX2空载体转染组相比,双基因转染组IL-1Ra、TGF-β1、Ⅱ型胶原含量明显提高,IL-1Ra基因转染组IL-1Ra含量提高明显,但TGF-β1、Ⅱ型胶原含量提高不明显；双基因转染组软骨细胞位于S期的比例明显增高,与其他组比较有统计学差异(P＜0.05).结论:逆转录病毒载体构建成功,基因转染软骨细胞后可获得稳定表达,双基因转染的软骨细胞生物学活性优于单基因转染,为基因治疗骨关节炎(OA)的研究提供实验基础.

骨形成蛋白7重组腺病毒的构建及诱导成骨的研究

目的 探讨骨形成蛋白7(BMP7)重组腺病毒异位诱导成骨的作用.方法 将BMP7基因克隆到转移载体pAdTrack-CMV中,在细菌BJ5183中与pAdEasy腺病毒基因组进行同源重组,得到BMP7重组腺病毒基因组,通过转染HEK293细胞包装出重组腺病毒,然后在裸鼠小腿肌肉中进行异位诱导成骨实验.结果 经过PCR及酶切鉴定证明获得了BMP7转移质粒pAdTrack-BMP7和BMP7重组腺病毒基因组,并包装出重组腺病毒.组织学观察显示2周时实验局部大量纤维样细胞聚集,软骨细胞分化,5周时骨小梁形成,软骨细胞已退化.结论 BMP7重组腺病毒的构建以及其异位诱导成骨的成功,为BMP7基因治疗的研究提供了确切的实验依据.

椎间盘退变生物治疗进展

临床上椎间盘退行性疾病在保守治疗基础上,大多数需要通过外科干预达到长期缓解局部疼痛的目的.但由于椎间盘生物力学上的特殊地位,使得如何在保持椎间盘完整性的基础上,促进椎间盘细胞外基质再生的生物治疗方法成为椎间盘退变预防和治疗的研究热点.椎间盘髓核基质数量和成分的改变被认为是椎间盘退变的一个重要原因,目前许多学者试图通过引入各种外源性生长因子、种子细胞、基因以及基因转染的细胞,以期增加髓核细胞外基质含量,恢复II型胶原和蛋白多糖比例,逆转或延缓椎间盘退变的发展进程.

TK基因转染骨肉瘤U-2细胞体外实验研究

目的 研究脂质体介导的TK/GCV系统对人骨肉瘤细胞的杀伤作用及其产生的旁观者效应.方法 构建重组质粒pIRES-EGFP-tk,制备和转化感受态大肠杆菌BL21以及鉴定测序,提取、纯化重组质粒DNA,培养和转染人骨肉瘤细胞株U-2 OS,流式细胞仪分析和荧光倒置显微镜下观察细胞生长状态,用转染后的培养液的上清加入TK (-) U-2 OS中观察旁观者效应.结果 成功地构建出包含有TK基因cDNA片段的重组质粒pIRES-EGFP-tk,通过PCR等方法鉴定质粒大小和位点均符合实验设计.荧光显微镜下观察U-2 OS (TK+)呈现绿色荧光.U-2 OS TK/GCV培养上清液可明显诱导细胞凋亡.但将上清液用0.2μm的滤膜滤过后,诱导凋亡作用消失.结论成功构建重组质粒pIRES-EGFP-tk,体外实验表明人骨肉瘤细胞系U-2 OS对脂质体介导的TK/GCV系统敏感,并且有明显的旁观者效应,可望成为骨肉瘤基因治疗的新途径.

ULBP3基因转染提高人外周血NK细胞对人成骨肉瘤Saos-2细胞的杀伤活性

目的观察ULBP3基因转染对人外周血NK细胞对Saos-2细胞杀伤活性的影响.方法用RT-PCR方法从人成骨肉瘤组织中提取ULBP3基因,构建pcDNA3真核表达质粒,以Lipofectamine为载体转染人成骨肉瘤Saos-2细胞,用percoll密度梯度离心法分离人外周血NK细胞作为效应细胞,以Saos-2细胞和转染ULBP3基因的Saos-2细胞作为靶细胞,进行体外杀伤实验,比较两组的特异性杀伤率.结果在效靶比为30:1时人外周血NK细胞对转染ULBP3基因的Saos-2细胞的特异性杀伤率明显高于对照组.结论ULBP3基因转染能提高人外周血NK细胞对人成骨肉瘤Saos-2细胞的杀伤活性.

肿瘤基因治疗中腺病毒载体的转导靶向

重组DNA技术的发展使得肿瘤基因治疗的应用范围越来越广泛,已有部分代替那些传统疗法(外科手术、化疗和放疗)的趋势.但目前存在两个重要的问题需要解决:(1)现有的载体系统缺少组织特异性;(2)现行的基因疗法的基因转染的效率比较低.这在很大程度上制约了肿瘤基因治疗的应用.为了克服这两个难题,我们需要人工构建新型的,具有特异靶向及高效率转染等特性的载体系统.腺病毒作为目前基因治疗中常用的载体系统中的一员,对其的改造和修饰已引起了很多人的关注,而且也构建出了一些高效率的具有特异靶向性的腺病毒载体.在这里将详细的介绍这些新颖的腺病毒载体.

负载SOX-9的大鼠脂肪干细胞成软骨分化的实验研究

目的 SOX-9基因转染大鼠的ADSCs(Adipose stromal cells,ADSCs),诱导其向软骨细胞分化,为软骨组织工程学种子细胞提供新方法.方法 分离、培养大鼠的ADSCs,免疫荧光法进行鉴定;SOX-9基因转染ADSCs,对转染后细胞进行筛选;MTT法测定筛选后细胞的增殖活性;RT-PCR、Western blot对筛选后细胞的表达进行检测.结果 成功分离、培养大鼠的ADSCs;细胞表面标志物CD29和CD44表达阳性,CD106和CD34表达阴性;基因转染后细胞的增殖力变强;转染SOX-9的ADSCs在目的基因SOX9、Aggrecan、Collagen Ⅱ mRNA的表达和软骨特异性基质-Collagen Ⅱ的分泌上明显高于转染空载体组和对照组;结论 SOX-9基因转染后ADSCs具有了软骨细胞的表型特征,可以用作软骨组织工程的种子细胞.

犬同种异体椎间盘复合髓核细胞移植初探

目的:探讨同种异体椎间盘复合髓核细胞移植的转归,观察转人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)基因髓核细胞介入椎间盘移植的生物学效应.方法:常规分离8周龄比格犬髓核细胞,将PKH-26标记的传2代髓核细胞(NPc)和转hTERT基因髓核细胞(hTERT-NPc)分别注射入冷冻保存的同种异体椎间盘内构建组织工程化同种异体椎间盘.选择12月龄同种犬18只随机分为3组,分别植入hTERT-NPc组织工程化的同种异体椎间盘(A组)、NPc组织工程化的同种异体椎间盘(B组)以及未组织工程化的同种异体椎间盘(C组).每只犬于术后4、8、12周行正侧位X线片及MRI检查,观察移植椎间盘同宿主椎体愈合情况、移植椎间盘高度和信号变化情况；手术后12周麻醉状态下处死实验动物取L1 ～L7段脊柱标本进行生物力学测试,取移植椎间盘进行组织学观察.结果:X线及MRI检查结果显示3组移植椎间盘与宿主椎体均实现了良好的骨性融合,其中C组椎间盘术后出现了呈进展趋势的退行性改变,至移植后12周,其椎间盘高度及髓核信号比灰度值明显低于A、B两组(P＜0.05).生物力学显示术后12周时,C组移植椎间盘在屈伸和旋转方向的活动度显著性大于A、B两组(P＜0.05),A组与B组无显著性差异(P＞0.05).激光共聚焦显微镜观察到A、B组移植椎间盘髓核区域内有红色荧光细胞；光学显微镜下观察A、B两组移植椎间盘结构保持较好,外形类似软骨细胞的髓核细胞数量较多,排列较为规则；C组髓核形态保持欠佳,结构较为紊乱,髓核细胞数量明显减少,细胞形态欠饱满,退行性改变明显.RT-PCR分析显示术后12周时A组髓核内可检测到hTERTmRNA的阳性表达.结论:犬同种异体椎间盘移植后可在宿主体内存活,通过复合NPc可延缓椎间盘移植后的退行性改变；hTERT-NPc介入具有更好的保持异体椎间盘功能的潜力,有望保证同种异体椎间盘移植的远期疗效.

转染HGF基因对肝细胞的生物学效应

目的探讨肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)基因对肝细胞生长增殖能力的影响.方法通过脂质体介导法,将HGF基因导入肝细胞中.用荧光显微镜以及原位杂交观察到HGF基因表达.采用检测细胞生长曲线、Ki-67蛋白和嗜银蛋白免疫组化观察肝细胞生长增殖能力及DNA合成能力的变化.结果荧光显微镜观察可见到绿色荧光蛋白的表达,用原位杂交方法进一步证实了HGF蛋白在细胞中的表达.细胞生长曲线显示,转染HGF基因的肝细胞增殖速度明显增快,Ki-67蛋白和嗜银蛋白表达明显增多,提示转导HGF基因使肝细胞增殖活性增加.结论本实验显示转染的HGF可表达并有促细胞分裂活性.为进一步了解HGF分子生物学特性及治疗应用提供了理论基础.

pLNCX-SOD基因转染大鼠肝细胞对梗阻性黄疸损害的保护

目的探讨pLNCX-SOD基因转染大鼠肝细胞对梗阻性黄疸(梗黄)损害的保护作用.方法转染培养的大鼠肝细胞,克隆、筛选及鉴定阳性克隆,PCR法、Western-blot印迹分析检测SOD基因表达,MTT比色法检测pLNCX-SOD基因转染肝细胞对胆汁、梗黄大鼠血清毒性损害的保护.结果2%浓度胆汁SOD转染的肝细胞抑制率由12h的78.80%±12.35%下降到43.35%±9.69%,24 h由82.55%±11.27%下降到-39.54%±15.13%,48 h由83.83%士18.69%下降到-48.32%±15.25%,P＜0.01;对2.5%浓度的梗黄血清对抗作用明显,抑制率由12 h的89.72%±1.53%下降到14.68%±14.33%,24 h由92.2%±11.27%下降到41.39%±7.66%,48 h由94.25%±8.96%下降到22.71%±4.38%,P＜0.01.结论pLNCX-SOD基因转染肝细胞对梗黄损害具有保护作用.

功能性β1整合素-GFP融合蛋白稳定过表达肝癌细胞系的建立

目的 建立β1整合素-绿色荧光蛋白(GFP)稳定过表达人肝癌细胞系并检测其对各基质蛋白的黏附能力.方法 构建β1整合素-GFP融合蛋白真核细胞重组表达质粒,并将其转染至人肝癌Hep3B细胞,建立稳定过表达β1整合素的肝癌细胞系.利用RT-PCR,Western印记,免疫沉降和荧光显微镜观察融合基因;检测转染细胞的增殖情况及对各基质蛋白的黏附能力.结果 获得β1整合素-GFP融合蛋白稳定转染过表达Hep3B细胞系;转染的β1整合素能与内因性α1,α5,α6整合素亚型形成二聚体;转染β1整合素对细胞增殖无明显影响,但使细胞对各基质蛋白的黏附能力明显增高.结论 建立了功能性β1整合素-GFP稳定过表达的人肝癌细胞系,为进一步研究β1整合素基因的功能提供了一个有效的细胞系.

人α-肿瘤坏死因子基因在胆管癌细胞中的表达研究

我们利用阳离子脂质体、逆转录病毒载体介导人TNF-α基因转染进入胆管癌细胞,并实现了表达.1.材料和方法:(1)质粒和主要试剂:重组逆转录病毒huTNF-α质粒由宝生物大连公司提供;人胆管癌细胞按王曙光等[1]方法经胰酶消化、贴壁生长,以10%小牛血清和DMEM培养液中,在体积分数为5% CO2浓度、饱和湿度及37℃条件下培养;Lipofect AMINE reagent ,TransIT-LT1购自日本Mirus公司;G418购自美国GIBCO/BRL公司;huTNFα抗体购自中山公司;其他试剂为分析纯.PCR引物、huTNF-α基因序列测定均由大连TAKARA公司合成.

腺病毒介导的基因转染对小鼠睾丸精子发生和生殖能力的影响

E1AF基因对LNCaP细胞生长特性的影响

E1AF是Ets癌基因家族的新成员.Ets基因的过度表达使细胞侵袭能力增强.我们将E1AF基因转染LNCaP细胞,观察其对LNCaP细胞生长特性的影响.报告如下.材料与方法主要试剂、PCR引物及E1AF基因转染方法见参考文献[1].

β-葡萄糖醛酸苷酶基因转染人膀胱癌细胞的生物学观察

β-葡萄糖醛酸苷酶(β-glucuroni-dase,βG)是一种酸性水解酶,参与机体的生理、病理及药物代谢等过程,能特异性水解葡萄糖醛酸苷的糖苷键,释放出葡萄糖醛酸和配基.

反义PCNA联合wt-p53基因转染抑制膀胱癌细胞生长的实验研究

我们通过共转染方法观察了反义增殖细胞核抗原(PCNA)联合野生型p53(wt-p53)基因对膀胱癌EJ细胞体外生长活性的抑制作用及其分子机制,现报告如下.

骨髓间充质干细胞联合血管内皮生长因子基因治疗肢体缺血的实验研究

目的 观察骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cell,BMSC)联合血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)基因治疗对家兔肢体缺血模型的疗效.方法 切除新西兰兔右后肢全长股浅动脉并结扎股深动脉以建立兔后肢缺血模型,随机分为空质粒对照组(EP组)、骨髓间充质干细胞组(BMSC组)、VEGF基因治疗组(VEGF组)及联合治疗组(BV组),每组各8只.分别于治疗后28 d及30 d进行动脉造影及VEGF免疫组化染色.结果 EP组、BMSC组及VEGF组的新生血管计数组间比较差异无统计学意义(P＞0.05).BV组的新生血管计数较其余3组明显增加,差异有统计学意义(F=35.47,P＜O.01).BMSC组及VEGF组的VEGF免疫组化染色呈阳性表达,与EP组比较差异有统计学意义(F=764.32,P＜0.01).BV组的VEGF免疫组化染色呈强阳性表达,与其余3组比较差异有统计学意义(F =764.32,P＜0.01).结论 BMSC联合VEGF基因治疗兔肢体缺血可使VEGF获得稳定而有效的表达,从而改善肢体缺血.

Fas基因转染联合顺铂对直肠癌细胞杀伤作用的研究

目的探讨Fas基因转染联合顺铂对直肠癌细胞的杀伤作用. 方法采用RT-PCR技术从健康人的外周血单核细胞中扩增包含全部阅读框架的Fas全长基因,与pGEM-T Easy质粒连接,经测序验证.构建pcDNA3.1-Fas真核表达载体,将人Fas基因通过脂质体导入直肠癌8348细胞中,并利用RT-PCR方法检测直肠癌8348细胞的Fas基因mRNA表达.用MTT法分析顺铂对转染前后直肠癌细胞抑制增殖和诱导凋亡的作用. 结果 Fas基因转染可明显增强直肠癌8348细胞的Fas表达,分别用1、5、10、20、40mg/L浓度的顺铂作用,转染Fas基因的8348细胞实验组细胞抑制率分别为47.2%、51.8%、57.2%、65.4%、71.0%;未转染Fas基因的8348细胞对照组细胞抑制率分别为29.6%、33.0%、37.8%、41.4%、47.0%,2组相比,差异有显著性意义(t=15.33,P<0.01). 结论转染的Fas基因可显著上调直肠癌8348细胞的Fas表达,促进细胞凋亡,Fas基因转染联合顺铂对直肠癌细胞有更强的杀伤作用.