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封闭端粒酶活性对肺癌细胞系的生长抑制作用
目的研究端粒酶反义核苷酸对肺癌细胞体内外生长的影响,探讨封闭端粒酶抑制肺癌细胞生长的可行性.方法端粒酶反义DNA与端粒酶阳性肺癌细胞系共同培养,观察其对肺癌细胞端粒酶活性、细胞形态和生长特性的影响;荷瘤小鼠肿瘤局部注射反义DNA,初步观察其对动物体内肿瘤有无生长抑制作用.结果端粒酶反义DNA对两个端粒酶阳性肺癌细胞系生长、集落形成有明显的抑制作用,细胞形态发生明显改变.注射反义DNA裸鼠肿瘤,瘤重明显低于生理盐水组(P＜0.05).结论端粒酶反义DNA序列对肺癌细胞系有明显的生长抑制作用.
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转染血管紧张素Ⅱ受体(AT1)反义核苷酸对血管平滑肌细胞增殖的影响
目的:评价转染AT1反义核菩酸(AT1A)对血管平滑肌细胞(VSMCs)血管紧张Ⅱ(AngⅡ)受体亚型mRNA表达、蛋白激酶C(PKC)、丝裂素活化蛋白激酶p38(P38MAPK)蛋白表达,及蛋白核酸合成的作用.方法:RT-PCR克隆AT1 cDNA序列(476bp),将克隆的AT1cDNA反向插入PcDNA3.1,构建一完整的含AT1A的质粒(PAT1A),测序鉴定.转染培养的大鼠VSMCs,RT-PCR检测转染VSMCs AT1mRNA表达.AngⅡ(10-7mol/L)刺激24 h后,比较转染与非转染的VSMCs AT1与AT2 mRNA表达(RT-PCR)、P38MAPK和PKC蛋白表达(免疫印迹,western blot)、蛋白核酸合成(3H-Leucine及3H-Thymidine掺入).结果:成功构建PAT1A.RT-PCR显示转染VSMCs AT1 mRNA表达量显著减少,与对照VSMC相比差异显著(P＜0.01).AngⅡ(10-7mol/L)刺激24 h后,与非转染VSMCs相比,转染VSMCs AT1 mRNA明显减少(P＜0.01),AT2 mRNA明显增加(P＜0.01);但两组间PKC和P38MAPK蛋白表达;3H-Leu及3H-TdR掺入量均无显著性差异(P＞0.05).结论:经AT1A封闭后,能显著抑制VSMC AT1mRNA表达,同时上调AT2 mRNA.单纯封闭AT1 mRNA并不能有效阻断AngⅡ介导的VSMCs蛋白核酸合成及VSMCs生长相关的信号转导,其他信号通路可能有代偿作用.
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KAI1基因对MHCC97-H细胞裸鼠成瘤及转移的影响
目的:研究肿瘤转移抑制基因KAI1对MHCC97-H细胞裸鼠成瘤及转移的影响.方法:将已转染KAI1正、反义核苷酸的高转移潜能肝癌细胞MHCC97-H接种裸鼠皮下,观察皮下肿瘤生长情况,再将皮下肿瘤组织进行裸鼠原位肝接种,观察接种后肿瘤肺转移情况.其中,转染空载体及未转染的MHCC97-H亲本细胞作为实验对照组.结果:正义组、反义组、空载体组及亲本细胞组裸鼠皮下均成瘤,肿瘤出现的时间、肿瘤块生长的速度无明显差异,生长方式上反义组表现出明显的侵袭性.原位肝接种6 wk后裸鼠肺部均出现癌巢,AFP染色可见癌巢中肿瘤细胞质有黄色颗粒沉着,证实为肝癌转移至肺形成的转移灶.与MHCC97-H亲本细胞组比较,反义组转移灶数目明显增加(P=0.0 0158),正义组转移灶数目明显减少(P=0.00465),差异均有显著性,而载体组转移灶数目无明显变化(P=0.15166).结论:肿瘤转移抑制基因KAI1对MHCC97-H细胞裸鼠成瘤性及肿瘤生长无明显影响,但上调KAI1蛋白的表达水平能在一定程度上降低肿瘤的侵袭性、抑制转移的发生.这为肝癌的抗转移治疗研究提供了重要线索.
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bcl-2反义核酸增强柔红霉素诱导原代白血病细胞凋亡的研究
研究表明:bcl-2基因的过度表达可明显降低化疗药物引起的细胞凋亡,针对bcl-2 mRNA翻译起始部位的反义核苷酸可抑制许多肿瘤细胞中bcl-2的表达,促进细胞的凋亡,提高肿瘤细胞对化疗的敏感性[1].我们在前一阶段的研究中[2],已经在bcl-2 mRNA翻译起始区和蛋白编码区发现了2个有效反义作用靶点.本研究进一步观察这两个有效序列的反义寡核苷酸是否会增强柔红霉素(DNR)诱导原代培养的急性白血病(AL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)的细胞凋亡,期望为白血病的治疗开辟一条新的途径.
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声振脂质微泡作为反义寡核苷酸传递系统的研究
目的 研究声振脂质微泡(PGM)作为反义寡核苷酸传递系统的可行性.方法 应用PGM将结合荧光蛋白的反义核苷酸片段ZL转染到乳腺癌细胞SK-BR-3中,考察不同因素如:ZL浓度、PGM浓度、超声持续时间和机械指数(MI)等对ZL转染率及细胞存活率的影响.考察PGM的结果,并与其他脂质载体如lipofectamine和脂质体的转染效果比较.应用荧光显微镜观察转染率,碘化丙锭(PI)染色观察细胞存活率.结果 考察因素中,PGM浓度,超声持续时间和MI对ZL转染率和细胞存活率影响较大.佳超声条件为:PGM浓度为2%,超声持续时间为30 s和MI为1.0,在此条件下转染率为78%±10%,比未超声的PGM(4.0%)和lipofectamine(4.3%)的转染率增加了约18倍,而细胞存活率相近.结论 在适宜条件下,声振脂质微泡可以有效促进体外反义核苷酸的转染.
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反义核苷酸技术在胃癌中的应用研究进展
反义技术是1984年由Izant等首先提出的,根据碱基互补原理,用外来合成特定的互补的反义核苷酸与细胞内核酸相互作用以抑制或封闭该表达.目前反义技术在肿瘤治疗的研究中已成为热点之一,并且已取得了一些成绩.现将对其在胃癌中的研究重点介绍如下.
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环氧合酶-2反义寡核苷酸对宫颈癌Hela细胞周期的影响
目的 探讨环氧合酶-2(COX-2)反义寡核苷酸抑制Hela细胞增殖的机制及其临床意叉.方法 2004年5月至2005年5月在温州医学院附属一院将Hela细胞用MEM培养基培养,像差倒置显微镜下观察细胞的增殖情况.Hela细胞分4组培养:正常对照组、反义寡核苷酸(ASODNS)转染组、正义寡核苷酸(SODNS)转染组、脂质体处理组.细胞转染后48h,采用流式细胞仪检测各组细胞周期的变化.结果 反义寡核苷酸转染组细胞的增殖受到了显著抑制,ASODNS处理的细胞与其它组比较,G2/M期细胞[(10.75±0.24)%]所占比例增高明显(P＜0.05),S期细胞[(10.13±0.04)%]比例明显减少,差异有显著性意叉(P＜0.05),而G0/G1期[(79.12±O.06)%]无统计学意义的改变.结论 ASODNS对Hela细胞的增殖具有抑制作用,其抑制机制可能与引起细胞周期再分布,降低s期细胞比例及阻滞细胞G2/M期有关.
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大鼠侧脑室及鞘内注射孤啡肽对痛反应及电针镇痛的影响
孤啡肽(orphanin FQ,OFQ)是近发现的一种17肽,为阿片受体家族中一个新成员--"孤儿受体"(orphan receptor)的内源性配基.OFQ在痛觉调制中的作用与内阿片肽明显不同.本实验在大鼠电刺激甩尾测痛模型上,观察了侧脑室(ICV)及鞘内注射(IT)OFQ对伤害性电刺激引起的痛反应及电针镇痛的影响.结果发现,大鼠ICV及IT0.1μg(0.055 nmol)OFQ对痛反应无影响,而1.0μg(0.55 nmol)的OFQ可明显降低痛阈;但两种剂量的OFQ无论是脑室还是鞘内给药,均可对抗电针镇痛;采用反义核苷酸技术阻断OFQ受体合成,大鼠痛阈升高,此时再给予OFQ,则电针镇痛效应无明显改变.表明OFQ对基础痛阈的影响与剂量有关:小剂量无影响,大剂量使痛阈降低.但无论对基础痛阈有无影响,OFQ均对抗电针镇痛.
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反义寡核苷酸抗癌药Oblimersen钠盐
传统的癌症治疗手段包括手术治疗和放化疗,但因放化疗为全身性作用,副作用较大,其应用受到限制.近年来,人们致力于研究与开发特异性靶向肿瘤而不伤及健康细胞的新型抗癌疗法,反义疗法便是其中之一.
关键词： oblimersen 反义核苷酸 Bcl-2 抗癌活性 -
反义caveolin-1对实质肿瘤细胞中β3-半乳糖基转移酶7表达的调节作用
目的:研究反义caveolin-1对实质肿瘤细胞中β3-半乳糖基转移酶7(β3GalT7)表达的调节,以期阐明caveolin-1与β3GalT7的相关性.方法:运用脂质体介导转染人工合成的caveolin-1反义核苷酸(ASODN)至人类4种实质肿瘤细胞中,通过荧光显微镜、RT-PCR及蛋白质印迹检测β3GalT7表达的变化.结果:转染反义caveolin-1后的4种实质肿瘤细胞中β3GalT7均有明显的增强.结论:表明caveolin-1调节肿瘤细胞中β3GalT7的表达,且与β3GalT7的表达呈负相关.
关键词： β3-半乳糖基转移酶7 Caveolin-1 反义核苷酸 肿瘤细胞 -
抑制Bax基因表达与细胞保护的研究进展
细胞凋亡是基因控制的细胞死亡,与多种生理和病理过程有关.Bax蛋白是细胞凋亡通路中的促凋亡成员,有6种亚型,抑制其表达或功能可增强细胞的抗凋亡作用,有利于细胞的保护和存活.本文就近年来影响Bax蛋白的多种因素,Bax基因敲除后生物效应和以Bax-mRNA为靶点的反义核苷酸的研究进展作一概述.
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Hsa-miR-204反义核酸提高MOLT-4细胞对苦参碱的敏感性研究
目的 研究miR-204的反义核酸(anti-miR204 oligonucleotides,AMO-miR-204)联合苦参碱观察其对人急性淋巴细胞白血病细胞株(MOLT-4)生长与凋亡的影响及机制.方法 将一定浓度的人工合成的AMO-miR-204经脂质体包裹转染MOLT-4细胞,并联合不同浓度的苦参碱作用于MOLT-4细胞48 h后,采用MTT法检测单用AMO-miR-204、单用苦参碱及AMO-miR-204联合苦参碱对MOLT-4细胞增殖抑制作用,流式细胞术检测细胞早期凋亡率;实时荧光定量RT-PCR检测细胞 Bcl-2mRNA 的表达水平;克隆形成抑制实验检测克隆形成能力.结果单用苦参碱的IC50为0.75 mg·L-1;苦参碱与阴性对照联合使用,IC50为0.29 mg·L-1,表现为相加作用;苦参碱与AMO- miR-204联合使用,IC50为0.07 mg·L-1,增敏倍数为10.7,表现为协同作用.流式细胞术结果显示:联合组比单用组早期凋亡率明显增高,凋亡率达25.4%.单用AMO-miR-204、苦参碱及两者联均能下调 Bcl-2mRNA基因的表达水平,对MOLT-4细胞克隆形成逐渐减小,其中两者联合的克隆数为(28±3.0).结论 AMO- miR-204可提高MOLT-4细胞对苦参碱的敏感性,其机制可能为通过下调Bcl-2 mRNA的表达水平,促进MOLT-4细胞早期凋亡,并抑制其克隆形成有关.
关键词： Hsa-miR-204 反义核苷酸 急性淋巴细胞白血病 苦参碱 -
多胺胆固醇缀合物纳米粒作为反义核苷酸传递系统的研究
目的 研究多胺胆固醇缀合物传递反义核苷酸的能力.方法 通过对自制脂质体的载药量、红细胞毒性、M3骨髓瘤细胞的转染实验.结果 自制脂质体具有比常规脂质体良好的载药量,并且对缸细胞毒性相对偏小,对M3骨髓瘤细胞具有一定的转染能力.结论 自制的脂质体具有一定的应用前景.
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微小RNA-21表达的下调对食管鳞癌细胞中K-ras表达的影响
目的 观察微小RNA-21(miR-21)表达的下调对食管鳞癌细胞中癌基因K-ras表达的影响,为寻求食管癌临床治疗的新方法提供理论依据.方法 设计合成1条miR-21反义寡核苷酸(ASODN)及1条无关序列寡核苷酸(N-ODN)分组转染培养的食管癌EC9706细胞株.采用原位杂交法及免疫组织化学检测食管鳞状细胞癌组织及细胞中转染前后miR-21及K-ras的表达.采用半定量反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot技术检测转染后K-ras mRNA和蛋白相对表达的变化.结果 食管癌组织、正常食管黏膜组织中miR-21的表达率分别为77.5％和25.0％;K-ras的蛋白阳性表达率分别为67.5％和5.0％;K-ras的mRNA阳性表达率分别为62.5％和0.0％,两组间比较,差异有统计学意义(P＜0.05).3种不同浓度的miR-21 ASODN对食管癌EC9706细胞中K-ras的蛋白及mRNA表达均有显著的抑制作用,且以浓度为250 mg/L的ASODN作用72 h抑制效果强.转染miR-21 ASODN后,EC9706细胞中K-ras mRNA和蛋白的相对表达均明显降低(P＜0.05).结论 miR-21表达的下调可抑制食管鳞癌EC9706细胞中K-ras的表达.miR-21及K-ras可能参与了食管鳞癌发生、发展.
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反义DcR3寡核苷酸协同顺铂诱导胶质瘤细胞凋亡
目的 观察陷阱受体3(DcR3)反义核苷酸(ASODN)与顺铂对胶质瘤细胞的影响.方法 设计DcR3反义核苷酸,转染U251细胞,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot方法观察DcR3 mRNA和蛋白有无降低,用噻唑蓝(MTT)比色法、荧光显微镜DAPI染色分别检测对照组、顺铂组、反义核苷酸组、协同作用组对胶质瘤细胞U251的影响.结果 反义DcR3寡核苷酸组可有效地降低DcR3 mRNA和蛋白表达,DcR3/β-actin比值分别为(12.4±3.1)%和(13.5±4.2)%,错义链组、脂质体组、对照组mRNA和蛋白分别为(68.8±4.5)%、(74.5±5.0)%、(71.3±6.4)%和(78.2±6.8)%、(79.8±4.5)%、(76.4±5.6)%,差异有统计学意义(P<0.05).顺铂与反义寡核苷酸组细胞凋亡率分别为(18.32±2.32)%和(20.43±3.45)%,较对照组(5.21±0.45)%,差异有统计学意义(P<0.05),两者与协同处理组(45.23±6.78)%比较,差异有统计学意义(P<0.05).结论 DcR3反义核苷酸与顺铂协同作用可有较强的促胶质瘤细胞凋亡作用.
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靶向封闭survivin诱导喉癌细胞凋亡及抑制其增殖的体外实验
目的:探讨靶向抑制survivin 表达对喉癌细胞凋亡和增殖的影响.方法:构建survivin反义RNA表达载体.用脂质体转染技术将重组质粒转染人喉癌细胞株Hep-2,利用G418(300 g/L的维持浓度)筛选,获得稳定转染株(HpEGFP/survivin).用Western-blot检测survivin 反义RNA封闭survivin后蛋白表达效果.吖啶橙染色和流式细胞仪、四唑盐(MTT)和软琼脂集落形成实验分别检测HpEGFP/surivin的凋亡和增殖状态的改变,并与Hep-2和转染空载体的细胞(HpEGFP-C1)进行比较.结果:Western-blot结果表明,构建的survivin反义RNA表达载体部分抑制了Hep-2 survivin蛋白的表达.转染反义survivin RNA载体的HpEGFP/survivin较Hep-2和HpEGFP-CI凋亡增多,其凋亡率较空载体对照组增加1.81倍,而其增殖力下降(P＜0.01),软琼脂集落形成能力也明显下降(P＜0.05).结论:构建的survivin反义RNA表达载体部分抑制survivin蛋白的表达,并拮抗了survivin基因的抗凋亡作用,抑制喉癌细胞体外增殖能力和生存能力.
关键词： 反义核苷酸 基因 survivin 喉癌细胞株Hep-2 细胞凋亡 -
转染血管紧张素Ⅱ1型受体反义核苷酸对血管外膜成纤维细胞增殖的影响
为了评价转染血管紧张素Ⅱ1型受体反义核苷酸对血管外膜成纤维细胞血管紧张素Ⅱ受体亚型mRNA表达,及细胞内核酸蛋白质的合成水平的作用.采用逆转录-聚合酶链反应克隆血管紧张素Ⅱ1型受体 cDNA序列(476 bp),将克隆 cDNA反向插入PLXSN,构建一完整的含血管紧张素Ⅱ1型受体的质粒,并转染入培养的血管外膜成纤维细胞,逆转录-聚合酶链反应和免疫印迹鉴定其转染后血管紧张素Ⅱ1型受体mRNA和蛋白表达.比较血管紧张素Ⅱ 10-7mol/L刺激24 h后的转染及非转染的血管外膜成纤维细胞血管素Ⅱ受体各亚型 mRNA表达、细胞内核酸蛋白质的合成水平.转染组血管紧张素Ⅱ1型受体mRNA和蛋白表达量显著减少,对照组相比差异显著(P<0.01).血管紧张素Ⅱ 10-7 mol/L刺激 24 h后,与对照组血管外膜成纤维细胞相比, 转染组血管紧张素Ⅱ1型受体 mRNA表达明显减少,血管紧张素Ⅱ受体Ⅱ型 mRNA表达明显增加 (P<0.01),但两组间核酸和蛋白合成均无显著差异(P>0.0 5).提示反义核苷酸封闭后,血管外膜成纤维细胞血管紧张素Ⅱ1型受体 mRNA表达显著抑制,同时血管紧张素Ⅱ受体Ⅱ型mRNA上调.单纯封闭血管紧张素Ⅱ1型受体mRNA并不能有效阻断血管紧张素Ⅱ介导的血管外膜成纤维细胞生长.
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Survivin反义寡核苷酸对人肝癌细胞的抑制作用
目的 探讨survivin反义寡核苷酸(ASODN)对人肝癌细胞HepG2的抑制作用.方法 采用免疫组织化学法检测肝细胞癌(HCC)组织中survivin的表达.采用脂质体介导survivin ASODN体外转染人肝癌细胞株HepG2,Western blot检测细胞survivin蛋白的表达,FCM检测细胞的凋亡率,观察细胞在软琼脂中的集落形成能力.建立人肝癌裸鼠皮下移植瘤模型,观察survivin ASODN的体内抑癌作用. 结果 (1)肝癌组织中survivin表达阳性率为75.8 %(25/33),明显高于癌旁组织和正常肝组织(P<0.01);(2)survivin ASODN体外转染可明显下调HepG2细胞survivin蛋白表达,ASODN组HepG2细胞凋亡率明显高于空白对照组和SODN组(P<0.01),ASODN组HepG2细胞在软琼脂中形成的集落数目明显少于空白对照组和SODN组(P<0.01);(3)ASODN组瘤体生长速度较空白对照组和SODN组明显减慢(P<0.01),ASODN组瘤体重量较空白对照组和SODN组明显减轻(P<0.05).结论 Survivin在HCC组织中高表达;survivin ASODN可以诱导HepG2细胞凋亡,在体外实验和动物实验中对HepG2细胞生长都有抑制作用.
关键词： 肝肿瘤 实验性 蛋白Survivin 反义核苷酸 基因疗法 -
白蛋白纳米载体介导的反义核酸对肝癌细胞端粒酶活性的抑制
目的 利用纳米载体增强端粒酶反义寡核苷酸时肝脏肿瘤细胞端粒酶活性的抑制作用.方法 实验设6组:空白对照组、纯纳米粒组、游离正义寡核苷酸组、游离反义寡核苷酸组、正义寡核苷酸-纳米粒组和反义寡核苷酸-纳米粒组.用TRAP-ELASA法检测端粒酶反义寡核苷酸对肿瘤细胞端粒酶活性的影响,以MTT法测定端粒酶反义寡核苷酸对肝脏肿瘤细胞(HepG2)生长的抑制作用.结果 ①纯纳米粒组、游离端粒酶正义核苷酸组和端粒酶正义核苷酸-白蛋白纳米粒处理组的端粒酶活性与空白对照组差异无显著性(P>0.05).②游离端粒酶反义核苷酸和端粒酶反义核苷酸-白蛋白纳米粒处理的肿瘤细胞的端粒酶活性与空白对照相比明显下降(P<0.05),且两者之间差异存在显著性(P<0.05).③纯纳米粒组、游离端粒酶正义核苷酸和端粒酶正义核苷酸-白蛋白纳米粒对肿瘤细胞的抑制作用很小.游离端粒酶反义核苷酸的抑制作用明显,端粒酶反义核苷酸-白蛋白纳米粒的抑制作用强,两者之间差异有显著性(P<0.05).结论 白蛋白纳米粒可作为反义技术治疗的有效载体,增强端粒酶反义核苷酸的抑制作用.
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碘化N-正丁基氟哌啶醇减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤作用的机制研究
目的:探讨碘化N-正丁基氟哌啶醇(F2)减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤的分子生物学机制.方法:用大鼠在体心肌缺血再灌注模型,通过测定血清中肌酸激酶、乳酸脱氢酶的活性观察心脏损伤的情况;通过测定心肌组织中髓过氧化物酶、超氧化物歧化酶、丙二醛的变化,观察中性粒细胞浸润、氧自由基及脂质过氧化的情况.Western blot法测定心肌缺血组织中早期生长反应基因-1(Egr-1)蛋白水平的变化.结果:与对照组比,反义核苷酸组及反义核苷酸+F2组Egr-1蛋白表达明显减少(P＜0.05),炎症反应及心肌损伤程度明显减弱(P＜0.05);反义核苷酸+F2组与反义核苷酸组比,Egr-1蛋白表达无统计学意义(P＞0.05),心肌损伤及炎症反应程度明显减轻(P＜0.05).结论:F2可通过抑制Egr-1蛋白表达,起到减轻心肌缺血再灌注损伤的作用,除抑制Egr-1蛋白的高表达外,F2还可通过其他机制起到抗心肌缺血再灌注的作用.
