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NHE1基因调控细胞内酸碱平衡对胃癌细胞生物学行为的影响
目的:通过基因转染技术,研究NHE1反义基因对SGC-7901胃癌细胞生物学行为的影响,探讨通过酸化细胞内环境诱导肿瘤细胞凋亡从而治疗胃癌的新方法.方法:利用亚克隆技术构建人NHE1反义结构基因哺乳动物真核表达质粒,通过DOTAP脂质体介导的转染技术将反义真核表达质粒和空载体分别转入SGC-7901胃癌细胞中,经聚合酶链反应(PCR)对转染基因的整合鉴定后,观察基因转染对细胞形态学、细胞内pH值、体外生长状况、细胞周期以及双层软琼脂克隆形成能力和裸鼠成瘤力的影响.结果:光镜及透射电镜下细胞形态恶性程度降低.Anti-7901细胞胞内pH值显著低于Zeo-7901细胞和空白对照组SGC-7901细胞内pH值(6.77±0.05 vs 7.24±0.03,7.26±0.03,P<0.01).Anti-7901细胞生长速度明显减慢,出现接触抑制,呈单层生长,细胞凋亡率显著高于Zeo-7901细胞和空白对照组SGC-7901凋亡率(26.1% vs 5.12%,4.48%,P<0.01).Anti-7901细胞在双层软琼脂中集落形成率显著低于Zeo-7901和空白对照组SGC-7901细胞(9±3.54‰ vs 40±4.53‰,38.6±4.63‰,P<0.01).接种Zeo-7901细胞和空白对照组SGC-7901细胞裸鼠皮下长出肿瘤,成瘤率为100%,而接种Anti-7901细胞裸鼠皮下未长出肿瘤,成瘤率为0%.结论:反义技术干预可使NHE1基因表达下调,导致细胞内酸化,诱导细胞凋亡,达到了有效治疗胃癌的目的,为胃癌基因治疗提供了新的思路.
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白血病干细胞分子调控机制及靶向治疗
白血病是脱离正常分化轨道具有克隆形成能力的细胞在时间和空间上应该凋亡而未发生凋亡,并呈现克隆性增殖和浸润其他脏器的一种恶性血液病.发生血液病主要有两个前提条件:一是白血病干细胞(LSC)的出现,二是患者免疫功能不能清除LSC和(或)不能控制其增殖.
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下调FoxM1蛋白的表达对子宫颈癌裸鼠移植瘤生长及侵袭的作用
近的统计表明,仅2014年,美国子宫颈癌的新发病例就有12360例,4020例患者死于子宫颈癌,其在女性恶性肿瘤的发病率中列第3位[1]。随着目前对肿瘤分子发病机制的深入研究,子宫颈癌的基因靶向治疗有望成为治疗子宫颈癌的新模式。叉头框蛋白(forkhead box protein,Fox) M1是一个转录因子,属于进化保守的Fox家族的一员[2]。本课题组的前期研究证实,FoxM1在子宫颈癌组织中呈高表达,且癌组织中FoxM1基因的表达水平与病理分级、临床分期呈正相关[3];在体外实验中,下调FoxM1基因表达可抑制子宫颈癌细胞的增殖及克隆形成能力[4]。本研究在此基础上,探讨下调FoxM1蛋白对裸鼠移植瘤生长的作用,并进一步研究其对肿瘤侵袭能力的影响,为以FoxM1基因为靶点的子宫颈癌治疗提供新的依据。
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DCS细胞中SRS19-6白血病病毒3’-cDNA序列的克隆
利用本室建立的树突状细胞肉瘤(dendritic cell sarcoma,DCS)细胞系免疫Lou/c大鼠,制 备了细胞膜蛋白单克隆抗体983D4,该抗体具有小鼠肿瘤细胞的特异性,能抑制体外细胞生 长 速度,降低克隆形成能力[1]。为了得到其cDNA序列,本工作构建了DCS细胞cDNA表 达文库并用983D4单抗进行了免疫学筛选。1 材料与方法1.1 细胞总RNA的提取及cDNA合成 用异硫氰酸胍-酚-氯仿抽提一步法 [2]提取DCS细胞总RNA,oligo-dT纤维素层析柱(Gibco-BRL)分离mRNA后,按照Gibc o-BRL公司逆转录试剂操作说明,分别用MMLV逆转录酶和E.coli DNA聚合酶I作用下合成cD NA第一、二链,Sephacryl S-400离心柱除去小分子cDNA。
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细胞密度与细胞增殖关系的初步分析
目的:探讨细胞密度对细胞克隆形成能力的影响.方法:利用平板克隆形成实验检测五种细胞系BT325、786-0、293、C6和MH3T3的克隆形成能力,分析细胞密度或细胞数量对这些细胞系的克隆形成能力及细胞周期的影响.结果:细胞密度增加时,明显降低NIH3T3和786-0细胞系中具有克隆形成能力的细胞数,更高的细胞密度才能导致293细胞系的克隆形成能力下降.细胞密度的增加对BT325和C6这两种细胞系的克隆形成能力无明显影响.细胞周期分析表明,细胞密度对于BT325、C6以及293的细胞周期无明显影响,但能明显增加786-0和NIH3T3的G1期细胞比例,减少S期细胞比例.细胞密度可影响这五种细胞系的细胞周期和克隆形成能力,且两者关系密切.结论:可能存在一种与细胞数量相关的因素能抑制干细胞(包括肿瘤干细胞)的扩增.另外,在永生化细胞系中,干细胞的扩增频率与细胞的有丝分裂频率基本一致.
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氨磷汀治疗骨髓增生异常综合征的副作用观察与护理
骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome,MDS)为异常造血干细胞克隆性疾病,临床表现为不同程度的外周血细胞减少,病理特点示一系或多系细胞成熟障碍[1].氨磷汀是一种特异性的泛细胞保护剂,对MDS患者的骨髓具有明显的刺激造血作用,提高干细胞的克隆形成能力,使用推荐剂量的氨磷汀时,不良反应轻微,患者耐受性良好[2],一般不良反应为头晕、四肢酸软、乏力,主要不良反应为呕吐、低血压和血钙降低[3].2002年12月至2004年12月,本院采用氨磷汀治疗MDS患者31例,现将副作用的观察及护理报告如下.
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MGMT基因启动子去甲基化抑制MNU诱导的人胃上皮细胞恶性转化的机制研究
目的:研究O6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(MGMT)在N-甲基亚硝基脲(MNU)诱导的人胃上皮细胞恶性转化中持续激活的分子调控机制。方法:建立MNU诱导的人正常胃上皮细胞(GES-1)恶性转化模型,real-time PCR和Western blot检测建模中1周、4周和8周MGMT的动态表达水平。报告基因实验检测MGMT启动子区的转录激活。 MSP和BSP定性定量检测MGMT基因启动子区CpG的甲基化程度。 ChIP实验检测DNA甲基化转移酶( DNMT1)和H3K9met3、H3K4met2在MGMT基因转录激活中的作用。 Soft agar、平板克隆及细胞增殖实验检测MGMT基因表达上调在GES-1细胞恶性转化中的功能。结果:MNU诱导的GES-1恶性转化细胞中,MGMT的表达持续激活,但MGMT启动子区报告基因并不被激活。 MNU刺激显著抑制MGMT基因启动子区CpG的甲基化水平,同时抑制DNMT1与MGMT基因的结合,而且调控基因转录抑制和转录激活相关的组蛋白修饰类型H3K9met3与H3K4met2在该区域的富集分别减少和增加。此外,MGMT基因的高表达,抑制MNU诱导的GES-1恶性转化细胞的增殖和克隆形成能力,利用MGMT特异性抑制剂O6-BG处理细胞,显著促进MNU诱导的细胞恶性转化进程。结论:MNU通过诱导MGMT基因DNA去甲基化,持续激活其表达。 MGMT的表达上调抑制MNU诱导的人胃正常上皮细胞恶性转化。本研究揭示了MGMT基因在MNU诱导的细胞恶性转化中的表达调控机制,为进一步研究化学致癌物诱发肿瘤发生提供了新的实验依据。
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表观遗传修饰参与细胞恶性转化过程中FHIT基因的表达调控
目的:研究亚硝胺类致癌物诱导细胞恶性转化过程中抑癌基因FHIT的表达变化,明确其遗传及表观遗传调控机制。方法:建立N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍( MNNG)和N-甲基-N-亚硝基脲( MNU)暴露后胃黏膜上皮细胞GES-1的恶性转化模型。动态分析FHIT表达、基因缺失、DNA甲基化和组蛋白修饰变化。结果:MNNG和MNU暴露早期FHIT即明显下调,且与暴露剂量呈负相关。 FHIT低表达恶性转化单克隆细胞株克隆形成能力明显增强。外显子特异性PCR显示基因无纯合性缺失。甲基化特异性PCR显示FHIT基因甲基化水平增高,亚硫酸氢盐基因组测序证实FHIT启动子区呈明显高甲基化。组蛋白修饰分析发现FHIT低表达细胞株组蛋白H4乙酰化水平降低,组蛋白去乙酰化酶HDACs家族成员参与调控。结论:亚硝胺类致癌物诱导细胞恶性转化过程中FHIT基因在恶性变早期即下调,DNA甲基化和组蛋白修饰参与其表达调控。
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DNA甲基化参与细胞恶性转化过程中MGMT基因的表达调控
目的:研究O6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶( MGMT)在N-甲基亚硝基脲( MNU)诱导的人胃正常黏膜上皮细胞GES-1恶性转化中的表达变化,明确其转录激活的分子机制。方法:建立MNU诱导的GES-1细胞恶性转化模型,动态分析MGMT的表达、启动子转录激活、DNA甲基化、组蛋白修饰变化及其表达改变在GES-1细胞恶性转化中的作用。结果:MNU暴露持续激活MGMT的表达。 MGMT高表达细胞的增殖和克隆形成能力显著下降。甲基化特异性PCR显示MGMT基因甲基化水平下降,亚硫酸氢盐基因组测序证实其启动子区呈显著低甲基化。免疫共沉淀分析发现DNA甲基化转移酶( DNMT1)与MGMT基因的结合减少,组蛋白特异性修饰H3K9met3和H3K4met2均参与调控其表达。结论:MGMT的表达上调抑制化学致癌剂MNU诱导的细胞恶性转化,MGMT的持续激活依赖于其启动子区DNA的低甲基化。
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miR-630通过靶向MTDH抑制乳腺癌进程
目的:研究miRNA-630(miR-630)在乳腺癌中的表达水平及在乳腺癌发生发展中的功能。方法:采用反转录实时定量PCR方法对其在乳腺癌病人标本及乳腺癌细胞系中的表达进行检测;利用克隆形成实验、划痕实验、细胞迁移能力检测等方法对其在乳腺癌高转移细胞株MDA-MB-231及 BT549中的功能进行研究;利用慢病毒感染方法构建稳定表达miR-630的MDA-MB-231细胞株,研究其在小鼠体内转移能力;通过生物信息学分析、萤光素酶报告基因分析和Western blot方法对miR-630的靶基因进行筛选和鉴定。结果:miR-630在乳腺癌病人癌组织以及乳腺癌细胞株中的表达显著降低;在 MDA-MB-231和BT549细胞中过表达miR-630显著抑制细胞的克隆形成能力及迁移侵袭能力。在体内实验中,稳定过表达miR-630抑制MDA-MB-231细胞的肺转移能力。后, MTDH被鉴定为miR-630的靶基因,参与miR-630赋予细胞的各种功能。结论:miR-630通过靶向MTDH在乳腺癌的转移过程中发挥重要功能。
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IGF-FOXO3a通路对肝癌干细胞自我更新能力的调控
目的 探讨FOXO3a对肝癌干细胞(liver cancer stem cells,LCSCs)自我更新能力的调控作用以及其相关机制.方法 流式细胞仪分选获取肝癌干细胞,实时荧光定量PCR(real time fluorescent quantitative PCR,qRT-PCR)检测FOXO3a在肝癌干细胞中的表达情况;利用类胰岛素生长因子(insulin-like growth factor,IGF)的抑制剂或激活剂改变IGF活性,Western blot和qRT-PCR检测FOXO3a表达的改变;包装、纯化表达和干扰FOXO3a的慢病毒并进行细胞的感染,Western blot检测其过表达和干扰效率;采用细胞克隆形成实验和细胞成球生长能力实验检测过表达或干扰FOXO3a后细胞自我更新能力的改变,以及肝癌细胞中激活IGF信号,同时过表达FOXO3a后细胞自我更新能力的改变.结果 FOXO3a在肝癌干细胞中的表达明显低于肝癌细胞(P<0.01),并且受到IGF的负向调控;构建了稳定过表达和干扰FOXO3a的细胞模型,并发现过表达FOXO3a后,细胞的克隆形成能力和成球生长能力均降低,而干扰FOXO3a后,细胞的克隆形成能力和成球生长能力均得到了提升;激活IGF信号,同时过表达FOXO3a后,细胞的克隆形成能力和成球生长能力下降.结论 FOXO3a对肝癌干细胞的自我更新能力具有负向调控作用,且可受到IGF的负调节,并介导IGF对肝癌干细胞的自我更新能力的调控.