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维甲酸Ro 40-8757对人大肠癌细胞系CCL-187增生和侵袭的抑制作用
目的:维甲酸类化合物对多种恶性肿瘤具有诱导分化、抑制增生、诱导凋亡等作用.本文旨在研究一种新合成的维甲酸Ro 40-8757对体外培养的人大肠癌细胞系CCL-187的生长增生、侵袭、形态结构及细胞周期的影响,并探讨其可能机制.方法:MTT法测定Ro 40-8757对人大肠癌细胞系CCL-187的增生抑制作用;用流式细胞术研究其对CCL-187细胞周期的影响;侵袭试验观察侵袭抑制作用;半定量RT-PCR测定MMP-2表达变化;电镜观察其对CCL-187细胞形态的影响.结果:Ro 40-8757作用后CCL-187出现显著的生长抑制作用,并具有时间、浓度依赖性;经1×10-6mol/L Ro 40-8757处理3,6,9,12 d后的CCL-187 G1期细胞数分数比例增加,S+G2/M期细胞数分数比例减少,出现G0/G1期细胞周期阻滞作用;Ro 40-8757能够抑制CCL-187细胞的侵袭,1×10-6 mol/L药物作用后穿过滤膜的细胞数随时间逐渐减少(处理0 d的CCL-187穿过滤膜的细胞数为24.2±3.0;女理3d为16.0±2.1;处理6d为15.1±1.2;处理9d为9.6±2.5;女理12d为5.4±1.2,P＜0.05).侵袭能力下降的同时,MMP-2表达下降(0 d光密度值和β-actin的比值为1.19±0.26;3 d为0.94±0.79;6 d为0.71±0.06;9 d为0.37±0.80;12 d为0.32±0.90);扫描和透射电镜观察均未见细胞有明显的细胞毒性、凋亡和分化特征性改变.结论:Ro 40-8757对人结肠细胞系CCL-187有明显的增生抑制作用,并呈时间、剂量依赖性,这种抑制作用是通过细胞周期阻滞于G0/G1期发挥作用的;Ro 40-8757对CCL-187有侵袭抑制作用,MMP-2的表达下降在其中参与发挥作用.
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维生素C明显提高小鼠诱导多能干细胞分化为心肌细胞的诱导效率
目的:将维生素C作为诱导剂,观察其对小鼠诱导多能干细胞(miPSC)分化为心肌细胞效率的影响,寻找一种更安全、更高效的诱导方法.方法:复苏miPSC,传代培养后,利用悬滴培养法使miPSC形成拟胚体(EBs),用含维生素C的分化培养基对其进行诱导分化,对照组不添加诱导剂,记录两组拟胚体出现搏动的时间、数量,计算分化率,观察维生素C作为诱导剂,对miPSC分化为心肌细胞效率的影响.结果:在用含10-4mmol/mL维生素C的分化培养基时,大概有62.5％的拟胚体出现搏动,而不加任何诱导剂组约有8.3％的拟胚体出现搏动.各组搏动拟胚体cTnT,a-actinin免疫染色阳性.结论:维生素C作为一种诱导剂,能显著提高miPSC分化为心肌细胞的效率,并且心肌特异性蛋白cTnT,a-actinin染色阳性,应用维生素C作为诱导剂,诱导miPSC向心肌细胞分化是一种非常理想的诱导方法.
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人胚胎干细胞H9诱导分化收缩型平滑肌细胞的方法研究
目的 改进人胚胎干细胞H9向收缩型平滑肌分化方法的研究.方法 从形态和细胞免疫荧光、碱性磷酸酶(ALP)鉴定人胚胎干细胞(human embryonic stem cell,hESC)的全能性.采用单层培养H9诱导分化为中胚层(mesoderm,MES),进而改进诱导方法分化为收缩型平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC).采用real-time PCR、western blotting、细胞免疫荧光化学技术以及流式细胞术鉴定诱导分化方法的合理性以及效率.结果 hESC表面标志物蛋白分子OCT-4在细胞核内表达呈阳性(绿色),ALP显示呈黑紫色.Real-time PCR结果显示,随着时间的推移,VSMC标志基因a-SMC、SM22a、CALPONIN在一定的时间节点后呈爆发式上升;western blotting显示第6天后开始递增表达;细胞免疫荧光显示,分化18天的细胞a-SMC阳性表达(绿色);流式细胞术结果表明,分化第15天时,a-SMC阳性细胞达90％以上.结论 改进后的诱导体系更适合H9向收缩型VSMC分化.
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2型糖尿病外周血内皮祖细胞的诱导分化及影响因素的研究
目的观察2型糖尿病(T2DM)外周血内皮祖细胞(endothelial progenitor cell,EPC)在体外的分化增殖能力及影响因素.方法取20例T2DM无并发症患者、19例T2DM合并血管并发症患者和21例对照人群外周血EPC培养,观察细胞形态学变化并计数,用流式细胞仪检测贴壁细胞的特异性标志.结果糖尿病血管并发症组培养获得的EPC和EPC集落低于糖尿病无并发症组(P＜0.05)和对照组(P＜0.01).EPC数量与SBP及FPG呈负相关(R=-0.266,P＜0.05;R=-0.619,P＜0.01),糖尿病人EPC集落生成数量与HbA1c水平呈负相关(R=-0.749,P＜0.05),与糖尿病病程年呈负相关(R=-0.406,P＜0.01). 结论FPG和SBP与EPC的增殖分化有关,T2DM外周血EPC数目减少,与HbA1c、SBP及病程相关.
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人胚胎胰腺组织干细胞的分离鉴定和纯化
分离人胚胎胰腺组织中的胰岛细胞于体外培养,应用免疫细胞化学及RT-PCR的方法对其中的胰腺干细胞进行鉴定,并应用免疫磁珠的方法纯化其中的干细胞.结论是人胚胎胰腺组织中存在一定比例的干细胞,可以作为体外向胰岛素分泌细胞诱导分化的细胞来源.
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抵抗素在3T3-L1前脂细胞分化前后表达量的变化
目的 检测3T3-L1前脂细胞诱导分化为脂肪细胞前后抵抗素基因表达量的变化情况,为阐明抵抗素在细胞分化过程中所起作用并为研究其与胰岛素抵抗(IR)及2型糖尿病的相关性奠定基础.方法 用地塞米松、甲基异丁基黄嘌呤与胰岛素联合诱导法抽提诱导分化前后细胞总RNA,半定量RT-PCR检测抵抗素基因表达量.结果 抵抗素在3T3-L1细胞诱导前后表达量明显上升.结论 抵抗素在3T3-L1细胞分化过程中表达量的提高,提示其很有可能在鼠脂肪细胞产生IR的过程中发挥积极作用.
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犬骨髓间叶干细胞体外定向诱导分化心肌细胞的实验研究
目的:旨在建立骨髓间叶干细胞(MSCs)体外定向诱导分化心肌细胞的方法,为心肌疾患的移值修复治疗提供成体干细胞来源.方法:利用Percoll密度梯度法及MSCs黏附贴壁生长特性进行分离培养与扩增骨髓MSCs,并予以鉴定证实.应用5-氮胞苷对培养早期的骨髓MSCs进行定向诱导分化心肌细胞.通过细胞形态学、细胞免疫组化、透射电镜等技术观察分化细胞的肌管,心肌细胞特异性蛋白与细胞特异性超微结构以鉴定诱导分化的效果.结果:利用Percoll密度梯度法与细胞黏附贴壁生长特性,可分离培养与扩增足量骨髓MSCs.应用化学诱导剂5-氮胞苷10～20 μmol/L孵育早期培养的骨髓MSCs4～5周,可见细胞形成肌管;肌细胞特异性蛋白α-肌动蛋白,肌球蛋白以及心肌细胞特异性分子标志肌钙蛋白I免疫组化染色阳性;透射电镜可见肌丝与房性颗粒.结论:骨髓MSCs可在体外5-氮胞苷的诱导下定向转化为具有典型结构的心肌细胞.
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骨髓间充质干细胞体外诱导分化为心肌细胞
目的:观察5-氮杂胞苷(5-aza)体外诱导分化骨髓间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)成为心肌细胞的作用,并为进一步体内研究而进行细胞标记.方法:提取小型猪骨髓20ml,体外分离培养骨髓间充质干细胞,分为对照组和诱导组,其中诱导组在培养第3天加入5-aza(10 μmol/L),分别在培养2周和4周时观察两组细胞光镜、电镜下形态,4周时进行磷钨酸-苏木素染色(PTAH)和肌动蛋白(actin)免疫组化染色.诱导组MSCs加入5-溴脱氧尿嘧啶(BrdU,5μg/ml),分别在作用后第2周和第4周,利用BrdU单克隆抗体免疫组化检测BrdU标记方法.此外,用含有LacZ基因的复制缺陷腺病毒转染诱导组MSCs,利用X-gal染色检测LacZ基因表达的半乳糖苷酶,观察诱导分化后MSCs的体外标记情况.结果:体外能够成功地分离骨髓MSCs,5-aza诱导分化2周和4周后的MSCs在光镜下明显成为梭形,形态类似肌细胞.电镜下诱导分化后的MSCs在2周时出现肌丝结构,4周时肌丝明显增多.PTAH染色显示超过70%的细胞具有横纹肌的染色性质,actin免疫组化染色显示:超过80%的诱导后MSCs肌动蛋白呈阳性表达.体外BrdU单克隆抗体检测BrdU掺入到MSCs细胞核中,X-gal染色证明LacZ基因能够进入MSCs并表达,两种体外标记方法在标记2周和4周时都为阳性.结论:5-aza能够诱导骨髓MSCs成为心肌细胞,BrdU掺入和含有LacZ基因的复制缺陷腺病毒转染能够成功对诱导分化后MSCs进行标记,并且标记持续至少4周.
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肺树突状细胞成熟分子的表达与慢性阻塞性肺疾病急性加重相关
背景和目的:树突状细胞(DCs)在初始T细胞和效应T细胞接触抗原后的活化和诱导分化方面发挥着重要作用.然而DCs在COPD中的作用尚不清楚,为数不多的研究所得结论不同,且未涉及DCs的成熟状态与COPD严重程度之间的关系.本研究旨在明确DCs成熟分子的表达与COPD分期,以及与肺CD4+T细胞急性活化标记CD69表达之间的关系.
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犬骨髓成年多能祖细胞诱导分化血管内皮细胞的实验研究
目的内皮细胞移植对损伤组织的修复治疗至关重要,本研究旨在探讨骨髓成年多能干细胞(MAPCs)体内外诱导分化血管内皮细胞的可行性.方法采用Percoll密度梯度法分离培养MAPCs.应用10 ng/ml血管内皮细胞生长因子(VEGF)对骨髓MAPCs进行体外诱导分化2～3周,使其定向分化成为血管内皮细胞.采用细胞形态学、细胞免疫组化以确定诱导分化的效果.将标记BrdU的MAPCs自体移植于犬心肌内,观察局部微环境对于骨髓MAPCs的分化能力.结果应用10 ng/ml VEGF孵育骨髓MAPCs 2～3周,可见MAPCs分化为血管内皮细胞:细胞形态呈鹅卵石样;形成血管样结构;细胞vWF免疫染色阳性.移植于心肌内的MAPCs在体内形成新生血管,血管内皮BrdU染色与vWF染色均阳性.结论骨髓MAPCs可在体外VEGF诱导下或在体内微环境作用下分化为成熟血管内皮细胞.骨髓MAPCs可为损伤组织的移植修复治疗提供内皮细胞资源.
关键词： 骨髓成年多能干细胞 犬 内皮细胞 诱导分化 血管内皮细胞生长因子 -
CAG预激方案治疗中高危骨髓增生异常综合征疗效观察
骨髓增生异常综合征(MDS)是一种起源于造血干细胞的克隆性疾病,极易转变为急性髓系白血病(AML).对于中高危MDS患者常规诱导分化治疗效果差,且发病年龄偏大,难以耐受大剂量化疗方案.我们曾报道小剂量阿克拉霉素(ACR)和阿糖胞苷(Ara-C)联合粒细胞集落刺激因子(G-CSF)的预激方案(CAG方案)治疗老年AML患者,并达到较好的临床疗效[1].本研究采用CAG方案治疗27例中高危难治性贫血伴原始细胞增多型MDS(MDS-RAEB)患者,探讨其临床治疗价值.
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慢性髓系白血病树突状细胞免疫功能的研究
树突状细胞(DC)是目前已知的功能强的抗原提呈细胞.近年来研究发现,慢性髓系白血病(CML)细胞可诱导分化为DC,为探讨这种DC的免疫功能,本研究将CML来源DC与正常DC进行了比较,报告如下.
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利拉鲁肽诱导骨髓间充质干细胞定向分化及移植治疗1型糖尿病大鼠的研究
目的 体外研究利拉鲁肽诱导骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)分化为胰岛素分泌细胞(IPCs),并在体内进一步观察IPCs移植对1型糖尿病(T1DM)大鼠的治疗作用.方法 (1)体外采用密度梯度离心联合差壁培养法分离、纯化大鼠BM-MSCs,进一步分为未诱导组、高糖+尼克酰胺诱导组、胰高血糖素样肽1(GLP-1)诱导组和利拉鲁肽诱导组；(2)倒置显微镜下观察各组细胞形态变化,双硫腙染色鉴定诱导后细胞,荧光定量PCR检测巢蛋白(Nestin)、胰十二指肠同源盒1(PDX-1)、葡萄糖转运蛋白2(Glut-2)、葡萄糖激酶(GK)、胰岛素和胰高血糖素等基因,细胞免疫荧光检测胰岛素和胰高血糖素等蛋白；(3)将180 ～ 220 g的30只雄性SD大鼠以60 mg/kg剂量腹腔注射链脲佐菌素制备T1DM模型,造模成功后按随机数字表法分为对照组(T1DM组,n=8)、未诱导的BM-MSCs移植组(BM-MSCs组,n=9)和经利拉鲁肽诱导的BM-MSCs移植组(LIRA+ BM-MSCs组,n=9),给予相应干预8周,待血糖基本稳定后,选取4只正常、同龄、雄性SD大鼠作为对照,行腹腔注射的葡萄糖耐量试验(IPGTT)进一步观察移植后细胞对高糖刺激的反应性.结果 (1)利拉鲁肽诱导后BM-MSCs形态逐渐变圆,呈明显的聚集性生长状态,双硫腙染色为阳性；与高糖+尼克酰胺诱导组比较,利拉鲁肽诱导组细胞Nestin mRNA表达下调(0.003 8±0.000 4比0.007 5±0.003 0,P＜0.05),胰岛素(0.000 20±0.000 03比0.000 08±0.000 02)和胰高血糖素(0.001 1±0.0004比0.000 7±0.000 1)等mRNA表达上调(F=7.26、10.06、4.92,均P＜0.05),PDX-1、Glut-2、GK mRNA表达亦上调；利拉鲁肽诱导组和GLP-1诱导组细胞胰岛素或胰高血糖素蛋白表达均呈阳性.(2)体内实验示,与T1DM组比较,LIRA+ BM-MSCs组和BM-MSCs组大鼠8周末血糖均明显降低[分别为(28.0±1.2)、(8.9±1.1)、(14.5±0.9)mmol/L,F=719.61,均P＜0.05]；IPGTT提示移植IPCs后的大鼠血糖在30 min时升至峰值,150 min时降至空腹水平,血糖变化曲线与正常组类似.结论 体外利拉鲁肽可以在一定程度上促进BM-MSCs分化成为IPCs,且移植后的IPCs能够在体内进一步发挥降糖作用.
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血管紧张素Ⅱ诱导成人脂肪间充质干细胞向心肌分化的实验研究
目的：观察血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）对成人脂肪间充质干细胞（ADMSCs）向心肌分化的诱导作用。方法将自成人脂肪组织中分离培养的ADMSCs分为对照组和观察组，分别给予5－氮杂胞苷（5－aza）和AngⅡ进行诱导分化为心肌细胞。用免疫细胞化学方法检测心肌特异性肌钙蛋白－I（cTn－I），用MTT法检测细胞活性，流式细胞仪分析细胞凋亡情况。结果观察组A值和凋亡细胞含量均明显小于对照组，差异均有统计学意义（均P＜0．05）；两组间心肌细胞转化率差异无统计学意义（P＞0．05）。结论血管紧张素Ⅱ可以有效诱导成人脂肪间充质干细胞向心肌细胞分化，同时还可以促进成人脂肪间充质干细胞的增殖，效果优于5－氮杂胞苷。
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体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经干细胞分化的研究进展
骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)是一类多潜能细胞,在适当的条件下,能够通过诱导分化成为神经干细胞,在治疗神经系统方面的疾病具有良好的临床应用前景.本文对BMSCs体外分离培养方法、诱导方法及治疗神经系统疾病的临床应用进行了综述.
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人造血干/祖细胞体外诱导分化为T淋巴细胞的研究进展
本文介绍人造血干/祖细胞在体外微环境中产生并分化发育为成熟T淋巴细胞的相关环节和影响因素,涉及到人体外微环境的建立,包括模仿胸腺微环境的培养体系、无胸腺组织的培养体系;与T细胞分化有关的细胞因子的研究;T细胞在体外的分化过程;T细胞分化研究的应用与展望.
关键词： 造血干/祖细胞T淋巴细胞 微环境 诱导分化 -
人脐血间充质干细胞的分离培养及其多向分化潜能的实验研究
目的 研究人脐血间充质干细胞(MSCs)分离培养的生物学特性及其向成骨、成脂诱导分化的能力.方法 从人脐血中分离扩增MSCs,显微镜下观察其形态及生长情况,绘制生长曲线,电镜下观察超微结构,流式细胞仪检测细胞表面标志物;成骨、成脂诱导后以碱性磷酸酶(ALP)染色、茜素红染色鉴定MSCs成骨分化潜能,油红O染色鉴定成脂分化潜能.结果 人脐血MSCs为成纤维细胞样,漩涡状贴壁生长排列,传至第110代细胞形态无明显变化;电镜下显示为低分化细胞;细胞表面不表达CD34和CD45,强表达CD29、CD44和CD90;成骨诱导后可检测到ALP表达及钙化结节形成;成脂诱导后可检测到脂滴形成.结论 人脐血中可分离出MSCs,与其他来源的MSCs具有类似的生物学特性及多向分化潜能,脐血有可能成为骨组织工程种子细胞的来源.
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BMP-12诱导下对骨髓基质干细胞分化潜能及生物学行为影响的实验研究
目的:探讨(MSCs)在BMP-12诱导下向肌腱细胞分化潜能及其生物学行为.方法:将MSCs 在含BMP-12的F12培养液中诱导分化后传代培养并与肌腱细胞对比,进行形态学观察、细胞增殖、细胞周期、细胞DNA指数及细胞凋亡检测.通过3H-Proline掺入实验了解对MSCs细胞胶原合成的影响.结果:MSCs细胞呈梭形生长,第2天进入对数增长期,倍增时间为3.2天,而单纯肌腱培养对照组倍增时间3.75天(P>0.05).MSCs与单纯培养对照组比较3H-Proline掺入值无显著性差异(P>0.05),说明MSCs细胞分泌可分泌胶原.细胞功能向肌腱细胞方向转化.MSCs细胞DNA指数为0.96,增殖指数比对照组高11%,提示MSCs细胞生长速度快,增殖能力强.结论:MSCs在BMP-12诱导下具有向肌腱细胞分化潜能,可作为肌腱组织工程的有效种子细胞应用于组织工程化肌腱的构建.
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软骨祖细胞的研究进展
随着老年人口的增加,以关节软骨退变为主要特点的骨关节疾病日益引起社会的关注,尤以骨关节炎( osteoarthritis,OA)表现突出.其病理表现为疾病组织内细胞功能活性降低、组织内促合成(anabolic)细胞因子的功能活性低于促分解(catabolic)细胞因子以及炎性因子和基质金属蛋白酶(MMP)活性增加等[1,2],引起细胞外基质的合成-降解平衡失调,导致其生物力学功能减低.研究表明发生退行性改变的OA关节软骨中软骨祖细胞(CPCs)的数量及功能活性均发生了改变,主要表现为数量增加而成软骨分化能力下降[3].OA病理微环境引起CPCs功能活性降低,后者反作用促发OA的进展,两者相互作用的具体机制可能涉及基因水平及细胞炎症因子等蛋白水平的改变[4].目前,经分离培养及诱导分化,在骨髓、脂肪、软骨及滑膜滑液中均发现CPCs的存在,但是由于组织微环境的影响,不同来源的CPCs在增殖分化能力及形态表型方面存在着很大的差异,其中软骨来源的组织特异性CPCs分化形成的软骨组织与原组织具有为相似的功能活性[5].CPCs在OA进展中受微环境的影响,是各种致病因素的靶细胞,也是致病机制的参与者,探究其在生理条件下及疾病环境中功能活性的表现及改变具有重要的临床意义.
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新方案诱导大鼠骨髓间充质干细胞诱导分化为神经元样细胞
目的 探索体外诱导间充质干细胞分化为神经元样细胞后长期培养的可能性.方法自成年Wistar大鼠红骨髓分离培养骨髓间充质干细胞,通过克隆培养、成骨分化、成脂肪分化鉴定其特性,取第3代细胞重新接种,经b-FGF预诱导及β-巯基乙醇诱导后,换维持培养液维持培养.结果 本实验分离培养的细胞克隆形成率64±1.4%,具有成骨及成脂肪分化能力.成神经元诱导分化0.5h后,多数细胞即开始呈现出神经元样外观,5h后绝大多数细胞表现出典型的神经元样外观,维持培养1周后,大多数细胞继续维持神经元样外观,72±3.6 %的细胞MAP-2免疫细胞化学染色阳性.结论 本实验中分离培养的细胞表现出间充质干细胞的特性,经诱导后,超过半数的细胞分化为神经元样细胞,在我们优化的培养体系中,分化的神经元样细胞可存活1周以上.
