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Cbfα1基因及其调控研究进展
Cbfα1基因编码一个成骨细胞特异性转录因子,调控成骨细胞发育、分化和骨的形成.Cbfα1基因含9个外显子,但它的多个外显子存在选择性剪接,产生多样Cbfα1的异构体,具有不同的转录激活潜能.多条信号传导通路如Ras-MAPK、cAMP、Smads-DPC4通路等涉及到Cbfα1的活性或表达的调控.这些研究为药物调控成骨细胞分化和骨的形成及基因治疗骨质疏松症开拓新的思路.
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Sema4D介导的IRS-1信号通路在抑制成骨细胞分化中的作用机制研究
目的 通过siRNA干扰技术沉默轴突导向因子4D (Sema4D)基因,探讨Sema4D基因对成骨细胞分化的影响.方法 采用RT-PCR、细胞免疫荧光法和Western blot测定Sema4D基因表达情况,分析沉默效率;采用ALP染色、VonKossa染色及ALP活性观测成骨细胞分化.结果 siRNA干扰技术下调了Sema4D的表达,成功构建了Sema4D基因沉默体系;Sema4D siRNA中成骨细胞的分化明显增强,出现了一定程度的钙化.结论 沉默Sema4D基因与成骨细胞的分化有关.
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蒙古黄芪中的异黄酮类成分对成骨细胞增殖、分化的影响
目的 研究蒙古黄芪中的异黄酮类成分及其对成骨细胞增殖、分化的影响,为黄芪抗骨质疏松提供实验依据.方法 利用柱层析法结合现代光谱技术从蒙古黄芪获得单体化合物并进行结构鉴定,采用MTT法观察化合物对成骨细胞增殖的作用,通过测定碱性磷酸酶活性评价化合物对成骨细胞分化的影响.结果 从蒙古黄芪的95％乙醇提取物中获得4个异黄酮类化合物,分别鉴定为(1)芒柄花素,(2)毛蕊异黄酮,(3)芒柄花素-7-O-β-D-葡萄糖苷,(4)毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷,所有化合物均能够明显促进成骨细胞增殖及增强碱性磷酸酶活性.结论 从蒙古黄芪中分离得到的异黄酮类成分能够明显促进成骨细胞增殖、分化,为黄芪抗骨质疏松活性提供了依据.
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miRNA在骨重建中的作用
微小RNA(micro RNA,miRNA)是一类具有组织特异性或发育阶段特异性表达特征的非编码调控小RNA,近年来,miRNA与骨形成和代谢的关系已成为研究热点之一,许多研究发现miRNA在骨代谢中的调控作用巨大.部分miRNA能够调节骨重建过程中的血管生成以及成骨细胞、破骨细胞的分化,通过改变相关miRNA表达水平进而深入研究miRNA在骨重建中的调控作用,同时miRNA可作为早期检测骨代谢疾病的生物标志物.本文通过对已知的miRNA在骨重建中血管生成及成骨细胞、破骨细胞中生物学和骨病理学作用机制的总结,说明其在骨重建过程中的重要作用.基于miRNA在骨重建中的调控作用,并在骨代谢相关疾病的临床实践中开辟新的领域,进而对骨代谢疾病有治疗作用.
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NBD多肽促进成骨细胞分化的实验研究
[目的]探讨核因子κB必需分子(NF-κB essential modulator,NEMO)结合的小分子多肽(NEMO binding domain,NBD)通过阻断肿瘤坏死因子-α信号通路影响成骨细胞分化的作用及其分子机制.[方法]应用BMP -2体外诱导鼠肌源细胞C2C12向成骨细胞分化模型,外源添加TNF-α和/或BMP -2细胞因子培养,通过碱性磷酸酶(ALP)活性检测,瞬时转染和基因测定,研究NBD多肽对抗NF-κB活性和改善TNF-α抑制成骨细胞分化的过程.[结果]ALP染色显示NBD多肽能明显阻断TNF-α对C2C12向成骨细胞分化的抑制而促进其分化,荧光素酶活性测定显示TNF-α降低BMP -2活性从7.12倍到1.31倍,而NBD多肽使其恢复到6.7倍和mNBD肽恢复到1.4倍.[结论]TNF-α抑制成骨细胞分化的分子生物机制是通过激活NF-kB阻碍成骨细胞的分化.NBD多肽具有对抗NF-κB活性和改善TNF-α抑制成骨细胞分化过程的作用.
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成骨细胞分化与骨骼发育的转录因子Cbfα1/Runx2
成骨细胞是参与骨形成,骨骼生长和发育的一类重要细胞,它起源于多能间充质干细胞,是间充质干细胞在体内的各种调控因素的调节下发育而成.然而,间充质干细胞具有多向分化潜能,不同刺激条件下可向成骨细胞、破骨细胞、成脂肪细胞、成软骨细胞和成肌细胞分化.Cbfα1/Runx2是新发现的一类调控间充质干细胞向成骨方向分化的特异性转录因子[1、2],因此了解Cbfa1/Runx2调控间充质干细胞的作用机理,可以加深对骨骼发育分子机制的认识.本文就当前研究领域内Cbfα1/Runx2与骨骼发育关系的研究进展综述如下.
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淫羊藿苷通过激活Notch信号通路促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的实验研究
目的:观察淫羊藿苷骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)向成骨细胞分化过程中的促进作用及其对Notch信号通路的影响.方法:通过对BMSCs细胞进行体外分离培养,将细胞分为对照组与给药组,给药组加入0.1mg·L-1、0.2 mg·L-1、0.4 mg·L-1、1 mg· L-1、2 mg·L-1、4 mg·L-1、10 mg·L-1、20 mg·L-1淫羊藿苷分别培养3d、7d、10 d、14 d、21 d,测定细胞上清液中碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性,确定佳给药剂量.将细胞分为3组,对照组、骨分化诱导组、骨分化诱导+淫羊藿苷处理组(联合组),培育7～21 d后测定ALP阳性染色率,Western blot法检测不同处理后Notch信号通路中Norh1、CBF1、Jagged-1蛋白表达情况,RT-PCR法检测淫羊藿苷对Hes1、Runx2 mRNA的影响.结果:与对照组比较,0.1～1.0 mg·L-1淫羊藿苷处理后ALP活性升高较明显,7～14d内活性均逐渐升高,14 d时活性达到大值,其中0.4mg·L-1处理活性高.因此,选择淫羊藿苷佳处理质量浓度为0.4 mg·L-1.对照组、联合组在细胞培养7～14 d间,ALP活性逐渐升高,14～ 21 d活性逐渐下降,第21天ALP活性维持较低水平;诱导组在培养期间ALP活性持续维持较高水平.第7天、第14天,与对照组比较,诱导组、联合组ALP活性升高,且诱导组升高程度高于联合组,差异有统计学意义(P＜0.05).第21天,联合组ALP活性高于对照组、诱导组,差异有统计学意义(P＜0.05).诱导组、联合组ALP阳性染色率均高于对照组,且联合组高于诱导组,差异有统计学意义(P＜0.05).Western blot结果显示,与对照组比较,联合组、诱导组Noth1、CBF1、Jagged-1蛋白表达量均升高,联合组蛋白表达量明显高于诱导组.RT-PCR结果显示诱导组Hesl、Runx2 mRNA表达量均高于对照组,联合组Hesl、Runx2 mRNA表达量高于诱导组.结论:淫羊藿苷能够促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化,并通过上调Hesl、Runx2 mRNA表达以及增加Noth1、CBF1、Jagged-1蛋白表达来实现.
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成骨分化特异性转录因子Cbfa1
近年来随着Cbfa1基因的克隆及其功能的阐明,人们对成骨分化的分子机制有了初步了解.基因敲除、基因突变等方法证实Cbfa1作为成骨分化的特异性转录因子,对成骨细胞分化、骨的发育和形成具有关键作用.
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基于同位素标记相对和绝对定量技术核因子-KB必需分子结合的小分子多肽改善肿瘤坏死因子-α抑制成骨细胞分化的蛋白质组学研究
目的 应用同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)技术观察核因子-κB(NF-κB)必需分子结合的小分子多肽(NBD)干预肿瘤坏死因子-α(TNF-α)刺激下成骨细胞分化过程中蛋白质表达组的变化.方法 肌原C2C12细胞接种于骨形态发生蛋白-2(BMP-2)诱导分化体系中诱导作为分化细胞模型,实验分为3组:对照组(B组)即分化细胞模型未加其他刺激,实验组(BT组)即分化细胞模型添加TNF-α,干预组(BTP组)即分化细胞模型添加TNF-α及NBD多肽,共同孵育分化7d后提取蛋白,以iTRAQ试剂标记后进行质谱检测并以软件分析差异表达的蛋白质.结果 TNF-α明显抑制成骨细胞分化,而NBD多肽可部分改善TNF-α对成骨细胞分化的抑制.iTRAQ试剂标记的B组与B+T组细胞蛋白质表达谱分析筛选出明显差异表达蛋白质点为76个,表达上调的蛋白质点59个,下调的蛋白质点17个;BT组与BTP组细胞蛋白质表达谱分析筛选出明显差异表达蛋白质点为43个,表达上调的蛋白质点25个,下调的蛋白质点18个.其中3组间成骨细胞特异因子(Postn)、ATP酶钙离子运输因子(Atp2a3)、SR依赖蛋白CTD关联因子-1(Scafl)、肌动蛋白-F交联蛋白(Actn2)、ATP合成酶,氢离子转运,线粒体复合体-F1,Delta亚基(Atp5d)、延伸体乙酰转移酶复合体亚基-2(Elp2)、Atp5]、C1型尼曼-匹克疾病(Npc1)等8个蛋白表达出现动态变化,提示上述蛋白可能与炎症刺激成骨分化机制有关,NBD多肽之外尚有其他药物靶点干预炎症对成骨分化的抑制.结论 iTRAQ技术是研究细胞分子蛋白改变的有效的蛋白质组学方法.Postn、Atp2a3、Scaf1、Actn2、Atp5d、Elp2、Atp5l及Npc1可能作为炎症刺激成骨分化机制研究的候选靶标.
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重组瘦素基因构建及其对骨髓间充质干细胞增殖分化的影响
瘦素(Leptin)是由脂肪细胞分泌的一种内分泌激素,可以使骨髓间充质干细胞(BMSCs)向成骨细胞分化,我们构建了重组真核质粒pTracer-Leptin,并转染BMSCs,研究Leptin基因对BMSCs成骨活性的影响.
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持续牵张促进小鼠骨髓间充质干细胞成骨向分化机制的研究
目的:研究p38MAPK在持续性机械牵张力促进C57BL/6J小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化过程中的作用机制.方法:C57BL/6J小鼠BMSCs被随机分为对照组和牵张力阻断组.牵张力阻断组预先用p38MAPK特异性阻断剂SB203580处理1h,后用Flexercell加力仪加载0.5Hz,0.8％的牵张力.对照组不做特殊处理.分别对两组细胞施加0、30 min和60 min的牵张力.采用Western blot检测P-p38MAPK蛋白的表达情况,Real time-PCR检测成骨基因ALP、COL I、OCN mRNA的表达变化.结果:C57BL/6J小鼠BMSCs传代后细胞生长状态稳定,呈梭形,具有多向分化潜能.Real time-PCR结果显示对照组BMSCs中ALP、COL I、OCN mRNA表达在不同时间点(30 min与0 min,60 min与30 min)间差异均有统计学意义(P＜0.05);对照组ALP、COLI、OCN的表达量均明显高于同一时间点(30 min和60 min)牵张力阻断组(P＜0.05).Western blot结果显示,对照组内BMSCs中P-p38MAPK的蛋白水平在不同时间点间(30 min与0 min,60 min与30 min)差异均有统计学意义(P＜0.05);对照组P-p38MAPK蛋白的表达量均明显高于同一时间点(30 min和60 min)牵张力阻断组(P＜0.05).结论:所采用的0.5 Hz,0.8％的机械牵张力在持续牵张力下可通过p38MAPK通路促进小鼠BMSCs向成骨细胞分化.
关键词： 持续牵张力 骨髓间充质干细胞 成骨细胞分化 p38MAPK信号通路 -
重组人骨形态发生蛋白-9对人牙周膜成纤维细胞成骨分化的影响
目的:研究重组人骨形态发生蛋白-9(recombinant human bone morphogenetic protein-9,rhBMP-9)对体外人牙周膜成纤维细胞成骨细胞分化的影响.方法:体外培养人牙周膜成纤维细胞,成骨分化培养基(osteo-genic differentiation medium,ODM)诱导成骨分化,加入不同浓度rhBMP-9或p38和胞外信号调节激酶1/2(ex-tracellular signalregulated kinase1/2,ERK1/2)抑制剂SB203580和U0126处理.采用LabAssayTM碱性磷酸酶(al-kaline phosphatase,ALP)检测试剂盒检测ALP活性.提取总RNA,实时荧光定量聚合酶链反应(Real time fluo-rescence quantitative PCR,qPCR)检测RUNT相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2,RUNX2)、分化抑制因子1(inhibitor of differentiation factor 1,ID1)、骨唾液酸蛋白(bone sialoprotein,BSP)和骨桥蛋白(osteopon-tin,OPN)表达情况.结果:rhBMP-9可以显著增加人牙周膜成纤维细胞ALP活性,且呈浓度和时间依赖性.成骨分化相关转录因子RUNX2和ID1以及晚期成骨标志物BSP和OPN的表达在rhBMP-9的刺激下也显著升高.与rhBMP-9单独刺激组比较,加入SB203580和U0126共刺激后可完全抑制rhBMP-9促人牙周膜成纤维细胞成骨分化的作用.结论:rhBMP-9能够显著诱导人牙周膜成纤维细胞向成骨细胞样细胞分化,且其可能机制为调节p38和ERK1/2通路.
关键词： 重组人骨形态发生蛋白-9 成纤维细胞 成骨细胞分化 胞外信号调节激酶 1/2 -
异槲皮苷对成骨细胞分化及HDAC1和Runx2表达的影响
目的:探讨异槲皮苷对成骨细胞分化及对HDAC1和Runx2表达情况的影响.方法:不同浓度梯度异槲皮苷(1×10-8,1×10-7,1×10-6,1×10-5 mol/L)连续处理MC3T3-E1细胞系,在作用第3天,借助qRT-PCR技术对MC3T3-E1细胞系中Ⅰ型胶原蛋白(type 1 collagen,Col 1)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)及骨桥蛋白(osteopontin,OPN)的表达进行检测,并对骨细胞分化关键酶ALP的活性和骨钙的形成进行检测,以评估成骨细胞的分化程度.通过qRT-PCR技术检测MC3T3-E1细胞中HDAC1及Runx2的表达水平.结果:异槲皮苷能促进成骨细胞MC3T3-E1中Col 1,ALP及OPN的上调表达,且差异具有统计学意义(P＜0.05),并且呈现出一定的剂量效应.异槲皮苷诱导时,成骨细胞分化过程中ALP活性显著增强,骨钙形成明显增加.在1×10-6mol/L异槲皮苷作用下,成骨细胞系中HDAC1 mRNA和蛋白水平均显著下调(P＜0.05),而Runx2 mRNA和蛋白水平均明显上调(P＜0.05).结论:异槲皮苷可能通过下调HDAC1表达、促进Runx2表达,有效地促进成骨细胞分化,为异槲皮苷应用于治疗骨质损伤类疾病提供新的依据.
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糖皮质激素受体β对糖皮质激素受体α功能的影响及其意义
目的:通过研究糖皮质激素受体β对糖皮质激素受体α功能的影响,探讨糖皮质激素受体β可能存在的生物学意义.方法:(1)用瞬时转染技术将GRβ和报告基因cat共转染HOS-8603细胞,激素处理后,研究GRβ对糖皮质激素诱导GRα外源性靶基因cat表达的影响;(2)GRβ真核表达载体的构建及GRβ在HOS-8603细胞中的稳定过度表达;(3)用定量RT-PCR和Western印迹法检测糖皮质激素对HOS-8603细胞p21表达的诱导及GRβ的稳定表达对GRα内源性靶基因p21表达的影响;(4)用MPT法检测GRβ的稳定过度表达对糖皮质激素抑制HOS-8603细胞增殖作用的影响;(5)GRβ对糖皮质激素诱导HOS-8603细胞AKP(成骨细胞分化标志酶)活性的影响.结果:(1)GRβ抑制GRα外源性靶基因cat的表达,且具有剂量依赖性特点;(2)GRβ抑制GRα内源性靶基因p21的表达;(3)GRβ的稳定过度表达降低糖皮质激素抑制HOS-8603细胞增殖的作用;(4)GRβ的稳定过度表达抑制糖皮质激素对HOS-8603细胞AKP活性的诱导.结论:糖皮质激素受体β对糖皮质激素受体α的功能有抑制作用,糖皮质激素受体β可能是糖皮质激素受体α的内源性抑制因子.
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Notch信号可调节人脐带间充质干细胞CD105表达、成骨分化和免疫活性
间充质干细胞（ MSCs）是一种具有多向分化特性的多能干细胞，有一整套相对特异的膜表面标志物，且具备独特免疫调节功能。 IDO1，一种色氨酸分解酶，是介导MSCs免疫调节功能的关键分子。为探讨MSCs关键特性的调节作用涉及Notch信号及其它潜在信号通路，Na等使用γ-分泌酶抑制剂I（ GSI-I；不仅能够抑制Notch信号，同时可降低泛素蛋白酶的活性）对人脐带间充质干细胞（ hUC-MSCs）进行处理，结果表明，GSI-I可引起细胞凋亡，减少膜表面标志物CD73、CD90和CD105的表达，抑制成骨细胞分化，减弱人脐带间充质干细胞对Th1淋巴细胞增殖的抑制作用和IFN-γ对IDO1表达的抑制作用。通过对GSI-I在Notch信号及蛋白酶体的抑制作用所致结果进行辨识，可以进一步观察到CD105表达下降及成骨细胞分化抑制导致Notch信号及蛋白酶体受到抑制，却不会因此诱发细胞凋亡。然而，Notch信号的抑制（而不是蛋白酶体的抑制）使得GSI-I在Th1淋巴细胞增殖中发挥重要作用，这可能是通过降低IDO1启动子活性来实现的。综上所述，Notch信号可以代表一种十分重要的细胞信号，它能够对MSCs的多项关键特性，尤其是免疫调节活性进行调节。
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骨形态发生蛋白缓释载体的研究进展
骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)是研究较早的骨生长因子,其诱导成骨的作用已被多次实验所证实.它能诱导未分化的间充质细胞分化,表达骨与软骨细胞表型,还能刺激软骨细胞和成骨细胞分化,并提高细胞ALP的活性[1].但是BMP在骨内的含量极微,约1mg/kg湿骨,而外源性BMP来源有限、成本较高,且在体内迅速降解或随体液扩散[2],不能均匀持久地分布在大的骨缺损部位,难以发挥出成骨效应.在以往实验中单纯应用BMP治疗骨缺损的效果并不理想,必须有合适的载体材料与其复合,起到令BMP缓释及提供骨细胞生长支架的作用.
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慢性肾脏病高磷血症所致并发症的机制及防治进展
以往认为,慢性肾脏病(CKD)患者血管钙化是由于体内钙磷代谢失衡、钙磷过饱和所致的钙盐被动沉积于细胞和细胞外基质的一个非细胞介导的过程.近年来,血管钙化的分子机制研究结果表明,细胞介导的主动调节过程在血管钙化的发生过程中占重要地位,其形成过程与骨骼的矿化相似,是一个受多因素调控的、与骨发生类似的主动的可调节过程,其中心环节是血管平滑肌向成骨细胞分化,分泌成骨细胞样基质,终形成钙化.
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关于PLAP-1在牙周组织中的表达以及对成骨细胞分化的影响研究
目的 研究PLAP-1在牙周组织中的表达以及对成骨细胞分化的影响.方法 取口腔科于2014月3月1日～2017年3月1日收治的62例需拔出健康前磨牙的患者为研究对象.62例患者共拔除70颗前磨牙.制备牙周组织标本,并进行培养.采用免疫组化ABC、DAB显色法对第三代细胞行波形丝蛋白抗体染色、PLAP-1染色.以Trizol法提取RNA,并进行逆转录、矿化结节形成实验.观察牙周组织中PLAP-1的表达及对成骨细胞分化的影响.结果 62例患者标本的免疫细胞化学染色结果显示,所有人牙周膜细胞(PDLC)中均表达PLAP-1.PLAP-1染色呈棕黄色颗粒状,沿细胞核周围分布.患者细胞膜、细胞核未见PLAP-1表达.标本350bp处出现一条目的条带.结论 人牙周组织中PLAP-1特异性表达,PLAP-1超表达可对成骨细胞分化产生较强的抑制作用.
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诱导成骨分化过程中BMP与WNT信号通路串话机制
目的 探究小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化过程中,BMP-2/Smad信号通路与Wnt/β-catenin通路的串话机制.方法 将预先准备好的重组人骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2)质粒转染至C3H10T1/2细胞,利用G418抗药性筛查转染成功的细胞.将实验细胞分为转染组、空白组.通过ELISA检测各组细胞上清液中的BMP-2含量,采用Western blot和RT-PCR方法检测两组中Smad泛素化调节因子2(Smurf2)、β-链蛋白(β-catenin)、磷酸化β-链蛋白(pβ-catenin)、转录因子RUNX2、淋巴增强因子1(LEF1)、Axin2、糖原合成激酶-3β(GSK-3β)等关键细胞因子的表达水平.结果 与空白组比较,转染组BMP-2浓度升高并维持在较高水平(P<0.05),β-catenin mRNA的表达上调(P<0.05)和磷酸化水平增加(P<0.01),LEF1蛋白合成上调(P<0.05),Smurf2蛋白表达减少(P<0.05),RUNX2的mRMA表达上调(P<0.01).结论 在成骨细胞分化过程中,BMP-2/Smad信号通路与Wnt/β-catenin通路存在串话机制,增加β-catenin的表达水平,促进β-catenin的磷酸化.
关键词： BMP-2 Wnt/β-catenin 成骨细胞分化 串话机制 -
小鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化过程中α－玉米赤霉醇对 PⅠNP 和 BMP －2表达的影响
目的：探讨小鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化过程中α－玉米赤霉醇（α－ZAL ）对Ⅰ型前胶原 N 端前肽（PⅠNP）和骨形态发生蛋白－2（BMP －2）表达的影响。方法采用全骨髓培养差速贴壁法体外分离培养小鼠骨髓间充质干细胞，取第3代细胞分为空白诱导组、阳性诱导组及高、中、低浓度α－ZAL 诱导组。空白诱导组仅加入成骨条件培养基，阳性诱导组加入等量成骨条件培养基及雌二醇，高、中、低浓度α－ZAL 诱导组分别加入成骨条件培养基及梯度浓度（10－5、10－6、10－7 mol ／L）的α－ZAL。采用 ELISΑ法测定 PⅠNP 和 BMP －2的表达量。结果小鼠骨髓间充质干细胞原代培养呈长梭形，有接触抑制现象，诱导后细胞呈三角形、多角形、不规则形状，细胞生长密集时可重叠生长。与空白诱导组比较，各组 PⅠNP 表达量均明显升高（P ＜0．01），阳性诱导组及低、中浓度α－ZAL 诱导组 BMP －2表达量均明显升高（P ＜0．01），高浓度α－ZAL 诱导组 BMP －2表达量明显下降（P ＜0．01）。与阳性诱导组比较，低浓度α－ZAL 诱导组 PⅠNP 表达量明显升高（P ＜0．01），而中、高浓度α－ZAL诱导组 PⅠNP 表达量明显下降（P ＜0．01），低、中浓度α－ZAL 诱导组 BMP －2表达量均明显升高（P ＜0．01），高浓度α－ZAL 诱导组 BMP －2表达量明显下降（P ＜0．01）。结论α－ZAL 呈剂量相关性促进体外培养的小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化，低浓度（10－7 mol ／L）α－ZAL 可显著促进骨髓间充质干细胞骨向分化过程中 PⅠNP 和BMP －2的表达，随着剂量的升高，促进作用下降。
