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DC-CIK免疫治疗在原发性肝癌治疗中的应用进展〔1〕
原发性肝癌（ PLC，以下简称肝癌）是全球第五位常见恶性肿瘤，高居全球肿瘤致死病因第三位，其中约55豫发生在中国［1］。目前肝癌的主要治疗手段是以手术为主辅以介入治疗、化学栓塞治疗、生物靶向治疗等方式的综合治疗。其中，手术切除和肝移植是根治手段，但仅有15豫的患者有机会接受根治手术治疗，即使接受根治手术的患者，其5年复发率仍高达60豫［2］。因此探索肝癌新的治疗手段具有很重要的意义。随着分子生物学和肿瘤免疫学的发展，以及对肿瘤发病机制的研究，发现肿瘤的发生、发展、转移、复发与机体的免疫功能密切相关［3-4］。因此专注于打破免疫耐受、恢复和激活机体抗肿瘤免疫的生物治疗成为了继手术、放疗、化疗后肿瘤治疗的新方法。目前生物治疗主要包括过继免疫治疗、肿瘤疫苗治疗、分子靶向治疗和基因治疗等［2］。其中尤以树突状细胞共培养的细胞诱导的杀伤细胞（ DC -CIK ）免疫细胞为突出。DC -CIK细胞作为新型的免疫活性细胞，与其他过继性免疫治疗细胞相比，具有增殖速度快、杀瘤活性高、杀瘤谱广及非主要组织相容性复合体（ MHC ）限制性等优点［5-6］。目前国内外应用 DC -CIK 细胞治疗与其他治疗手段相结合，用于治疗原发性肝癌，取得了较好的疗效，展示出良好的应用前景。
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肥大细胞和类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞共培养增加致炎因子分泌
为了解肥大细胞在类风湿关节炎(RA)中的发病机制,通过观察肥大细胞对关节成纤维样滑膜细胞(FLS)分泌的细胞因子的影响,探索肥大细胞FLS相互作用在RA发病中的作用.以类胰蛋白酶为标志行免疫组织化学染色,了解肥大细胞在RA关节滑膜中的分布情况.无菌条件下取RA新鲜滑膜组织,分离培养FLS至第3～4代.
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细胞共培养在组织工程研究中的应用及价值
背景:细胞共培养即大程度地模拟机体内环境,在体外观察细胞与细胞之间的相互作用,是组织工程研究的热点.目的:总结并讨论细胞共培养研究在组织工程研究的应用及价值.方法:由第一作者用计算机检索中国期刊全文数据库(CNKI:2000/2010)和Medline数据库(2000/2010),检索词分别为"细胞共培养,骨髓间充质干细胞,神经干细胞,软骨细胞,组织工程"和"Cells co-culture,Bone marrow stem cells,Neural stem cells,Cartilage",语言分别设定为中文和英文.从细胞共培养在骨髓间充值干细胞、神经干细胞和软骨细胞3方面进行总结,对细胞共培养在组织工程研究及应用方面进行介绍.结果与结论:共检索到182篇文章,按纳入和排除标准对文献进行筛选,共纳入30篇文章.结果表明大量细胞共培养的研究,都围绕着大程度地模拟体内环境、维持体内性状,观察细胞与细胞之间相互作用,很多体外细胞共培养的研究结果和进展对于深入了解共培养有重要的指导和参考价值,但有关共培养的新方法新技术,研究结果,新动向和研究热点但仍需进一步分析和总结.
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脱细胞脐静脉基质制备及其与上皮细胞的共培养
目的:探讨脐静脉脱细胞组织基质的制备,以及与上皮细胞共培养后支架材料与细胞间的亲合性能.方法:实验于2004-03/07在第四军医大学唐都医院实验中心完成.采用去污剂脱细胞法,加以改进,取新生儿脐静脉,用区拉通X-100及苯甲基磺酸氟在碱性缓冲液中处理,彻底去除细胞成分,保存弹性蛋白和胶原蛋白等无免疫源性的大分子物质,获得血管脱细胞组织基质,并与上皮细胞共培养.①根据血管支架的组织学要求,观察不同时间脱细胞的程度.②脱细胞血管支架与细胞共培养情况.结果:①脱细胞程度:多步骤血管组织脱细胞方法去除了细胞成分,大分子成分主要是维持血管张力的胶原蛋白和弹性蛋白等间质成分.其抗原性很低,是维持血管强度的主要成分,并且有促进细胞附着和生长的特殊生物信息.②支架结构:经过4 d左右处理的支架可达到佳效果,超过24 h后可观察到部分间质发生断裂,大负载明显下降.③细胞与支架复合情况:倒置显微镜观察上皮细胞与支架材料共同培养48 h后,细胞在支架表面贴附,并生长.培养液在一两天内pH下降,表明细胞生长旺盛.细胞开始生长后沿支架表面爬行,并向基底层浸润.说明支架材料与细胞间有良好的亲合性.结论:脐静脉脱细胞基质的制备是可行的.适宜于上皮细胞的共培养,可以进行动物实验进一步验证.
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间接共培养条件下成熟脂肪细胞诱导成骨细胞成脂横向分化的能力
背景:细胞共培养技术是在体外条件下将细胞与另一种细胞共同培养.对于成骨细胞和脂肪细胞横向分化研究多采用体外条件下成脂诱导液诱导成骨细胞发生横向分化,而忽略了体内环境中细胞互相作用的因素.目的:探讨在Transwell间接共培养条件下成熟脂肪细胞诱导成骨细胞成脂横向分化的能力.方法:①选取小鼠成纤维样3t3-l1前体脂肪细胞进行成脂诱导为成熟脂肪细胞;②实验分组:A组接种成熟脂肪细胞(Transwell间接共培养体系下室),B组接种小鼠成骨样细胞mc3t3-e1(以1:4比例接种到Transwell间接共培养体系上室),C组单独培养的小鼠成骨样细胞mc3t3-e1;③检测指标:分别在7,14,21 d倒置相差显微镜下观察细胞形态变化,检测各组细胞三酰甘油相对含量、成脂目的蛋白PPAR γ 2表达,并进行油红O染色以及茜素红染色观察;以0,24,36 h为截点检测B组与C组细胞增殖抑制率的变化.结果与结论:①培养2周时,3t3-l1细胞由长梭形变为圆形,胞质内脂滴增多呈亮圆形,油红O染色鉴定后备用;②细胞形态:B组共培养7d时呈长梭形,未见透明脂滴:14d时胞质内出现黑色颗粒及小圆形脂滴;21 d细胞形态由长梭形变为椭圆形或圆形,脂滴变大;③茜素红染色:7,14,21 d时B组细胞呈染色区减少的趋势,C组细胞无明显变化均呈大片着色区;④油红O染色:7,14,21 d时,B组细胞染色区呈递增趋势且与时间成正比,C组细胞染色阴性且无明显变化;⑤三酰甘油:6组细胞三酰甘油聚集量呈递增趋势且与时间成正比,B组组间及与A组相比差异有显著性意义(P＜0.05),C组无明显变化(P＞0.05);⑥MTT抑制率:B组细胞增殖抑制率与时间成正比,与C组差异有显著性意义(P＜0.05);⑦Westem blot实验:B组细胞PPARA γ 2蛋白表达量呈递增趋势且与时间成正比,与A、C组相比,差异均有显著性意义(P＜0.05);⑧结果提示,在Transwell间接共培养体系中,成骨细胞在成熟脂肪细胞诱导下呈现出成脂横向分化趋势,其中脂肪细胞代谢产物及细胞因子可明显抑制成骨细胞的增殖能力,其是否可以完全横向分化为脂肪细胞有待进一步研究.
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环氧合酶抑制剂对卵巢肿瘤血管形成的影响
目的 研究环氧合酶(cyclooxygenase,COX)非选择性抑制剂布洛芬和COX-2选择性抑制剂氮-2,环己氧-4,硝基苯-甲级磺胺(NS398)对卵巢肿瘤血管形成的影响,并探讨其作用机制.方法 2007年于北京协和医院,通过体外细胞共培养模型,观察COX抑制剂对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)迁移能力的影响.采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测COX抑制剂对OVCAR3血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)mRNA表达的影响.采用ELISA方法检测COX抑制剂时OVCAR3中VEGF和前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)分泌的影响.结果 两种COX抑制剂都能抑制HUVEC的迁移,抑制OVCAR3细胞中VEGF mRNA的表达和VEGF、PGE2的分泌.经NS398处理后,研究组HUVEC迁移细胞数目明显低于对照组[(39.0±3.8)个/400×视野vs(56.0±4.2)个/400×视野,P<0.05].结论 NS398和布洛芬通过抑制PGE2,在mRNA和蛋白水平下调VEGF的合成分泌,抑制血管内皮细胞的迁移.COX抑制剂可能成为干预卵巢肿瘤血管形成的一个新选择.
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细胞共培养技术及其在干细胞临床研究中的应用
细胞共培养技术是指在体外将各种不同的细胞置于同一培养环境中,近似模拟体内微环境的一种方法.该系统能很好地展现细胞与细胞之间,细胞与微环境之间的联系,在了解细胞内在机制方面具有重要的理论意义.该方法广泛应用于干细胞研究领域.该文就共培养的研究方法及在干细胞领域中的应用作一综述.
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细胞共培养在牙周膜干细胞相关研究中的应用
细胞共培养是一种将不同种类、不同来源的细胞在同一个体系中进行培养、增殖的技术,在细胞间的相互作用、细胞信号转导、细胞功能性间隙连接等方面的研究中有重要作用.近年来,随着组织工程学和干细胞技术的飞速发展,牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)已成为研究热点之一.将PDLSCs与不同的细胞共培养,可研究其免疫调节机制及定向分化作用;在牙周组织工程中,则可为组织修复材料的研究提供技术支持.故本文对目前细胞共培养技术在PDLSCs研究中的应用做一简要综述.
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胃癌细胞血管内皮生长因子RNA干扰对血管内皮细胞生长的影响
目前抗肿瘤血管生成的研究多在动物模型中进行,这样虽然可以模拟肿瘤生长的微环境,但由于受到体内环境诸多因素的影响,促血管生成因子人为表达降低后,血管内皮细胞的生物学行为发生了哪些变化难以明确.采用分泌促血管生成因子的肿瘤细胞与血管内皮细胞共培养可以初步明确这一问题.本研究采用RNA干扰(RNAi)技术观察其抑制肿瘤细胞血管内皮生长因子(VEGF)表达后对血管内皮细胞生长的影响.
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圆形精子细胞的分离和体外成熟
为了探讨联合应用圆形精子细胞分离和体外成熟的方法改善它们的质量和提高受精能力,使用间断梯度离心法分离不成熟的生殖细胞,然后与Vero细胞共培养将圆形的精子细胞变成为更成熟的形式,总共对87个精子细胞进行了研究,结果表明在后的77个细胞中,仅有12个表现出一定程度的成熟,占7个病人中的3个(42%),在这12个成熟精子细胞中,只有4个发展到早期延长的精子细胞阶段(Scl),但是没有鞭毛.结论:研究表明本文中体外圆形精子细胞的成熟是有限的,精子细胞和圆形精子细胞的受精率和妊娠率比例低,将该方法常规用于临床尚需要技术改进方面的进一步探索.(戴继灿摘译,黄平治校)
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脂联素对不同培养条件下成骨细胞与间充质干细胞中SDF－1／CXCR4表达影响的实验研究
目的：研究不同培养条件下，脂联素对成骨细胞的基质细胞衍生因子（SDF －1）以及间充质干细胞 CXCR4表达的影响。方法提取重组的脂联素蛋白，将10μg／mL脂联素作用于单独培养的 MC3T3－E1以及 C3H10T1／2细胞，Real－time定量 PCR方法检测 SDF－1／CXCR4表达变化；设计 MC3T3－E1及 C3H10T1／2细胞共培养体系，比较共培养对 MC3T3－E1及 C3H10T1／2细胞的 SDF －1／CXCR4表达变化；将脂联素加入共培养体系，比较脂联素对共培养体系中 MC3T3－E1及C3H10T1／2细胞 SDF－1／CXCR4 mRNA表达变化。结果 Real －time 定量 PCR 结果显示：单独培养条件下，脂联素促进了MC3T3－E1细胞 SDF－1 mRNA的表达；而在共培养体系中，脂联素则下调了 MC3T3－E1细胞 SDF－1 mRNA的表达。无论单独培养还是共同培养，脂联素对 C3H10T1／2细胞的 CXCR4表达均起下调作用。结论脂联素对成骨细胞 SDF －1的表达呈双向调节作用，而对间充质干细胞 CXCR4则起下调作用。脂联素通过调节 SDF－1／CXCR4影响间充质干细胞和成骨细胞的微环境。
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Sema4D蛋白高表达与结直肠癌血管形成和临床进展的相关性
目的:探讨轴突导向因子4D(Semaphorin 4D,Sema4D)在结直肠癌组织中的表达及结肠癌细胞分泌Sema4D对血管形成的影响.方法:采用免疫组织化学SP法检测86例结直肠癌组织和52例正常结直肠组织中Sema4D的表达,并分析其与临床病理特征的关系;单纯血管内皮细胞组为空白对照组,结肠癌Lovo细胞和血管内皮细胞共培养组为实验组,应用ELISA检测2组Sema4D蛋白的表达,并观察其对内皮细胞成管的影响.结果:Sema4D蛋白在结直肠癌组织阳性表达率为60％,在正常结直肠组织中阳性表达率为12％,差异有统计学意义(P＜0.05),且Sema4D蛋白表达与组织分化类型、TNM分期和淋巴结转移明显相关(P＜0.05),而与年龄、肿瘤大小无关(P＞0.05);ELISA检测结果显示,对照组和实验组Sema4D蛋白分别为(663.54±21.59)pg/mL、(1 320.99±28.42)pg/mL(P＜0.05);内皮细胞管形成实验显示,对照组和实验组小管数目分别为7.25±1 26、15.25±0.96 (P＜0.05).结论:Sema4D蛋白表达与结直肠癌组织分化类型、TNM分期和淋巴结转移相关;Sema4D蛋白促进内皮细胞管形成.
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成骨细胞与破骨细胞的共培养体系
骨代谢重要的细胞包括成骨细胞和破骨细胞.成骨细胞的作用是成骨,破骨细胞的作用是骨吸收.尽管成骨细胞和破骨细胞可以独自对骨代谢发挥作用,但越来越多的文献提示,这两种细胞通过直接或间接的交互作用,而影响彼此的细胞功能.单独培养的成骨细胞和破骨细胞与共培养的细胞相比,在细胞功能表达上有着明显不同.越来越多的学者开始进行成骨细胞与破骨细胞共培养的细胞学研究,建立了不同的成骨细胞与破骨细胞共培养模式.
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睫状缘色素细胞与骨髓间充质干细胞体外共培养构建视网膜干细胞的初步研究
目的 探索睫状缘色素细胞(pigmented cells from the ciliary margin,PCM)与骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BM)体外共培养构建视网膜干细胞的可行性.方法 按照组织贴壁培养方法分别分离培养原代大鼠BM和PCM,再将二者进行直接共培养(1∶2),观察细胞生长情况;MTT方法进行增殖能力检测;在促神经分化诱导液中诱导21 d后行免疫荧光染色,观察视网膜干细胞相关分子标记物包括视杆细胞Rho1 D4、双极神经元CHX10和Müller胶质细胞10E4的表达.结果原代分离培养的两种细胞生长状态良好;共培养后细胞总体的增殖活性虽然显著低于单纯BM,但比单纯PCM有了一定提升;诱导分化后单纯PCM视网膜干细胞相关分子标记物表达阳性率显著高于BM,而共培养后的细胞表达阳性率显著高于单纯PCM和BM.结论 采用BM与PCM共培养能够获得大量表达视网膜干细胞相关分子标记物的细胞群,有望成为视网膜干细胞来源,用于视神经损伤修复.
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细胞共培养体系及其在骨科基础研究中的应用
随着我国人口逐渐老龄化、环境污染、人们生活习惯改变等因素,骨肿瘤、骨质疏松、骨关节疾病等越来越多的危害到人们的健康[1～2],抗骨质流失,骨、软骨再生修复研究,骨肿瘤治疗药物研发等都急需进一步深入.骨关节系统中许多细胞如软骨细胞、骨间充质干细胞、滑膜细胞、成骨、破骨细胞等细胞的生物特性容易受其他细胞或者细胞活性因子影响发生改变[3～4].在骨关节系统发育过程中细胞阶段性表征和功能改变是骨关节系统正常发育成熟的基础,骨重建过程中存在成骨细胞与破骨细胞密切的相互作用,包括直接接触、细胞旁分泌、及细胞与骨基质作用[5],因此合适的骨科体外研究的需要提供与骨关节系统较为贴切的微环境.
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内皮抑素对胶质瘤细胞迁移的影响
我们在体外利用Transwell共培养系统通过人脐静脉内皮细胞和经鉴定可分泌有生物活性内皮抑素的C6胶质瘤细胞共培养,模拟体内血管内皮细胞和胶质瘤细胞的相互作用,观察内皮抑素对胶质瘤细胞侵袭的影响.
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树突状细胞与细胞因子诱导杀伤细胞共培养体外抗肾癌的效应
细胞因子诱导杀伤细胞(CIK)为非特异性杀伤免疫效应细胞,杀伤活性有待提高.树突状细胞(DC)是目前发现的功能强的专职抗原提呈细胞(APC),可诱发抗原特异性免疫应答.本研究旨在探讨肾癌(RCC)肿瘤冻融抗原致敏的DC与CIK共培养后能否提高DC-CIK细胞对RCC的特异性杀伤活性.
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急性粒细胞白血病MSC体外诱导骨髓单个核细胞药物耐受性
目的：研究急性粒细胞白血病（AML）患者的间充质干细胞（MSC）对骨髓单个核细胞增殖及耐药性的影响。方法：分离AML患者及对照MSC与骨髓单个核细胞共培养，阿糖胞苷药物处理，检测骨髓单个核细胞的增殖活性；流式细胞术检测骨髓单个核细胞凋亡；超速离心提取MSC的外泌体（ exosome），电镜及Western blot检测外泌体；还将外泌体与患者骨髓单个核细胞共培养，检测其对骨髓单个核细的增殖和凋亡的影响。结果：与AML患者的MSC及其外泌体共培养的骨髓单个核细胞，被药物诱导凋亡细胞的数量减少，细胞存活率增高。结论：AML来源MSC对正常骨髓单个核细胞和病人的骨髓单个核细胞有一定的药物耐受性诱导作用，外泌体可能作为载体在此过程中运输某些信号传递分子。
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体外培养的嗅鞘细胞能够促进骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞
目的 探讨体外培养的嗅鞘细胞(OECs)对骨髓间充质干细胞(MSCs)分化的影响.方法 实验分为OECs+MSCs共培养组和MSCs单独培养组,在7 d和14 d两时间点观察MSCs的分化情况.用p75抗体免疫细胞化学染色鉴定OECs细胞的纯度;用巢蛋白(nestin)、神经丝蛋白(NF)、微管相关蛋白2(MAP2)、胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)、突触后膜致密区蛋白(PSD)等抗体免疫细胞化学染色鉴定已分化的细胞表型.结果 体外培养的MSCs经OECs诱导后分化为神经元样细胞,这些细胞能够表达NF、MAP2和PSD等神经元标记物,而不表达星形胶质细胞标记物GFAP.在培养7 d,MSCs+OECs 7 d组的MSCs分化为神经元样细胞的百分率与MSCs 7 d组比较有明显增高.在培养14 d,MSCs+OECs 14 d组的MSCs分化为神经元样细胞的百分率与MSCs 14 d组比较,也有明显增高.结论 体外培养的嗅鞘细胞能够促进骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞.
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黄芪甲苷对Wnt/β-catenin信号通路活化的人滑膜及软骨细胞共培养体系相关因子的调控作用
目的 观察黄芪甲苷对Wnt/β-catenin信号通路活化的人滑膜细胞和人软骨细胞共培养体系相关因子的调控作用,初步阐释黄芪甲苷治疗骨关节炎的分子作用机制.方法 通过β-catenin慢病毒载体转染正常人滑膜细胞,激活其Wnt/β-catenin信号通路.Wnt/β-catenin信号通路活化的人滑膜细胞与正常人软骨细胞置于Transwell小室中共培养.黄芪甲苷混悬液干预共培养体系,采用ELISA方法检测黄芪甲苷对滑膜细胞、软骨细胞培养上清液基质金属蛋白酶-7(MMP-7)、Ⅱ型胶原羧基端肽(CTX-Ⅱ)、软骨寡聚基质蛋白(COMP)表达的影响.结果 黄芪甲苷干预后,ELISA法检测发现滑膜与软骨细胞上清液中MMP-7、CTX-Ⅱ、COMP表达与正常对照相比明显升高(P<0.01).结论 黄芪甲苷可以抑制滑膜细胞Wnt/β-catenin信号通路,下调MMP-7、CTX-Ⅱ、COMP的表达.黄芪甲苷可能通过抑制骨关节炎滑膜Wnt/β-catenin信号通路,改善滑膜炎症、调控滑膜-软骨共同体系微环境、达到抑制软骨降解,促进软骨细胞功能恢复而治疗骨关节炎.
关键词： Wnt信号通路 细胞共培养 MMP-7、CTX-Ⅱ、COMP 黄芪甲苷
