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胚胎大鼠脊髓运动神经元与C2C12肌管体外共培养体系的建立
目的 获得胚胎大鼠脊髓运动神经元与C2C12肌管共培养的条件,在体外建立稳定的神经-肌肉共培养体系,并形成功能性的神经肌肉接头.方法 C2C12成肌细胞株体外扩增培养至60％～70％融合时,用分化培养液诱导分化;取孕15～16 d的SD大鼠,提取胚胎大鼠脊髓前角运动神经元细胞,种植到分化5d的C2C12肌管细胞中,在神经元基础无血清培养液Neurobasal+2％B27中共培养.倒置显微镜下观察各个阶段神经元形态及突起长度的变化、肌管形态变化及收缩特性、神经肌肉接头的形成,应用免疫荧光染色技术检测突触后膜乙酰胆碱受体(acetylcholine receptor,AChR)特异性结合物α-银环蛇毒素(α-bungarotoxin,α-BTX),并采用屏幕录像技术记录共培养体系中肌肉收缩现象.结果 在共培养体系中,原代脊髓运动神经元与C2C12肌管细胞均能存活并进一步分化成熟.3d时,可见运动神经元伸出的轴突延伸至肌管膜表面或包绕肌管;1周时,肌管按同一方向排列,出现广泛的节律性收缩,同时免疫荧光染色结果显示α-BTX特异性结合突触后膜AChR;共培养10d后,运动神经元开始凋亡,肌管细胞逐渐出现萎缩现象.结论 在体外培养条件下,无需特殊培养基和各种营养因子,运动神经元和骨骼肌细胞即可共同生存、生长并进一步发育,建立突触连接,触发一系列神经肌肉接头信号转导,引发肌管节律性收缩.
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刺五加皂苷对体外培养大鼠脊髓运动神经元缺氧损伤的保护作用
目的:观察刺五加皂苷(acanthopanax senticosus saponins, ASS)对脊髓运动神经元缺氧损伤有无保护作用,并探讨其可能机制.方法:对胚鼠运动神经元进行原代分离培养,免疫组化鉴定后建立缺氧诱导的神经元凋亡模型.取运动神经元培养在24孔板中,每组10孔,分为4组:对照组,无缺氧损伤;缺氧损伤组;ASS保护组,缺氧前24 h加入50 μg/ml的ASS;神经胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)保护组,缺氧前24 h加入0.1 μg/ml的GDNF.倒置显微镜及电镜下观察细胞形态学变化;MTT法测定神经元细胞活性;检测细胞外液LDH释放量来观察ASS对神经元细胞膜稳定性的影响.提取细胞匀浆液,Western印迹法检测分析ASS对缺氧的运动神经元HIF-1α表达的影响.结果:形态学观察显示ASS、GDNF保护组神经元缺氧损伤较缺氧损伤组明显减轻.ASS保护组神经元的细胞活性(0.21±0.028)比缺氧损伤组(0.15±0.012)高(P<0.05),而LDH的释放量(28.6±1.309)比缺氧损伤组(40.7± 1.885)低(P<0.01);缺氧损伤组的神经元HIF-1α的相对表达量(0.72±0.027)比对照组(0.16±0.003)高(P<0.01),但ASS保护组HIF-1α的表达(1.15±0.016)高(P<0.01).ASS对大鼠脊髓运动神经元缺氧损伤的保护作用与GDNF相仿.结论:ASS可以提高体外缺氧损伤的运动神经元的细胞活性,对细胞的缺氧损伤有明显的保护作用,其保护作用的发挥,可能与增强细胞膜的稳定性及提高细胞HIF-1α的表达有关.
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长期喉返神经损伤后疑核运动神经元睫状神经营养因子的表达
目的:研究长期喉返神经损伤后疑核运动神经元睫状神经营养因子(CNTF)的表达及分布.方法:以犬单侧喉返神经损伤为实验模型,采用原位杂交及免疫组织化学技术,结合图像分析技术测定疑核CNTF mRNA及其蛋白表达呈阳性反应的神经元胞体灰度、体积及数量.结果:疑核运动神经元能自分泌CNTF,神经损伤3周内神经元CNTF基因表达强度及反应的胞体数明显下降,而CNTF蛋白表达增强,但表达的胞体数无改变.4周后基因表达强度和反应的胞体数迅速增高,而CNTF表达强度恢复正常,反应的胞体数无变化.6周后基因及其蛋白表达和神经元胞体数及体积均始终低于健侧.12周后CNTF及其蛋白表达、神经元胞体数及体积趋向稳定.结论:长期喉返神经损伤疑核运动神经元仍保持较高水平的CNTF表达,从中枢及神经营养因子角度提示晚期周围神经损伤具有修复价值.
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小胶质细胞在肌萎缩侧索硬化症发病机制中的作用
肌萎缩侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)是以选择性运动神经元变性,进行性瘫痪为特点的慢性神经系统退行性疾病.关于此病的发病机制已有多种假说,近年来许多新的研究进展都是关于伴随着运动神经元死亡而产生的神经炎症反应,人们对于此病的认识也越来越深刻.小胶质细胞及其与运动神经元的相互作用在炎症和疾病的发生发展过程中扮演了重要角色,针对此提出的一系列治疗策略显示出了重要的临床价值.
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大鼠坐骨神经切断后GDNF mRNA在其向心端及脊髓表达的变化
目的:探讨大鼠坐骨神经切断后胶质细胞源性神经营养因子(GDNF) mRNA在其向心端及脊髓表达的变化及其意义.方法:在切断SD大鼠双侧坐骨神经后的不同时间采用半定量RT-PCR方法,观察坐骨神经向心端及T12～L1段脊髓GDNF mRNA表达的变化.结果:坐骨神经切断前,GDNF mRNA在坐骨神经及T12～L1段脊髓微量表达,切断后其向心端及T12～L1段脊髓表达逐渐减少,伤后1、7、14、28 d分别减少10%、38%、45%、52%及20%、68%、80%、85%.结论:坐骨神经切断后其向心端及T12～L1脊髓GDNF mRNA表达减少,推测是由于失去靶组织转运GDNF mRNA所造成,为外源性GDNF应用于治疗脊髓损伤提供了实验依据.
关键词： 胶质细胞源性神经营养因子 坐骨神经切断术 脊髓损伤 运动神经元 基因表达 -
胶质源性神经营养因子对脊髓损伤后前角运动神经元的保护作用
目的:探讨胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)对脊髓损伤后运动神经元的保护作用.方法:大鼠分为假手术组、生理盐水(NS)组和GDNF组,改良Allen法撞击致伤T12脊髓,蛛网膜下腔分别给予NS和GDNF,分别取不同时间的伤段脊髓进行切片,应用酶组织化学染色方法显示脊髓前角外侧核运动神经元中胆碱酯酶(ChE)和酸性磷酸酶(ACP)活性,并结合计算机进行图像分析.结果:GDNF组较NS组ChE活性显著增加,ACP活性显著降低;21 d时NS组的ACP及ChE活性均高于及低于假手术组;GDNF组与假手术组ChE和ACP活性差别不显著.结论:GDNF对脊髓损伤后的前角外侧核运动神经元有一定的保护作用.
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脊髓运动神经元突触传递长时程增强的受体动力学分析
本文旨在观察下行通路激活在脊髓运动神经元(motoneuron,MN)诱发兴奋性突触后电位(excitatory postsynaptic potential,EPSP)的长时程增强现象(long-term potentiation,LTP)之受体动力学性质.应用8～14日龄新生大鼠离体脊髓MN细胞内记录技术,观察同侧腹外侧索(ipsilateral ventrolateral funiculus,iVLF)电刺激诱发的iVLF-EPSP的变化,进行EPSP受体动力学分析.结果显示,EPSP的幅度、曲线下面积和大上升斜率与刺激强度呈正相关(P＜ 0.05或P＜ 0.01);而EPSP表观受体动力学分析的参数中表观解离速率常数K2和表观平衡解离常数KT与刺激强度呈负相关(P＜ 0.01或P＜0.05).给予iVLF强直刺激(100 Hz,50脉冲/串,波宽0.4～1.0 ms,共6串,串间隔10s,10～100 V),在11个记录的MNs中有5个MNs的EPSP幅度增大到基础值的120％以上,且至少维持30 min,可以被判为iVLF-LTP,同时EPSP的曲线下面积和大上升斜率也增大到基础值的120％以上.选择iVLF-LTP过程中的EPSP进行表观受体动力学分析,结果显示有3个MNs的K2和KT在强直刺激后10 min内减小到基础值的80％以下,后逐渐有所恢复.以上受体动力学分析结果提示,部分MNs的iVLF-LTP早期可能涉及突触后受体亲和力增强的机制.
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依托咪酯对新生大鼠离体脊髓运动神经元下行激活的影响
脊髓下行激活通路是启动和调控随意运动的重要途径,全麻药对其的影响是否参与了肌松作用的产生及其兴奋性氨基酸受体机制,尚不完全清楚.为深入探索依托咪酯(etomidate,ET)对离体大鼠脊髓运动神经元(motoneuron,MN)下行激活的影响及可能的谷氨酸受体机制,本实验应用7～14日龄新生大鼠脊髓切片MN细胞内记录技术,观察ET对MN电刺激脊髓同侧腹外侧索(ventrolateral funiculus,VLF)诱发兴奋性突触后电位(excitatory postsynaptic potential,EPSP)(简称VLF-EPSP)的作用.对能稳定记录到VLF-EPSP的MN依次灌流0.3、3.0(相当于临床浓度)和30.0 μmol/L的ET.结果显示0.3 μmol/L的ET对VLF-EPSP及其N-甲基-D-门冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)和非NMDA(non-NMDA)受体成分具有双向作用:既可表现增强,使VLF-EPSP和NMDA受体介导的VLF-EPSP成分的时程延长、曲线下面积增大和(或)半幅时程延长(P＜0.05),non-NMDA受体介导的VLF-EPSP成分幅度升高、曲线下面积增大、半幅时程延长(P＜0.05)；也可表现抑制,使VLF-EPSP及其NMDA和non-NMDA受体成分的幅度降低、曲线下面积减小(皆P＜0.05).而灌流浓度≥3.0 μmol/L的ET,仅呈浓度、时间依赖性抑制,表现为VLF-EPSP及其NMDA和non-NMDA受体成分的幅度和(或)时程和(或)曲线下面积显著降低(P＜0.05或P＜0.01).此外,与VLF-EPSP的non-NMDA受体成分相比,≥3.0 μtmol/L的ET更易于压抑NMDA受体成分.以上结果表明,ET对下行激活的突触传递及介导VLF-EPSP的谷氨酸受体呈现浓度相关的差异性作用.
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5-羟色胺和/或pH值的变化对大鼠舌下神经元漏钾电流的调制作用
克隆的TWIK相关酸敏感型钾通道1(TWIK-related acid-sensitive K+channel,TASK-1)对生理范围的pH值变化较为敏感(pK～7.4).近在多种脑干运动神经元上发现了TASK-1样通道,主要功能为编码背景性漏钾电流(TASK-1-like current).本文旨在研究舌下神经元漏钾电流的特性,以及5-羟色胺(5-HT)和/或灌流液pH值的变化对该电流的影响及其可能的机制.以出生后7～8 d的Sprague-Dawley(SD)大鼠为研究对象,应用活脑片技术获取大鼠舌下神经核细胞,利用脑片全细胞膜片钳技术记录并分析运动神经元漏钾电流和超极化激活的阳离子电流(hyperpolarization-activated cationic current,Ih).结果显示,漏钾电流和,Ih可以被pH 6.0的酸性人工脑脊液(artificial cerebrospinal fluid,ACSF)所抑制,亦可被pH 8.5的碱性ACSF所激活.10μmol/L 5-HT可显著抑制漏钾电流和Ih,并可使舌下神经元去极化,诱发阈下震荡和/或动作电位.给予5-HT2受体拮抗剂Ketanserine,可以拮抗酸性ACSF对漏钾电流和Ih的抑制作用.以上结果表明,酸性ACSF对漏钾电流和Ih的调制作用可能是通过5-HT2受体介导的.
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电突触电流在单个吸气性气管运动神经元中的选择性显示
在呼吸相关神经元或其它任何类型的神经元中,与生理性自发活动相对应的电突触电流(gap junction currents,GJCs)尚未在单个神经元中被记录到,因此电突触如何参与呼吸相关的或其它类型的生理性活动,目前所知甚少.在本研究中,我们假设GJCs可在电压钳记录条件下通过消除跨膜电化学梯度在单个神经元实现选择性记录,并在单个吸气性气管迷走神经节前神经元(inspiratory tracheal preganglionic vagal motor neurons,I-TPVMs)进行验证.结果显示,用这种方法在所有I-TPVMs中均记录到GJCs,且这些神经元的GJCs可被节律性中枢吸气活动所激活.此法可用于快速探测具自发活动的神经元网络中的GJCs.
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大鼠坐骨神经切断后外源性bcl-2对脊髓运动神经元的保护作用
采用大鼠坐骨神经切断损伤模型, 行神经外膜端端对线缝合, 术中依不同组别, 动物于神经缝合处远端0.5 cm处分别注射人的正义和反义bcl-2重组腺病毒(Ad/s-bcl-2、 Ad/as-bcl-2), 报道基因重组腺病毒(Ad/lacZ)和生理盐水.术后48 h, 7 d, 15 d和30 d常规灌注固定大鼠, 取L4-L6脊髓节段, 应用X-gal染色、 bcl-2原位杂交和免疫组化染色、 TUNEL染色以及乙酰胆碱酯酶(AChE)组织化学染色方法, 观察到外源基因能在脊髓中表达, 同时外源性Ad/s-bcl-2能显著减少L4到L6节段脊髓前角运动神经元凋亡的数目, 减少脊髓前角运动神经元中因坐骨神经切断导致的AChE活性的降低幅度, 并加快其恢复.而Ad/as-bcl-2可显著增加坐骨神经切断诱导的脊髓前角运动神经元凋亡数目以及AChE活性降低幅度, 并延缓其恢复.这些观察结果表明, 外源性bcl-2能保护周围神经切断后引起的脊髓运动神经元损伤.
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移植神经营养素-4基因工程细胞对脊髓前角神经元的保护作用
用重组逆转录病毒介导的体外神经营养素-4(NT-4)基因转移方法, 制备高表达NT-4基因工程细胞并移植大鼠坐骨神经离断处.尼氏染色和ChE染色的结果表明, 移植NT-4基因工程细胞对外周神经损伤所造成的运动神经元的退变有显著的改善作用, 而且这种作用可以维持三个月.
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离体运动神经元对腹外侧索刺激的突触反应特征
应用新生大鼠脊髓薄片运动神经元(MN)细胞内记录技术,对电刺激腹外侧索(VLF)诱发的突触反应进行了电生理特征分析.结果在28个测试的MN中,22个(80%)有兴奋性突触后电位(VLF-EPSP)反应,其中2个跟随在抑制性突触反应之后,6个还对单或串刺激产生慢EPSP反应;VLF-EPSP的潜伏期频数分布呈峰坡性偏态;同一MN的VLF-EPSP与腹根EPSP间有典型的空间总和.VLF-EPSP的幅度随膜超极化而增大,随膜去极化而减小,但背根或腹根刺激诱发的EPSP幅度在膜电位改变时无明显变化.提示VLF中的下行纤维可能与MN的胞体或近端树突形成突触,而背根或腹根中传入纤维与MN的远端树突联系.药理学分析表明,VLF-EPSP可能是由谷氨酸主要激活非NMDA受体而介导的.
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七氟醚抑制脑干吸气前运动神经元的作用机制
研究背景:位于延髓尾部腹侧髓质的神经元是与吸气相关的前运动神经元,它们是支配呼吸肌如膈肌、肋间外肌、肋间内肌等运动神经元的上一级神经元.这些神经元的兴奋状态由NMDA受体,AM-PA受体调控,也受抑制性AGBAA能神经调节.作者在去大脑狗的模型上探讨七氟醚对这些突触机制的影响.
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逆向轴突运输障碍与肌萎缩侧索硬化
肌萎缩侧索硬化（ ALS ）是运动神经元变性疾病，特异性损害运动神经细胞。典型临床表现包括肌肉无力、强直以及萎缩，自然病程约2～5年。大部分患者为散发病例，10％的患者属于家族遗传性。迄今为止还没有治疗肌萎缩侧索硬化的有效方法。 ALS具体发病机制尚不明确。神经营养因子等经逆向轴突运输由神经末梢输送到神经元胞体，维持神经细胞的存活及功能。在ALS患者及动物模型中都发现了逆向轴突运输障碍。其在ALS发生、发展中具有重要作用，并有望成为治疗ALS的新途径。本文就逆向轴突运输障碍导致ALS的可能机制作一综述。
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肌萎缩侧索硬化夜间睡眠呼吸障碍的研究进展
肌萎缩侧索硬化(ALS)是一种常见的神经系统变性病,选择性侵犯脊髓前角细胞、脑干运动神经元、皮质锥体细胞及锥体束,迄今尚无有效治愈方法,平均生存期仅3～5年.在疾病进展过程中呼吸肌逐渐受累,呼吸肌麻痹为其主要死因,且疾病早期患者的呼吸功能障碍往往不易察觉,因此对呼吸肌麻痹的早期识别和治疗显得尤为重要.现对ALS患者的夜间睡眠呼吸障碍(SDB)综述如下.
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肌萎缩侧索硬化睡眠障碍的研究进展
肌萎缩侧索硬化(ALS)是一种常见的神经系统变性病,选择性侵犯脊髓前角细胞、脑干运动神经元、皮质锥体细胞及锥体束,以肌无力、肌萎缩、肌束震颤、延髓麻痹和锥体束征等为主要临床表现.患病率4/10万～6/10万,男性多见,平均发病年龄约为56岁[1].迄今尚无有效治愈方法,平均生存期仅3～5年.现就近年来ALS睡眠障碍的研究进展综述如下.
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脑源性神经营养因子与中枢神经修复再生
神经营养因子在保护神经元存活并促进其突起生长发育过程中,常出现基因表达的时相变异,对不同种类的神经元有明显的作用选择性.脑源性神经营养因子(BDNF)作为神经营养因子家族中的一员,广泛分布于大脑中,是一类可促进运动神经元、感觉神经元、基底节前脑胆碱能神经元、皮层神经元、海马神经元、多巴胺能神经元等的存活和生长发育并能防止它们受损死亡,改善神经元病理状态、促进受损伤神经元再生及分化成熟等生物效应的多肽或蛋白质,在中枢神经系统(CNS)的损伤修复中具有重要的作用.本文就其理化性质、生物学特性及在中枢神经修复与再生中的作用等进行综述.
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肌萎缩侧索硬化患者的电生理改变
肌萎缩侧索硬化(ALS)是隐袭起病的中枢神经系统运动神经元变性疾病，肌电图(EMG)常表现为广泛性的神经源性损害。为此，我们对25例ALS患者进行EMG检测，现将结果报告如下。1 对象与方法1．1 对象 选自我院1993年～1999年门诊和住院确诊的ALS患者25例，男16例，女9例，年龄15～73岁，平均48.56岁。病程2个月～10年，平均4.7年。2年内9例，2年以上16例。临床表现为手的小肌肉或舌肌的萎缩和无力，其中手肌萎缩22例，手肌并舌肌萎缩3例，肌束颤17例，四肢腱反射亢进23例，病理征阳性20例，均无感觉障碍，括约肌功能正常。脑脊液常规及生化均正常，肌酶检查正常。正常对照组20例，为年龄、性别与ALS组相匹配的健康志愿者。
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骨髓基质细胞培养基对体外脊髓运动神经元的影响
目的:体外检测骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)的条件培养基对脊髓运动神经元的影响.方法:体外培养SD大鼠的BMSCs,并收集其条件培养基.实验组脊髓运动神经元用条件培养基培养,对照组用NB培养液.观察两组运动神经元形态学指标,测量细胞突起长度.MTT法检测两组细胞活力.结果:实验组运动神经元的细胞活力、突起长度与对照组相比差异均有统计学意义(P<0.01).结论:BMSCs合成和分泌神经营养活性物质对脊髓运动神经元有维持存活和促进突起生长的作用.
