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五种常用轮状病毒检测方法的评价及应用策略
目的 比较胶体金免疫层析法(GICA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、实时荧光定量-反转录聚合酶链反应(real-time RT-PCR)和聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gelelectrophoresis,PAGE)5种常用的轮状病毒检测方法的准确性.方法 取A组轮状病毒阳性标本,经l×101 ～1 ×108 10倍系列稀释,采用上述5种方法平行检测,比较检测限;选择分别含有以下9种病原体且轮状病毒证实为阴性的粪便标本作为阴性对照:脊髓灰质炎病毒疫苗株Ⅰ～Ⅲ型、肠道病毒EV71、柯萨奇病毒A16、ECHO病毒6、诺如病毒Ⅰ型、诺如病毒Ⅱ型和星状病毒,采用上述5种方法平行检测,比较特异性;采用上述方法,分别对184例婴幼儿腹泻粪便标本进行检测,以PAGE检测结果作为参考标准,比较其余4种方法的灵敏度和特异性.结果 上述5种方法检测A组轮状病毒的检测限相差5个数量级,分别为:real-time RT-PCR法10-6稀释度,胶体金法10-3稀释度,ELISA和PAGE方法均为10-2稀释度,RT-PCR法10-1稀释度;5种方法对9种对照病原体均无交叉反应;以PAGE方法检测结果作为标准,real-time RT-PCR、ELISA、胶体金和RT-PCR灵敏度分别为95.45％、96.97％、93.94％和62.12％,特异性分别为82.2％、86.44％、82.20％和94.07％.结论 PAGE作为检测轮状病毒的经典方法,具有高特异性,可用于确认实验;real-time RT-PCR方法检测A组轮状病毒的灵敏度优于其他4种方法,可用于轮状病毒的高通量检测;ELISA和胶体金方法具有良好的灵敏度与特异性,且胶体金方法成本低,可用于初筛检测;行业标准推荐的RT-PCR方法特异性较高,但灵敏度较低,有待改进.
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蜂胶酊在抑制腹泻仔猪大肠杆菌的作用研究
本研究对猪场腹泻情况进行调研,对腹泻仔猪粪便进行采样,用麦康凯琼脂培养基(MacC)和伊红美蓝琼脂培养基(EMB)多次实验分离出大肠杆菌,用普通LB液体培养基扩大培养后,进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)确定本研究分离菌种的类型,同时进行菌种保存,并利用蜂胶酊对所分离的大肠杆菌进行抑菌实验,结果表明20%浓度的蜂胶酊对大肠杆菌的抑制效果较好.
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南平市婴幼儿及动物腹泻病毒监测
目的:对南平市婴幼儿腹泻病毒病原分布及流行规律进行研究及动物粪便监测.方法:应用电子显微镜及聚丙烯酰胺凝胶电泳法对住院腹泻患儿粪便标本及动物粪便进行病毒观察及轮状病毒RNA分型.结果:①1998年-2001年共检测192份婴幼儿腹泻粪便标本,电镜方法检出4种病毒:轮状病毒、冠状病毒、腺病毒、小圆病毒,病毒检出率为43.8%(84/192),其中轮状病毒64份(33.3%);冠状病毒10份(5.2%);腺病毒3份(1.6%);小圆病毒1份(0.5%);轮状病毒与冠状病毒混和感染6份(3.1%).②对192份标本进行轮状病毒RNA电泳分型:A组长型52株,短型15株,阳性率为34.9%,轮状病毒RNA的检出率在秋冬季(10-3月)为43.2%(64/148);春夏季(4-9月)为6.8%(3/44).③两种方法均未检出动物轮状病毒.结论:①南平市婴幼儿腹泻病原存在上述4种病毒,轮状病毒是婴幼儿秋冬季腹泻的主要病原;②A组轮状病毒RNA长型足主要的流行型别,其长型和短型在不同的年份呈现动态变化的趋势.
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日本香川地区荷斯坦牛乳与娟姗牛乳营养成分的比较
目的 比较日本香川地区荷斯坦和娟姗牛乳中乳清蛋白的总蛋白质含量,乳过氧化物酶(LPO)和乳铁蛋白的一些基本性质.方法 以荷斯坦和娟姗牛乳为对象,经酸沉淀除酪蛋白后,通过离心,SP-Sepharose离子交换层析分离纯化得到乳过氧化物酶和乳铁蛋白,利用考马斯亮蓝定量、SDS-PAGE定性、ABTS检测乳过氧化物酶活性、后通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)确认分子量.结果 娟姗牛乳中乳清蛋白的总蛋白质和乳过氧化物酶含量均高于荷斯坦中乳清蛋白中的总蛋白质和乳过氧化物酶含量.娟姗乳清蛋白中的乳过氧化物酶活性(0.870 5 U/ml)高于荷斯坦乳清蛋白中的乳过氧化物酶活性(0.758 9 U/ml).娟姗乳清蛋白中的乳过氧化物酶和乳铁蛋白分子量分别为786 48.154和831 23.538 kDa,荷斯坦乳清蛋白中的乳过氧化物酶和乳铁蛋白分子量分别为777 64.841和827 65.494 kDa.结论 对于乳酪行业,当考虑养殖奶牛品种生产乳酪同时又想大限度利用需要处理的乳清蛋白和乳铁蛋白的时候,相比于荷斯坦奶牛,娟姗奶牛是更好的选择.
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武汉地区婴幼儿星状病毒性腹泻的流行病学调查
2002年11月至2003年10月在武汉儿童医院腹泻门诊采用系统抽样的方法选择就诊的5岁以下的腹泻患儿,采集腹泻样本共793份,并收集了包括年龄、性别等相关资料;采用星状病毒试剂盒(IDEMATM Astrovirus,DAKO公司产品,美国)进行星状病毒检测;此前该批样品经聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检测过轮状病毒.检测结果及相关资料采用EPI2002录入和进行描述性统计分析.
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山东同一种植基地不同形态瓜蒌的种子蛋白研究
目的：研究山东同一种植基地不同形态瓜蒌种子中的蛋白质。方法：采用紫外分析法测定蛋白质的含量，利用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术进行蛋白电泳分析，采用Biosens Gel Imaging System软件绘制指纹图谱。利用NTSYS-pc软件进行聚类分析，计算遗传相似系数。结果：不同样品的蛋白质含量具有明显差异，蛋白电泳图谱具有多条共有带。结论：种子蛋白质的含量不是评价瓜蒌质量优劣的主要指标，蛋白电泳图谱的共有条带可作为鉴定瓜蒌真伪的重要依据。
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酸浆种子蛋白提取方法的比较研究
目的:建立适用于酸浆种子的SDS-PAGE和2-D PAGE蛋白样品提取方法.方法:比较直接提取法、TCA-丙酮法、Tris-丙酮法、饱和酚法、改良饱和酚法等7种提取方法所获酸浆种子总蛋白含量以及SDS-PAGE电泳的谱带数目、强度和电泳分辨率等方面的差异.结果:HEPES buffer直接提取法提取蛋白效率较高,杂质少,电泳谱带清晰,分辨率高;PVP buffer和Lysis buffer A直接提取法次之.但杂质较多;TCA-丙酮法、Tris-丙酮法、饱和酚法和改良的饱和酚法差别不大,蛋白纯度较高,但提取效率低,谱带数目少;此外,Lysis buffer A法、丙酮法和酚法易产生高丰度蛋白的干扰.结论:直接提取法中的HEPES buffer法好,优于丙酮法、酚法和其它直接提取法.
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不同产地和不同部位的壁虎药材蛋白质比较研究
目的:为中药壁虎质量标准的制订与资源开发提供科学的实验依据及可靠的实验方法.方法:提取不同产地的无蹼壁虎药材不同部位(壁虎体与壁虎尾)的水溶性蛋白质,并对其进行含量测定和聚丙烯酰胺凝胶电泳,比较壁虎药材蛋白质含量和组成的产地差异和部位差异.结果:不同产地壁虎药材的蛋白质含量不同,同一产地壁虎药材的不同部位蛋白质含量也存在差异.蛋白质电泳图谱显示,除共有条带外,同一提取部位的蛋白条带的分布位置和数量随产地存在一定差异.结论:考马斯亮蓝染色法简便、快速,标准曲线线性关系良好,可以用来进行蛋白质含量的测定.聚丙烯酰胺凝胶电泳实验快速、准确、重复性好,得到的蛋白质电泳指纹图谱可作为壁虎药材质量评价和资源开发的重要依据之一.
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黄芪蛋白提取方法的比较
目的:应用蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)技术筛选建立黄芪蛋白质指纹图谱及蛋白提取方法.方法:采用8种提取方法(稀释4倍的浓缩胶缓冲液,双蒸水,Tris-HCl法,柠檬酸盐法,PVP buffer,改良饱和酚法,TCA-丙酮法,植物蛋白提取试剂盒)提取黄芪药材的水溶性蛋白质,根据PAGE谱带的多少和清晰度优选建立黄芪药材蛋白质指纹图谱的蛋白提取条件.结果:植物蛋白质提取液、稀释4倍的浓缩胶缓冲液和Tris-HCl缓冲液提取的蛋白含量较高,但杂质较多,条带拖尾,部分特征峰不能得到有效分离.TCA-丙酮法、改良饱和酚法、柠檬酸盐缓冲液和PVP buffer提取的蛋白含量较低,谱带数目较少,辨识度低.以双蒸水为提取溶剂时可辨识谱带数目多,清晰度较好,电泳指纹图谱中各峰的分离度较高.结论:双蒸水直接提取法更适用于建立黄芪药材的蛋白质指纹图谱.
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瓜蒌种子蛋白质6种提取方法比较
目的:建立适合于瓜蒌种子的蛋白质提取方法.方法:比较水溶液直接提取法(3种)、三氯乙酸(TCA)-丙酮法、三羟甲基氨基甲烷(Tris)-丙酮法、蛋白质提取液提取法等6种蛋白质提取方法所获瓜蒌种子总蛋白含量、聚丙烯酰胺凝胶电泳的谱带等方面的差异.结果:蛋白质提取液提取法、TCA-丙酮法提取蛋白含量较高,但杂质多,电泳谱带严重展宽而且明显拖尾;Tris-丙酮法提出的蛋白质种类缺失严重;直接提取法提取蛋白含量少,但杂质少,电泳谱带清晰,离心2次谱带更加清晰.结论:水溶液直接提取法适合用于聚丙烯酰胺凝胶电泳,蛋白质提取液提取法提出蛋白质含量多.
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引种栝楼过氧化物同工酶分析
目的:对国内不同产区栝楼进行种源间亲缘关系的分析.方法:采用烯酰胺凝胶电泳(PAGE)技术对不同种源栝楼过氧化物同工酶(POD)进行研究.结果:不同产区栝楼过氧化物同工酶在酶带数、迁移率和酶量等方面存在差异.栝楼POD酶谱共有10条谱带,分为5个类群,Ⅰ,Ⅴ和其他4个类群亲缘关系都较远,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ这3个类群的亲缘关系较近.结论:过氧化物同工酶谱可以作为不同种源栝楼遗传多样性鉴定的参考依据.
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不同生长时期人参中水溶性蛋白含量比较
目的:针对不同生长时期人参中水溶性蛋白的含量进行比较.方法:以5年生人参为供试材料,应用Bradford蛋白质定量试剂盒测定水溶性蛋白含量,采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法得到人参水溶性蛋白的电泳胶片,并通过凝胶成像分析软件和Origin 7.5软件生成指纹图谱,导出重要技术参数,分析比较不同生长时期人参中水溶性蛋白的分布及含量差异.结果:不同生长时期的人参样品均显示12条水溶性蛋白谱带,且在人参果后参根生长中期直至枯萎期,水溶性蛋白含量达到高.结论:人参水溶性蛋白的含量在不同生长时期存在较大差异,与人参生长的形态建成密切相关.
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驴真皮中主要蛋白的组成及其相互作用的研究
目的:分析阿胶主要原料驴真皮中的主要构成蛋白,研究其相互作用,揭示其分子构成,为阐明阿胶作用机制的研究提供实验依据.方法:分别使用TriPure试剂和通过1%聚丙烯酰胺(SDS)煮沸驴的真皮,提取驴皮中总蛋白质,再使用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质,割胶提取蛋白质,使用毛细管色谱进一步分析蛋白组分.结果:发现驴真皮中主要蛋白质不仅含有胶原蛋白a1(Ⅰ)型、α2(Ⅰ)型,而且还含有血清白蛋白,其中,用TriPure试剂提取蛋白质的总蛋白中,血清白蛋白的含量超过25%;用1%SDS煮沸的总蛋白中,血清白蛋白的含量约20%,并且发现在凝胶电泳带中有2条明显的分子质量为20万左右的蛋白质,割胶提取该蛋白质经过毛细管色谱分析,发现是胶原蛋白与血清白蛋白结合的产物.结论:血清白蛋白是驴真皮中的主要蛋白组分,驴血清白蛋白有可能对于阿胶补血的功能起到比普遍认为胶原蛋白更为重要的作用.
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蒙古黄芪和膜荚黄芪种子酯酶同工酶的研究
黄芪为豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao或膜荚黄芪A.membranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根[1].二者的化学成分有差异导致其药效不同[2],蒙古黄芪的药效更佳,膜荚黄芪不仅药效,而且栽培管理技术、产值均不如蒙古黄芪[3].二者在植物形态特征和生物学特征方面有明显区别,但其种子外形比较相近,肉眼难以区别.本研究利用种子酯酶同工酶聚丙烯酰胺凝胶电泳快速简便的鉴别了蒙古黄芪和膜荚黄芪种子.为蒙古黄芪种子真实性的检验提供理论依据.
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吴茱萸遗传多样性的AFLP分析
目的:应用AFLP技术对吴茱萸的遗传背景进行研究,分析不同产区吴茱萸的遗传特性差异.方法:试剂盒提取吴茱萸幼嫩叶片基因组DNA,构建AFLP实验体系并筛选引物,对来自全国5个省份的46份样品进行遗传背景的研究；用NTSYS-pc 2.1软件对AFLP扩增结果进行聚类分析.结果:从72对AFLP引物中优选6对用于吴茱萸遗传背景的研究,通过研究发现在相关系数为0.53时,浙江地区的吴茱萸石虎变种样品与其他地区样品分开；石虎变种遗传差异比吴茱萸更显著并呈现出较强的地缘相关性.结论:吴茱萸遗传背景差异明显,AFLP分析方法可有效鉴别不同品种的吴茱萸,并能检测到地区间的差异.
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吗啡备用根大鼠脊髓组织神经营养活性物质的分离纯化和生物活性测定
我室以往的研究表明,吗啡作用的部分去传入大鼠脊髓组织提取液中,大于10kD组份具有神经营养活性作用,但尚不知道是哪些分子量的蛋白质具有神经营养活性.为了寻找这些物质,本研究用Sephacryl S-200凝胶层析、高效液相色谱(HPLC)、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和组织培养等技术和方法,进一步分离纯化吗啡备用根大鼠部分去传入的脊髓组织提取液,以期获得某些神经营养活性物质,为吗啡促进脊髓可塑性变化的分子基础提供新资料.
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丝光绿蝇抗菌肽针刺诱导及初步电泳分离
目的 探讨丝光绿蝇抗菌肽的诱导及电泳分离方法.方法 丝光绿蝇3龄幼虫针刺体壁诱导后,第48小时提取其血淋巴,设置3、5、7、10μl不同的加样量和pH值6.0、6.5、7.0的琼脂平板,观察对溶壁微球菌的抑菌效果.置于100、80℃水浴30s、1、3和5min后,观察不同温度处理不同时间后的去杂蛋白效果和对溶壁微球菌的抑菌效果,并对各样品进行电泳分离.结果 随加样量增加抑菌环直径增大,10μl环太大易变形,不易测量,以加7μl血淋巴对溶壁微球菌的抑菌效果佳.平板pH值6.0时,对溶壁微球菌的抑菌环直径大,随pH值增加而抑菌环直径减小.血淋巴100℃水浴30s、1min仍有抑菌活性,处理3和5min无抑菌活性;80℃水浴30s至5min均有抑菌活性,电泳显示100℃处理3和5min的样品与其他相比缺少2条蛋白区带.结论 针刺诱导的丝光绿蝇抗菌肽在酸性条件下抑菌活性更强,分离时血淋巴预处理采用80℃水浴1-3min去杂蛋白效果较好,诱导的血淋巴100℃处理3和5min即丧失抗菌活性,电泳显示缺少2条区带,此2条差异区带可能为抗菌肽组分.
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细菌膜蛋白质组成分提取方法的建立及优化
蛋白质组学研究技术体系的关键环节是建立以高效蛋白质提取为基础的双向电泳技术(two-dimensional electrophoresis,2-DE),因此,如何提高样品蛋白质的提取量和增多样品蛋白质的溶解度是获得高分辨率、高灵敏度和高重复性双向电泳凝胶蛋白质图谱的前提条件.常规主要运用一步法和三步法.目前细菌膜蛋白质的提取多采用一步法,此方法的缺陷严重影响了蛋白质的第一向等电聚集、第二向聚丙烯酰胺凝胶电泳及质谱分析的结果.
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HCV准种的结构蛋白在真核表达系统中的表达
本实验从1份HCV持续性感染者血标本中随机筛选的8个C/E1/E2克隆序列亚克隆入真核表达载体pCI-neo,并转染大肠杆菌DH5α,经氨苄青霉筛选、酶切鉴定及DNA测序,构建为插入C/E1/E2的重组质粒.将1μg重组质粒、0.36 mCi/ml H3-亮氨酸加入TNT/T7 Couple Reticulocyte Lysate Systems (含有25μl TNT Lysate、4U T7 RNA聚合酶、20μmol/L不含亮氨酸的氨基酸混合物、40U RNA酶抑制剂),总反应体积50μl.取5μl反应液进行12% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,抽干凝胶,-70℃放射自显影3 d.
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三种婴幼儿A组轮状病毒检测方法的方法学评价
目的 比较婴幼儿A组轮状病毒三种不同检测方法的优劣性.方法 选择318例婴幼儿粪便或肛拭子标本分别行酶联免疫吸附(EHSA)、聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、胶体金法(GICA)、荧光定量逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测A组轮状病毒,并以荧光定量RT-PCR为标准,对ELISA、PAGE、GICA进行方法学评价.结果 四种检测方法阳性率:ELISA 55.0％、PAGE 43.1％,GICA 53.2％,RT-PCR 58.5％；以RT-PCR为对照,灵敏度(91.4％)、约登指数(0.876)、符合率(93.4％)、阴性预测值(95.5％)以ELISA高,特异度(99.2％)、阳性预测值(99.3％)以PAGE高.结论 ELISA、GICA检测A组轮状病毒操作简单,方法学评价指标良好,适合在基层医院推广应用.
