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芪蚣抗纤方拆方对肝纤维化大鼠Smad2/3及Smad7蛋白的影响
目的:观察芪蚣抗纤方(Qigong Kangxian Prescription,QF)活血组和软坚组对肝纤维化大鼠细胞内信号转导分子2,3,7(Smad 2/3及Smad7)的影响.方法:成年健康雄性SD大鼠60只,随机分为6组,除正常对照组10只外,其余50只均用猪血清腹腔注射法复制免疫损伤性肝纤维化大鼠模型,0.5 mL/只,每周2次,连续8周.活血组和软坚组分别给于活血方和软坚方.低、高剂量组按生药量以5,10 g·kg-ig给药.实验结束处死大鼠,断头取血,分离血清,用ELISA法测定转化生长因子(transforming growth factor,TGF)β1的含量.部分肝组织固定于10％甲醛液,石蜡包埋,制光镜切片,免疫组织化学法检测肝组织TGF-β1、Smad2,Smad3及Smad7蛋白的表达.结果:①血清及肝组织TGF-β1含量及表达活血高剂量组分别为(0.65±0.09)μg·L-1,4.33±2.06,软坚低剂量组分别为(0.62 ±0.08) μg·L-1,4.11±1.14,与模型组(1.22 ±0.16) μg·L-1,10.33±3.34相比有显著差异(P＜0.01)；②Smad2和Smad3蛋白表达显色指数活血高剂量组分别为(3.88 ±2.00),(3.22±1.89)分,软坚低剂量组分别为(4.22±1.49),(4.77±1.75)分,与模型组(10.20±3.06),(10.22 ±3.06)分相比有显著差异(P＜0.01)；③Smad7蛋白表达显色指数活血高剂量组为(6.89 ±1.50)分,软坚低剂量组为(4.33±1.78)分,与模型组(1.56±0.73)分相比有显著差异(P＜0.01).结论:芪蚣抗纤方活血组及软坚组可通过减少Smad 2/3的激活,增加Smad7的表达,抑制肝纤维结缔组织增生,减轻肝损伤及肝纤维化程度.具有抑制肝纤维化作用.
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辐射诱发BEP2D恶性转化中Smad 7对TGF-β/SMADs信号通路的调控
目的研究BEP 2 D细胞经辐射诱发恶性转化过程中,作为SMAD蛋白家族的抑制分子,Smad 7对TGF-β/SMAD介导信号通路的调控.方法用Northern blot检测TGF-β刺激之后,永生化BEP 2 D细胞及辐射诱发恶性转化的BERP 35 T 2细胞中Smad 7 mRNA的表达水平.人工合成SMAD结合元件(SBE)重复序列,同报告基因碱性磷酸酶融合.构建好的载体同Smad 7真核表达载体共转染,TGF-β刺激,通过报告基因的表达丰度来检测Smad 7对TGF-β/SMADs介导的信号通路的调控.结果Northern杂交结果表明,永生化细胞Smad 7基因对TGF-β刺激的应答正常,恶性化细胞的应答降低.基因转染的结果表明,永生化细胞中SBE的基础活性较恶性化细胞高;TGF-β刺激之后,永生化细胞中SBE活性显著增强,恶性化细胞变化不明显;同Smad 7真核表达载体共转染之后,两种细胞中SBE活性均显著降低.结论在辐射诱发细胞发生恶性转化过程中,Smad 7基因对TGF-β信号通路的反馈调节作用发生紊乱,使TGF-β信号通路持续处于抑制状态,TGF-β对细胞的负性调控作用减弱,细胞进一步向恶性化发展.
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川芎嗪对人肝星状细胞TGF-β1信号传导的影响
目的:探讨中药单体川芎嗪 (TMP)对肝星状细胞(HSC)转化生长因子-β1 (TGF-β1)信号传导的影响.通过检测TGF-β1及其Ⅰ型和Ⅱ型受体、Smad 3及Smad 7 mRNA表达的变化,探讨川芎嗪抗肝纤维化作用的相关机制.方法:体外培养人肝星状细胞,RT-PCR法检测HSC中TGF-β1及其Ⅰ型和Ⅱ型受体、Smad 3及Smad 7 mRNA表达.结果:与阴性对照组相比,TMP A、B、C各组均可显著降低TGF-β1 mRNA(P<0.01);TMP B、C组TβR Ⅰ mRNA相对表达量降低,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01);TMP B、C浓度组的TβR Ⅱ mRNA、Smad 3 mRNA表达量显著降低(P<0.01);TMP B、C组可显著升高Smad 7 mRNA表达量(P<0.01).结论:川芎嗪可降低HSC中TGF-β1及其Ⅰ、Ⅱ型受体及Smad 3 mRNA表达,同时促进Smad7 mRNA表达,表明川芎嗪可抑制肝星状细胞的活化、增殖,这可能与阻断TGF-β/Smad通路的信号传导有关.
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柴芩肾安方对IgA肾病大鼠肾组织TGF-β1和Smad 7的影响
目的:探讨柴芩肾安方对IgAN大鼠肾组织TGF-β1和Smad 7表达的影响.方法:采用灌服并定时静脉注射BSA复合感染SEB的方法制成大鼠IgAN模型,并用柴芩肾安方治疗,以氯沙坦为对照.第15周末,观察肾组织形态学变化和免疫复合物的沉积情况;采用免疫组化和RT-PCR的方法,分别检测肾组织TGF-β1和Smad 7蛋白及其mRNA的表达.结果:与正常组相比,模型组大鼠肾小球系膜细胞和系膜基质轻度增生,伴见弥漫的IgA和少量IgG沉积;TGF-β1和Smad 7蛋白及其mRNA表达均明显升高(P＜0.01).柴芩肾安方治疗后上述指标均明显减轻(P＜0.01),且作用效果与氯沙坦类似.结论:抑制肾组织TGF-β1和Smad 7蛋白及其mRNA的表达,可能是柴芩肾安方延缓IgAN肾脏病变进展的机制之一.
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人膀胱癌中TGF-β1及其信号转导分子的表达及意义
目的:探讨转化生长因子-β1(transforming growthfactor β1,TGF-β1)及其超家族肽类的细胞内转导分子Smad 4和Smad 7在人膀胱癌中的表达及意义.方法:采用免疫组织化学方法,对经过石蜡包埋的膀胱癌和正常膀胱组织进行定性和定位检测.结果:Smad 4在正常膀胱组织中的表达率较高,膀胱癌中较低,差异有统计学意义(P＜0.05);TGF-β1、Smad 7在正常膀胱组织中表达不明显或无表达,在膀胱癌中表达率较高,两者比较,差异有统计学意义(P＜0.05);TGF-β1与Smad7的表达水平呈正相关(P＜0.01)TGF-β1与Smad 4的表达水平呈负相关(P＜0.01).结论:TGF-β1和Smad 7蛋白的阳性表达与膀胱癌发生、发展密切相关,参与膀胱癌恶性转化,而Smad 4对膀胱癌的进展有抑制作用.
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尖锐湿疣皮损中Smad7、Smurf1和Smurf2的表达及意义
目的:探讨转化生长因子(TGF)-β信号转导途径中重要的负性调节因子Smad7、Smurf1和Smurf2在尖锐湿疣皮损中的表达及其意义.方法:采用EliVisionz(TM)plus免疫组化技术分别检测尖锐湿疣和正常对照皮肤中Smad 7、Smurf1和Smurf2的表达.结果:与对照正常皮肤相比,尖锐湿疣表皮中Smad 7、Smurf1和Smurf2的表达水平显著上调.结论:尖锐湿疣皮损中Smad 7、Smurf1和Smurf2的表达增强可能干扰TGF-β信号转导,有助于表皮角质形成细胞异常增殖,导致尖锐湿疣表皮过度增殖的组织病理学改变.
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皮肤基底细胞癌和鳞状细胞癌皮损中Smad 7、Smurf 1和Smurf 2的表达
目的 探讨Smad 7、Smurf 1和Smurf 2在基底细胞癌和鳞状细胞癌皮损中表达水平的变化及其意义.方法 采用实时定量聚合酶链反应和免疫组化技术分别检测基底细胞癌、鳞状细胞癌及正常人对照皮肤中Smad 7、Smurf 1和Smurf 2的表达.结果 Smad 7、Smurf 1和Smurf 2在基底细胞癌和鳞状细胞癌中的表达较正常表皮显著升高.结论 基底细胞癌和鳞状细胞癌皮损中Smad 7、Smurf 1和Smurf 2的表达增强可能干扰转化生长因子β(TGFβ)信号转导通路的多个环节,使TGFβ抑制上皮增生的作用不能有效发挥,从而有助于上述表皮肿瘤的异常增殖.
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粉防己碱上调Smad 7表达抑制大鼠肝星状细胞活化
目的观察低浓度粉防己碱(Tetrandrine,Tet)对培养的大鼠肝星状细胞(HSC)活化和转化生长因子-β1(TGF-β1)促活化作用的影响,并探讨该作用与TGF-β1受体后信号通路的关系.方法 HSC原代培养,给予Tet(0.4、0.8、1.6和3.2 μmol·L-1)处理,免疫细胞化学法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达,或给予TGF-β1(质量浓度5 μg·L-1)和(或)Tet(1.6 μmol·L-1)干预,分别以RT-PCR和Western blot法检测TGF-β1及其Ⅰ、Ⅱ型受体、Smad 3、Smad 7 以及α-SMA mRNA和(或)蛋白表达.结果 Tet(0.4～3.2 μmol·L-1)能抑制培养HSC表达α-SMA.Tet(1.6 μmol·L-1)抑制TGF-β1 诱导的HSC α-SMA表达,伴有Smad 7表达上调及TGF-β1表达下降,但不影响TGF-βⅠ、Ⅱ型受体和Smad 3表达.结论低浓度Tet抑制培养HSC的活化和TGF-β1促活化作用,该作用与上调Smad 7表达并抑制TGF-β1有关而不影响TGF-β受体表达.
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Smad 4、Smad 6、Smad 7在胰腺癌中的改变及其相互关系
目的研究Smad 4、Smad 6和Smad 7在胰腺癌组织中的改变及其相互关系.方法采用半定量RT-PCR法分别检测了17例胰腺癌和6例正常胰腺组织中Smad 4、Smad 6和Smad 7的mRNA表达情况.结果5例胰腺癌组织不表达Smad 4,占29.4%;胰腺癌组织中Smad6和Smad7的表达水平分别为1.15±0.51和1.44±0.84,正常胰腺组织S mad6和Smad 7的表达水平分别为0.47±0.18和0.39±0.29,两者相比有统计学意义(P＜0.05);Smad6和Smad7的表达水平和Smad4表达无相关性.结论Smad4纯合性缺失在胰腺癌中的发生率约为30%,在胰腺癌的发病机制中占有值得重视的地位;Smad 6和Smad 7在胰腺癌组织中存在过表达现象,可能是导致胰腺癌发生的原因之一.
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腺病毒Smad7转染对阿霉素肾病大鼠蛋白尿的影响
目的：在阿霉素（ADR）肾病大鼠模型中，探讨过表达Smad 7对肾病蛋白尿及其病理的影响。方法本实验用单次尾静脉注射建立阿霉素肾病模型，通过构建重组腺病毒介导外源性Smad 7基因，单侧肾动脉灌注转染Smad 7至靶肾脏。用荧光显微镜检测Smad 7重组腺病毒的转染效果，用邻苯三酚红比色法测定大鼠24 h尿蛋白，HE染色检测各组肾脏病理改变。结果①用6.5 mg/kg ADR一次性尾静脉注射SD大鼠可成功构建肾病模型；4周末似微小病变型肾病。②单侧肾动脉灌注能有效将介导Smad 7的重组腺病毒转染至大鼠靶肾脏。③4周末肾病重组腺病毒（Ad- Smad7）组尿蛋白（38.4±6.0）较ADR组（69.58±10.63）减少（<0.05）。④荧光显微镜显示肾病Ad- smad7组大鼠靶肾中，Ad- Smad7主要在肾小管表达，肾小球表达少。⑤肾病Ad- Smad7组肾脏病理改变轻微，肾病Ad- GFP组、ADR组病理较严重，出现类似局灶节段性肾小球硬化的慢性肾脏病病理表现。结论单侧肾动脉灌注有效地使重组腺病毒介导的Smad 7转染至大鼠靶肾脏，使Smad 7在该肾过表达，可减轻肾病大鼠蛋白尿，并改善阿霉素肾病病理。
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复方鬼箭羽合剂对糖尿病肾病大鼠肾组织Smad4、Smad7的影响
目的:观察复方鬼箭羽合剂对早期糖尿病肾病的治疗作用,以及探讨这种治疗作用的机制.方法:单侧肾切除STZ腹腔注射造模的方法,采用肾小球光镜和电镜病理染色的方法、以及Smad4和Smad 7免疫组织化学染色的方法观察方法复方鬼箭羽合剂对肾小球Smad4和Smad 7表达的调控作用.结果:8、12周末模型组大鼠肾小球内Smad 4阳性相对面积显著高于正常对照组(P<0.01),复方鬼箭羽合剂治疗组大鼠肾小球内Smad4的蛋白表达量较模型组显著降低(P<0.01),8、12周末模型组大鼠肾小球内Smad 7阳性相对面积显著低于正常对照组(P<0.01),复方鬼箭羽合剂治疗组大鼠肾小球内Smad 7阳性相对面积与正常对照组差别并不显著(P>0.05),而12周时复方鬼箭羽合剂治疗组大鼠肾小球内Smad 7阳性相对面积较8周有所下降,有显著性差异(P<0.05).结论:复方鬼箭羽合剂治疗组能显著上调Smad4和使Smad 7蛋白的表达降低,说明复方鬼箭羽合剂可通过调节Smad4和Smad7蛋白表达,从而降低TGF-β1的表达,达到防治糖尿病肾病肾小球硬化的作用.
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Smad 6和Smad 7基因治疗对肾小管间质纤维化进程的影响
目的观察腺相关病毒(rAAV)介导的Smad 6和Smad 7基因治疗对单侧输尿管梗阻性(UUO)肾小管间质纤维化进程的影响.方法构建产生表达Smad 6和Smad 7基因的无辅毒腺相关病毒载体,再将此病毒颗粒通过肾动脉途径转移到UUO模型.30只Wistar大鼠随机分为假手术组、梗阻组、LacZ AAV转染组、Smad 6 AAV转染组和Smad 7 AAV转染组(n=6),于术后第3周处死大鼠.采用β-半乳糖苷酶染色和免疫组化观察外源基因的定位,Western印迹法观察外源基因、胞内磷酸化Smad 2、PAI-1和α-SMA的表达;底物酶谱法检测MMP-2和MMP-9活性,分光光度法测定肾组织羟脯氨酸含量.结果Smad 6和Smad 7成功地转染到外髓的肾小管间质区,定位在肾小管和集合管细胞,而血管细胞、肾小球或间质细胞均未见有AAV转移基因的表达.Smad 7基因治疗可显著降低肾组织PAI-1、α-SMA的表达和肾组织羟脯氨酸含量,增加MMP-2和MMP-9活性,这些作用与Smad 7阻断Smad 2磷酸化有关.相反,Smad 6没有这样的治疗作用.结论Smad 7基因转移能有效缓解单侧输尿管梗阻肾小管间质纤维化,AAV介导的Smad 7基因转移有望成为治疗肾小管间质纤维化的方法之一.
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过表达Smad 7对Ang Ⅱ诱导GMC增殖的影响
目的：通过对大鼠肾小球系膜细胞（GMC）转染外源性 Smad 7基因，探讨 Smad 7对血管紧张素Ⅱ（Ang Ⅱ）诱导 GMC 增殖活性的影响及可能机制。方法：分别在体外用腺病毒介导载体 pAdTrack-CMV-Smad 7和pAdTrack-CMV-GFP（阴性对照组）转染大鼠GMC，用RT-PCR鉴定Smad 7 mRNA 过表达效率；用二甲苯基碘（DPI）阻滞活性氧（ROS）生成，DCFH-DA 法检测细胞内 ROS 生成水平；用 Western blot 法鉴定Smad 7蛋白过表达效率及 IκBα的蛋白表达变化；CCK-8（Cell Counting Kit-8）试剂盒检测 GMC 增殖变化。结果：（1）pAdTrack-CMV-Smad 7转染GMC后，外源性Smad 7的mRNA和蛋白水平均明显升高；（2）Ang Ⅱ能减少IκBα的表达，DPI与过表达Smad 7均能使IκBα表达增多；（3）Ang Ⅱ促进 ROS生成， DPI能阻断Ang Ⅱ的促 ROS 作用，过表达 Smad 7也能抑制 ROS 生成，差异有统计学意义（P ＜0．05）；⑷Ang Ⅱ促进GMC 增殖，过表达 Smad 7与 DPI 均能明显缓解 Ang Ⅱ的促增殖作用，差异有统计学意义（P ＜0．05）。结论：Smad 7通过抑制 ROS 的产生，诱导 IκBα表达增多，从而抑制肾脏炎症反应，缓解 Ang Ⅱ对 GMC 的促增殖效应。
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Smad 7与转化生长因子β1受体后信息调控
Smad蛋白家族是转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)受体后信息分子,参与调控细胞的增殖、转化、合成、分泌和凋亡.这一超家族成员中,Smad 7具有与其它信息分子不同的负性调节作用.在肝脏,它表现为抑制肝星状细胞(hepatic stellatecell, HSC)的转化和胶原等细胞外基质的合成与分泌[1, 2].现将Smad 7的研究进展综述如下.
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迪康胶囊抗大鼠肝纤维化作用机制的实验研究
目的通过迪康胶囊治疗不同剂量二甲基亚硝胺(DMN)诱导的肝纤维化大鼠,分离星状细胞检测胞浆Collagen-Ⅲ、α-SMA、Smad 3、Smad 7 mRNA表达的变化,以期了解其在抗肝纤维化作用中的分子机制,为其抗肝纤维化提供证据.方法 Wistar雄性大鼠共50只,分为病理1组、2组,治疗1组、2组,正常对照组.分别以不同剂量诱导形成肝纤维化模型并用迪康胶囊治疗.6周后,处死大鼠,分离各组大鼠肝星状细胞,进行体外培养,采用RT-PCR方法测定各组大鼠星状细胞中胞浆信号蛋白Collagen-Ⅲ、α-SMA、Smad 3、Smad 7的mRNA的表达,以磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)做内参,琼脂糖电泳后照相读取灰度,以扩增片段/GAPDH的比值为mRNA的相对含量进行比较.结果两组病理组星状细胞Collagen-Ⅲ、α-SMA和Smad 3 mRNA与正常对照组相比表达均增加(P＜0.01),两组病理组之间无统计学差异;而Smad 3与正常组相比则无统计学差异.迪康胶囊治疗后,Collagen-Ⅲ、α-SMA和Smad 3表达均下降(P＜0.05),而Smad 7表达则明显增加(P＜0.05).结论 迪康胶囊缓解DMN诱导的大鼠肝纤维化程度,使其胶原表达减少,星状细胞α-SMA的表达降低,使星状细胞胞浆信号蛋白Smad 3的mRNA表达降低,Smad 7 mRNA表达升高,说明迪康胶囊对不同剂量DMN诱导的肝纤维化均有不同程度的抗纤维化作用.
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Smads蛋白和转化生长因子β1在大鼠慢性阻塞性肺疾病中的表达
目的观察慢性阻塞性肺疾病(COPD)气道结构重塑的病理特征和气道慢性炎症的特点,探讨Smad 3、Smad 7和转化生长因子β1(TGF-β1)在COPD中的作用及其相互关系.方法将30只健康Wistar大鼠随机分为3组,正常对照组、盐水对照组和COPD组,通过气管内注射脂多糖和被动吸烟的方法建立COPD大鼠模型,检测动脉血气、支气管肺泡灌洗液(BALF)细胞计数及病理形态学等指标,采用免疫组化法检测肺组织Smad 3、Smad 7和TGF-β1的表达.结果①BALF细胞总数:COPD组为(8.35±0.88)×108/L,正常对照组为(1.46±0.96)×108/L,两组比较差异有统计学意义(P＜0.05);②气道炎症病理学评分:COPD组为(69.30±4.99)分,正常对照组为(18.56±2.46)分,两组比较差异有统计学意义(P＜0.05);③肺泡腔直径:COPD组为(92.58±4.32)μm,正常对照组为(47.22±12.95)μm,两组比较差异有统计学意义(P＜0.05).④免疫组化指数:COPD组的Smad 3、Smad 7和TGF-β1表达分别为(4.37±0.15)分、(1.78±0.29)分和(3.97±0.20)分,正常对照组分别为(1.58±0.36)分、(2.68±0.44)分和(0.74±0.18)分,COPD组的Smad 3和TGF-β1表达显著高于正常对照组(P均＜0.05),Smad 7表达则显著低于正常对照组(P＜0.05).结论多种炎性细胞参与COPD的发病;COPD气道重构的病理特征主要为小气道平滑肌不规则增生和细胞外基质沉积;Smad 3和TGF-β1在COPD的发病中起重要作用,而Smad 7对TGF-β1的负反馈抑制作用缺乏.
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抑制性 Smads 在肝纤维化发生发展中的表达变化
目的：观察抑制性 Smads（Smad 6，Smad 7）在肝纤维化大鼠肝脏中的表达变化并探讨它们在肝纤维化发生发展中可能的作用。方法选取 Wistar 大鼠20只，随机分为正常组和肝纤维化模型组，每组各10只。通过皮下注射40％ CCl4植物油溶液制备肝纤维化动物模型，注射剂量为0．4 mL／100 g 体质量，每周注射2次，造模时间总计为12周。采用 Western Blot 检测肝脏中 Smad 6及 Smad 7蛋白的表达变化；采用 PCR 技术检测肝脏中Smad 6及 Smad 7 mRNA 的改变。结果 Western Blot 检测显示，与正常组大鼠比较，模型组大鼠肝脏中 Smad 6及Smad 7蛋白的表达显著减少；同时 PCR 检测发现模型组大鼠肝脏中 Smad 6及 Smad 7 mRNA 的表达也较正常组大鼠明显降低。结论肝纤维化过程中抑制性 Smads 在基因及蛋白水平表达下调可能是促进肝纤维化发生发展的一个重要因素。
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Smad 6和Smad 7基因腺相关病毒载体的构建及其表达
目的: 构建Smad 6和Smad 7基因腺相关病毒(AAV)载体, 并转染到人肾小管上皮细胞中表达.方法: 利用基因重组技术, 采用BamH I和Xho I双酶分别将pcDNA3中的目的基因Smad 6/flag和Smad 7/flag融合基因片断切出, 再克隆到质粒pAAV-MCS中, 构建重组质粒pAA-Smad 6/flag和pAA-Smad 7/flag.采用磷酸钙沉淀法, 以重组质粒或pAAV-LacZ以及pAAV-RC、pHelper共转染HEK293细胞, 产生均有传染性的病毒颗粒.再将此病毒颗粒转染到培养的人肾小管细胞中, 用免疫组化法检测其Smad 6和Smad 7转移基因的表达.结果: 成功地构建Smad 6和Smad 7基因的腺相关病毒载体, 并可在肾小管上皮细胞中表达Smad 6和Smad 7.结论: 肾小管细胞能稳定、高效表达外源Smad 6和Smad 7, 为今后建立Smad 6和Smad 7 AAV基因治疗体内肾纤维化的模型奠定了良好的基础.
