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耐多药结核分枝杆菌中embB基因突变与乙胺丁醇耐药的相关性研究
目的 研究耐多药结核分枝菌中embB基因突变与乙胺丁醇耐药的相关性.方法 比例法检测84株耐多药结核分枝杆菌的乙胺丁醇(EMB)耐药性,基因测序检测embB基因的突变,x2检验分析二者之间的相关性.结果 84株耐多药结核分枝杆菌中有43株(51.2％)对EMB耐药,41株(48.8％)对EMB敏感,57株耐多药菌株(67.9％)的embB基因发生突变.在43株EMB耐药菌株中,embB基因突变的菌株为40株(93.0％),而41株EMB敏感菌株中,embB基因突变的菌株为17株(41.5％),embB基因在耐药菌株中的突变频率远高于敏感菌株(x2=25.58,P=0.00).embB306是常见的突变位点,其在耐药菌株的突变率也高于敏感菌株(x2=12.37,P =0.00),embB基因和embB306位点检测EMB耐药的敏感度、特异度和准确性分别为93.0％和65.1％,58.5％和73.2％,76.2％和69.0％.结论 EMB耐药的产生与embB基因和embB306突变有关,二者用于检测EMB耐药有一定的参考意义.
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耐多药结核分枝杆菌异烟肼耐药相关基因katG突变分析
异烟肼(isoniazid,INH)是一种重要的抗结核药物,其在细菌体内被过氧化氢酶-过氧化物酶KatG氧化为乙酰异烟肼自由基和活性氧自由基等活性物质,进而攻击结核分枝杆菌多个靶位点来发挥杀菌作用[1].Zhang等[1]通过Southern印迹杂交(Southern blot)发现结核分枝杆菌katG 基因缺失和异烟肼耐药相关.研究表明,异烟肼耐药与许多基因相关,发生频率高的为katG编码区和inhA启动子区的突变[2-3],katG315位突变常见,有30％～94％的耐药株发生该突变[2,4],但国内对于该基因其他位点的突变研究较少.本研究通过对河南省耐多药(multidrug resistant,MDR)结核分枝杆菌katG编码区全长突变进行分析,进一步分析异烟肼的耐药机制.
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未来理想的抗结核药物与化学治疗方案
结核病的化学治疗至今已经历了70多年的演变,曾经一度非常有效的现代结核病化疗方案目前对于耐多药结核分枝杆菌基本"束手无策".WHO在2006年提出了至2015年降低50％的结核病患病率和死亡率,至2050年"消除作为公共卫生问题的结核病"的控制目标,实现这一目标的前提必须是新的抗结核药物的研发应用和新的抗结核化学治疗理念的实施.笔者简单回顾抗结核化学治疗的药物与方案的历史,分析现状,对未来理想的抗结核药物与化学治疗方案提出一些设想.
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宁波地区耐多药结核分枝杆菌乙胺丁醇耐药embB基因突变研究
目的 分析宁波地区耐多药结核分枝杆菌(multiple drug-resistant tuberculosis,MDR-TB)临床分离株的embB基因突变特征,探讨MDR-TB对乙胺丁醇(ethambutol,EMB)耐药的产生与embB基因突变的关系.方法 采用比例法对MDR-TB临床分离株进行EMB敏感性检测,应用DNA直接测序法检测MDR-TB的embB基因突变情况.结果 106株MDR-TB临床分离株中有49株(46.23％)对EMB耐药,57株(53.77％)对EMB敏感,59株(55.66％)发生了embB基因突变.在49株EMB耐药菌株中,embB基因突变的菌株为34株(69.39％),在57株EMB敏感菌株中,embB基因突变的菌株为25株(43.86％),EMB耐药菌株中的embB基因突变率高于敏感菌株(X2=6.958,P＜0.05).embB基因突变类型有embB306,embB354,embB406,以embB306突变多.embB306在EMB耐药菌株中的突变率高于EMB敏感菌株(X2=6.275,P＜0.05).embB基因和embB 306位点检测EMB耐药的敏感度、特异度和准确度分别为69.39％、56.14％％、62.26％和61.22％、63.16％、62.26％.结论 宁波地区MDR-TB对EMB耐药形势较为严峻,embB基因突变与MDR-TB对EMB耐药相关.
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抗痨颗粒对耐多药结核分枝杆菌蛋白质组学的影响
目的:应用蛋白质组学的双向电泳技术,比较分析抗痨颗粒提取物作用前后耐多药结核分枝杆菌的全菌蛋白表达差异,揭示药物作用机制.方法:临床耐多药结核分枝杆菌接种在7H9添加OADC液体培养基中37℃培养6～8d,细菌密度为1×108/mL～2 × 108/mL.抗痨颗粒浸提物的低抑菌浓度(MIC)为0.638 8 g·L-1.加到液体培养基中,作用20 h,终浓度为相当于生药0.255 6 g·mL-1.局部内环境与外部环境完全隔离下,采用双向凝胶电泳分离全菌总蛋白,得到差异表达的蛋白质点进行分析比对.结果:耐多药结核分枝杆菌用药前后,发现了8个差异斑点,确定其中2个蛋白质为:硫代硫酸硫转移酶( thiosulfate sulfurtransferase)和假定蛋白Rv0634A.结论:揭示了抗痨颗粒对耐多药结核分枝杆菌的翻译,结构组成,氨基酸代谢,氰化物和H2S的解毒以及硫和铁转移等各方面均有一定影响,从而破坏结核分枝杆菌的生活能力,从而达到抑制结核分枝杆菌的目的.
关键词： 抗痨颗粒 耐多药结核分枝杆菌 蛋白质组 硫代硫酸硫转移酶 假定蛋白Rv0634A -
结核分枝杆菌快速药敏实验研究进展
结核分枝杆菌引起的结核病是全球范围内普遍的慢性传染病之一,据估计全球有三分之一的人感染过结核分枝杆菌,亚洲地区占全世界受感染人群的三分之二.我国是全球22 个结核病高发病国家之一,发病人数位居世界第二位,仅次于印度[1 ] .全国第四次结核病流行病学抽样调查显示,我国结核病疫情有高患病率、高耐药率、低递减率等特点.[2]耐多药结核分枝杆菌(multi-drugresistant TB, MDR-TB)的流行扩散使结核病的治愈率大幅下降,在初治和复治患者中的治愈率分别为40%和20%[3] ,严重遏制了WHO 结核病控制策略的实施及千年发展目标的实现,是全球结核病控制的一个难题.
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结核分枝杆菌新疆临床分离株耐药情况调查
目的 分析新疆部分地区结核分枝杆菌(MTB)临床分离株对抗结核药物的耐药情况,探讨本地区耐药结核病的发生率及特点. 方法收集2008年11月～2009年10月新疆喀什、和田、皮山等南疆地区确诊的结核病患者痰液标本,进行MTB的分离培养及菌种初步鉴定,并应用比例法对分离菌株进行耐药性检测,与本课题组所做北疆地区耐药情况进行比对. 结果共分离到102株分枝杆菌,88株(86.3%)属于结核分枝杆菌复合群,7株(6.9%)属于牛分枝杆菌,7株(6.9%)属于非结核分枝杆菌.88株结核分枝杆菌中对1种以上抗结核药物具有耐药性的有20株,总耐药率为22.7%(20/88),MDR-TB为6.8%(6/88).新疆南疆地区4种一线抗结药物的耐药率:H 15.9%、R 8.0%、S12.5%、E 3.4%,明显低于新疆北疆地区抗结药物的耐药率:H 53.3%、R 28.5%、S 48.4%、E 46.8%. 结论新疆南疆地区结核总耐药率有所下降,耐多药率有上升趋势,在结核病防治工作中应给予高度重视;新疆南、北疆地区耐药情况不同,北疆耐药率明显高于南疆地区.
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耐多药结核分枝杆菌基因突变分析
目的 对临床分离的耐多药结核分枝杆菌株进行基因突变分析. 方法 对耐多药结核分枝杆菌临床分离菌株进行耐药基因的PCR检测,利用基因序列测定方法分析耐药基因突变情况. 结果 从耐多药结核病(MDR-TB)患者临床分离菌株中快速检测到rpoB、katG、rpsL、embB基因及其突变.耐多药菌株、全耐及单耐利福平分离菌株均检测rpoB基因点突变,突变位点主要为第516、526和531常见密码子,1例MDR-TB出现第479位和第531位密码子同时突变.耐多药菌、全耐菌及单耐异烟肼的菌株均检测有katG基因点突变,突变位点均为第2 066位碱基C突变为G.全耐菌和对乙胺丁醇(EMB)耐药的耐多药菌株均检测有embB基因点突变,突变位点均为第306位密码子ATG突变为ACG.全耐菌和对链霉素(SM)耐药的MDR-TB菌株均检测有rpsL基因点突变,突变密码子为CCT突变为CTT,其中从1株对SM敏感的MDR-TB中也检测到突变.全敏感株、标准株及利福平(RIF)、异烟肼(INH)或EMB敏感的耐药株均无rpoB、katG或embB基因突变. 结论 PCR及基因序列测定可快速检测耐多药结核基因,结核分枝杆菌耐多药性与多个基因突变相关.
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应加强我国结核病实验诊断研究的原创性和实用性
由于耐多药结核分枝杆菌(结核菌)的增多、艾滋病患者增加以及人口流动的加快,全世界结核病和非结核菌病已成为一个日益严重的公共卫生问题.虽然非结核病的临床表现、X线特征与肺部感染(结核病、支气管扩张合并感染等)极其相似;涂片发现抗酸杆菌与结核菌形态学上很难鉴别,但临床治疗差别较大,许多非结核菌病对抗结核药耐药率偏高或呈天然耐药性.若按结核病治疗,即使病人经长期规范化疗而疗效依然不佳,成为所谓"难治、复治"结核病人[1].因此,分枝杆菌的培养、菌种鉴定对结核病的诊断、鉴别诊断和有效化疗都有极其重要的意义.尽管我国自然科学研究基金每年都有结核病研究的课题,耐多药结核病的快速检测也被作为国家"十五"攻关项目,但迄今我国结核病的实验诊断尚未取得突破性进展,且多为重复他人实验,缺乏原创性和实用性.
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硝酸盐还原试验直接检测痰标本中结核分枝杆菌耐药性
WHO报道2005年全球有880万结核病新发病例,死亡病例160万[1],而且,这种情况随着艾滋病和耐多药结核分枝杆菌的流行而日趋严峻[1-3].监测结核分枝杆菌耐药性是控制耐多药菌株流行的有效方法之一.然而,目前所用方法受到检测费用高和检测时间长等不利冈素的限制,因此,急需发展快速价廉的检测方法.
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何谓MIC?分枝杆菌药敏试验为什么要测定MIC?
答: MIC是在一定培养时间内可抑制99%以上的菌生长的低药物浓度.目前,由于临床上耐多药结核分枝杆菌(结核菌)和非结核菌感染的增多,常规抗结核药敏试验方法已不适用于它们,而且一些新的抗结核药物也无药物是否敏感的判断标准,在采用某一药物治疗前,好先进行此药物MIC测定,以便于临床用药.
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结核分枝杆菌耐药基因突变的研究
结核病在许多国家出现回升的一个主要原因是细菌耐药性问题,随着联合药物治疗的使用,又出现了耐多药结核分枝杆菌(结核菌),使许多结核病,难以治疗,增加了死亡率[1].
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河南省耐多药结核分枝杆菌利福平耐药相关基因rpoB突变分析
目前认为,编码RNA聚合酶beta亚基rpoB基因突变,使利福平不能与其结合而产生对利福平耐药[1].单耐利福平菌株的rpoB基因突变多分布在利福平耐药决定区(rifampin resistance determining region,RRDR),且通过检测RRDR区内特定突变可发现95%～98%的利福平耐药菌株[1],但仍有2%～5%耐药菌株的耐药机制不明.本研究对较大样本量的耐多药MTB利福平耐药相关基因rpoB编码区进行突变分析,以进一步阐明其耐药机制.
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上海地区耐多药结核菌突变特点
快速诊断并阻断耐多药结核茵的传播对控制耐多药结核病疫情具有非常重要的意义.结核分枝杆菌生长缓慢,传统的基于固体培养的药物敏感试验非常耗时,新的基于耐药突变的分子诊断方法将是快速诊断的发展趋势.结核分枝杆菌耐药与基因组上特定基因的点突变有关.目前WHO审核通过了2个基于检测突变的快速诊断产品,但由于不同地区耐药突变特点不同,其在不同地区检测的敏感性和特异性有很大差异.我们观察了上海地区耐多药结核分枝杆菌耐药基因突变特点,筛选出一套高敏感耐药突变位点用于耐药结核病的快速诊断.
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应用PCR-荧光探针法快速检测耐多药结核分枝杆菌基因型
目的 评价PCR-荧光探针法快速检测耐多药结核分枝杆菌基因型的临床应用价值.方法 应用PCR-荧光探针法对142份涂阳痰液样本进行分子菌种鉴定,对鉴定为结核分枝杆菌复合群的标本进行katG、inhA、rpoB 耐药基因突变位点检测,并与传统药敏试验结果比较.结果 142份涂阳痰样本中3份鉴定为非结核分枝杆菌,139份鉴定为结核分枝杆菌复合群;139株结核分枝杆菌中92株未检测出katG、inhA、rpoB基因耐药检测位点突变,其中传统药敏结果72株为HSRS、6株为HSRR、14株为HRRR; 33株检测出katG和rpoB或inhA和rpoB两个基因耐药位点突变,传统药敏结果均为HRRR;11株检测出katG或inhA耐药基因位点突变,传统药敏结果均为HRRS;1株检测出rpoB耐药基因位点突变,传统药敏结果为HSRR,药敏试验符合率为84.17％;对部分样本行PCR产物直接测序(PCR-DS),结果显示,PCR-荧光探针和PCR-DS检测耐多药结核分枝杆菌基因型结果符合率为100.00％.结论 PCR-荧光探针法快速检测耐多药结核分枝杆菌基因型简便、快速,具有临床推广应用价值.
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苦参提取物对耐多药结核分枝杆菌感染小鼠模型免疫功能的调节作用
目的 分析苦参提取物对耐多药结核分枝杆菌(MDR-TB)感染小鼠模型免疫功能的调节作用.方法 选取30只健康雄性昆明种小鼠,采用随机数字表法分为正常组、对照组及苦参提取物组,每组10只.对照组及苦参提取物组小鼠通过尾静脉注入MDR-TB 3 mL,正常组尾静脉内注入等量0.9％ NaCl注射液.苦参提取物给予200mg/kg苦参提取物灌胃,正常组和对照组给予等体积极0.9％ NaCl注射液灌胃.采用流武细胞仪测定血清CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平;采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测血清γ干扰素(IFN)、白细胞介素(IL)4、IL-10、IL-12等细胞因子水平及补体C3、补体C4、免疫球蛋白(Ig)G、IgM、IgA水平变化.结果 苦参提取物组血清CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平高于对照组[(0.62±0.08)％比(0.53±0.06)％,(0.50±0.06)％比(0.40±0.05)％,(1.68±0.20)比(1.42±0.12),P＜0.05],CD8+水平低于对照组[(0.20±0.04)％比(0.29±0.05)％,P ＜0.05];与正常组[(0.64±0.07)％、(0.56±0.08)％、(0.15±0.03)％、(1.73±0.18)％]比较差异无统计学意义(P＞0.05).苦参提取物组血清IFN-γ 、IL-12高于对照组[(1.37±0.08) ng/L比(1.18±0.05) ng/L,(2.35±0.12) ng/L比(2.08±0.11) ng/L],血清IL-10、IL-4低于对照组[(12.01±0.25) ng/L比(12.47±0.26) ng/L,(6.02±0.23) ng/L比(6.31±0.27) ng/L,P＜0.05];与正常组[(1.55±0.14) ng/L、(11.23±0.26) ng/L、(5.56±0.27) ng/L、(24.7±0.07) ng/L]比较差异无统计学意义(P＞0.05).苦参提取物组血清C3、C4、IgG、IgM、IgA高于对照组[(1.01±0.15) g/L比(0.67±0.09) g/L,(0.26±0.06) g/L比(0.19±0.03) g/L,(13.22±1.91) g/L比(7.92±0.94) g/L,(2.57±0.63) g/L比(1.84±0.37) g/L,(1.28±0.33) g/L比(0.52±0.11) g/L,P＜0.05];与正常组[(1.27±0.20) g/L、(0.31±0.08) g/L、(15.82±1.75) ng/L、(2.91 ±0.65) g/L、(1.35±0.37) g/L]比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 苦参提取物可以同时提升MDR-TB小鼠的细胞免疫及体液免疫水平,具有明显的抗MDR-TB作用,可以作为苦参提取物应用于临床MDR-TB感染患者治疗的依据.
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女性生殖器结核
由结核分枝杆菌引起的感染称为结核病.其中以肺结核为常见,结核菌感染女性生殖系统称为生殖器结核,又称结核性盆腔炎.多见于20～40岁的年轻妇女.近年来,伴有艾滋病的结核病发病率增加和耐多药结核分枝杆菌(MDR)的出现,引起了国内外的普遍关注.
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中药苦参提取物对MDR-TB感染小鼠细胞免疫的调节作用
目的 探讨苦参提取物对耐多药结核分枝杆菌(multiple drugs resistant bacillus tuberculosis,MDR-TB)感染小鼠免疫功能的调节作用.方法 采用静脉注射建立小鼠MDR-TB感染模型,将30只健康雄性小鼠随机分为3组(正常组、模型组和苦参提取物组),每组10只,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测小鼠血清中与结核免疫密切相关的细胞因子γ-干扰素(IFN-γ)、白介素-4(IL-4)、白介素-10(IL-10)和白介素-12(IL-12)含量的变化,同时分离出单个核细胞(PBMC),抽提全部核糖核酸(RNA),采用逆转录PCR(RT-PCR)法检测PBMC中IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-12及颗粒裂解肽(GLS)的信使核糖核酸(mRNA)变化.结果 苦参提取物组与模型组比较,小鼠血清中的IFN-γ、IL-12含量明显升高,IL-4、IL-10含量明显下降,差异有统计学意义(P＜0.05);与正常组比较,IFN-γ、IL-4、IL-10和IL-12的含量差异无统计学意义(P＞0.05).在mRNA表达水平上,苦参提取物组小鼠PBMC中IFN-γ、IL-12、GLS表达明显升高,IL-4、IL-10 mRNA表达明显下降,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 苦参提取物可以通过上调基因转录水平增强小鼠的细胞免疫功能,具有较明显的抗MDR-TB作用,为临床治疗尘肺合并结核患者感染的MDR-TB提供了理论依据.
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分枝杆菌药物外排泵及其在耐药机制中作用
近年来,分枝杆菌耐药现象日趋严重,耐多药结核分枝杆菌也日渐增多,导致其感染的难治性.分枝杆菌内在性耐药主要是细胞壁通透性障碍,导致药物进入高疏水性细胞壁间隙比较慢;而获得性耐药主要是基因突变,导致抗生素靶位变异或药物在细胞内处于无活性状态.但仅凭天然细胞壁屏障作用和基因突变因素尚不足以解释分枝杆菌耐药机制.研究表明,分枝杆菌存在药物主动外排泵的表达,并被视为是可能的另一种重要耐药机制[1,2].现就分枝杆菌外排泵的生物学功能及其基因调控机制研究进展综述如下.
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TDM/TDB是结核亚单位疫苗的重要佐剂
结核病是严重危害人类健康的慢性传染病,每年造成全球二百万人死亡[1],我国结核病患者人数仅次印度,位于世界第二位.我国结核病的耐药状况不容乐观,耐多药结核分枝杆菌的出现给结核病的防治带来巨大的挑战 [2].在多数高负担的发展中国家,由于环境中的细菌长期诱导低水平的抗菌免疫,卡介苗(BCG)缺乏有效性,急需研制有效的结核疫苗控制结核疫情[3].重组结核蛋白亚单位疫苗Ag85B-ESAT6(H1)正是一种极具前景的新型疫苗.
