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抗人DR4、DR5单克隆抗体诱导神经胶质瘤细胞凋亡的实验研究
目的:探讨抗死亡受体DR4、DR5单克隆抗体(mAb)FMU1.4、FMU1.5对3株神经胶质瘤细胞株U343(敏感株)、U138(部分敏感株)、U373(耐受株)的杀伤作用及机制.方法:采用流式细胞术、RT-PCR、免疫细胞化学法、MTT比色法、电泳、DNA倍体分析和Western blot等方法.结果:DR5在U343高表达;DR4在U373低表达,U343对FMU1.5敏感并呈剂量依赖性、对FMU1.4部分敏感; U138对FMU1.5部分敏感, 对FMU1.4耐受;U373对两种抗体耐受.结论:FMU1.4、FMU1.5能不同程度地诱导三株细胞凋亡, 其机制与DR4、DR5、细胞色素C和FLIP的表达有关.
关键词： 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 死亡受体 凋亡 -
TRAIL对肿瘤侵润CD4+CD25+Treg的调节作用
目的:探讨TRAIL对肿瘤侵润CD4+CD25+Treg细胞的调节作用.方法:ELISA检测TRAIL对肿瘤细胞分泌CCL22的影响;建立对TRAIL耐受的4T1肿瘤细胞皮下实体瘤模型,瘤内给予重组TRAIL蛋白,检测肿瘤体积的变化;分离肿瘤侵润的淋巴细胞,采用流式细胞术检测瘤内CD4+CD25+Treg细胞的变化.结果:TRAIL引起肿瘤细胞4T1和B16培养上清中CCL22水平增加;TRAIL治疗组与对照组相比,对TRAIL耐受的4T1移植瘤体积没有明显变化,但TRAIL治疗组的肿瘤侵润CD4+CD25+Treg细胞显著增加.结论:TRAIL引起肿瘤细胞分泌CCL22,可因此诱导CD4+CD25+Treg细胞趋化至肿瘤部位导致肿瘤侵润的CD4+CD25+Treg比例增加,为TRAIL的生理功能和在肿瘤治疗中的应用提供了新的资料.
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抗人DR5单克隆抗体——mDRA-6与顺铂协同杀伤白血病细胞HL-60作用研究
目的:观察抗死亡受体5(Death receptor 5,DR5)单克隆抗体--mDRA-6与顺铂(DDP)对HL-60细胞的协同杀伤作用.方法:DR5蛋白免疫BALB/c小鼠,融合筛选抗DR5杂交瘤细胞,制备抗DR5单抗--mDRA-6;流式细胞术测定顺铂对HL-60细胞表面DR5表达及细胞凋亡率;荧光显微镜下观察mDRA-6与顺铂协同作用下HL-60细胞形态变化;MTT法测定不同浓度的顺铂与mDRA-6对HL-60细胞存活的影响;琼脂糖凝胶电泳检测mDRA-6与顺铂联合对HL-60细胞DNA片段化的影响.结果:顺铂可诱导HL-60细胞表面DR5表达增加,mDRA-6与顺铂联用致HL-60细胞出现染色质浓缩、断裂,细胞出芽,凋亡小体形成等细胞凋亡形态学变化;250 ng/ml的mDRA-6作用于HL-60细胞10小时,细胞凋亡率为16.61%;0.16 μg/ml的DDP作用于HL-60细胞10小时,细胞凋亡率为2.35%;二者联合作用后,HL-60细胞凋亡率增至57.10%;mDRA-6与DDP联合作用HL-60细胞,DNA琼脂糖凝胶电泳显示明显"梯形"条带.结论:抗DR5单抗--mDRA-6与DDP对HL-60细胞具有强大的协同杀伤作用.
关键词： 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 死亡受体 单克隆抗体 顺铂 -
FasL、抗人DR5单克隆抗体诱导肿瘤细胞凋亡的研究
目的:探讨FasL、Anti-DR5 mAb对肿瘤细胞Hela、BGC823、MCF-7、L342、H9101、D6的杀伤作用及机制.方法:采用RT-PCR、MTT比色法、电泳、DNA倍体分析、Western blot等方法.结果:H9101、Hela细胞株DR5 mRNA水平有表达,D6细胞无表达;H9101、L342细胞株Fas mRNA水平有表达,D6细胞无表达.H9101、L342细胞株对FasL、Anti-DR5 mAb敏感并呈剂量依赖性;MCF-7、BGC823细胞株对FasL敏感,对Anti-DR5 mAb相对敏感.Hela对FasL相对敏感,对Anti-DR5 mAb敏感;D6对两种凋亡诱导剂耐受.结论:FasL、Anti-DR5 mAb能不同程度地诱导肿瘤细胞凋亡, 其机制与Fas、DR5、Caspase-8、Bcl-2的表达有关.
关键词： FasL 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 死亡受体 凋亡 -
c-Flip的基因表达在肝癌细胞对TRAIL诱导凋亡耐受中的作用
目的:观察c-Flip基因的表达变化在肝癌细胞对TRAIL诱导凋亡耐受中的作用.方法:以肝癌细胞HepG2、Hep3B为研究对象,制备c-FlipsiRNA的细胞模型,应用流式细胞仪分析两种细胞模型对TRAIL作用后细胞周期的变化,Western blot检测其在c-Flip基因沉默前后凋亡信号传导蛋白Caspase-8、Caspase-3等的表达变化.结果:转染c-FlipsiRNA后,细胞恢复了对TRAIL诱导凋亡的敏感性,当TRAIL浓度为100 ng/ml时,HepG2及Hep3B转染组的细胞生存率为57.34%±6.13%和43 98%±4.54%,显著低于对照组的96.44%±5.43%和101.85%±6 41%(P＜0.01);细胞生存周期SubG1期为74 68%±6 95%和78.34%±7.64%,显著高于对照组的0.78%±0.07%和3.62%±0.38%(P＜0.01),转染组TRAIL单独作用,可以引起HepG2siRNA及Hep3BsiRNA凋亡传导通路上传导蛋白Caspase-8、Caspase-3的裂解.结论:肝癌细胞对TRAIL诱导凋亡的耐受可能与其传导通路上c-Flip蛋白的表达相关,抑制其表达可以导致凋亡传导蛋白Caspase-8、Caspase-3的裂解,促使凋亡的发生,恢复肝癌细胞对TRAIL诱导凋亡的敏感性.
关键词： 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 肝细胞肝癌 细胞内抑制蛋白 凋亡 -
TRAIL与DDP联合诱导急性淋巴细胞白血病Jurkat细胞凋亡的实验研究
目的 探讨肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)与顺铂(DDP)联合应用对急性淋巴细胞白血病细胞的抑制作用,为白血病的临床治疗提供新思路.方法 构建重组载体pACCMV-TRAIL,用脂质体法进行细胞转染,MTT法检测单独或联用TRAIL及DDP处理的各组肿瘤细胞的增殖变化,FCM技术检测细胞凋亡变化. 结果 DDP组、TRAIL转染组及联合用药组细胞增殖抑制率均高于空白对照组(均P＜0.05),且联合用药组高于单独用药组(P＜0.05);FCM示凋亡率也明显增高.结论 TRAIL和DDP联用可抑制急性淋巴细胞白血病细胞增殖,具有协调作用.
关键词： 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 顺铂 急性淋巴细胞白血病 凋亡 -
TRAIL联合顺铂诱导胶质瘤细胞凋亡的机制
作为新型的抗肿瘤药物,肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)已进入临床Ⅱ期试验阶段[1].研究发现,TRAIL可以诱导包括胶质瘤在内的多种肿瘤细胞发生凋亡,但大多恶性胶质瘤细胞对TRAIL耐药[2].前期研究的实验发现,原代培养的胶质瘤细胞对TRAIL诱导凋亡的敏感性不同,检测发现死亡受体(DR)5的表达量不同,并当TRAIL与化疗药物联合作用后可发挥协同作用[3～5].因此,本文进一步对TRAIL与化疗药物联合作用诱导胶质瘤细胞凋亡的机制进行研究,为TRAIL作为肿瘤治疗新药提供新的实验依据.
关键词： 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 顺铂 脑质瘤 -
原代培养的恶性胶质瘤细胞表达死亡受体与TRAIL抵抗的关系
肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体( TRAIL)是肿瘤坏死因子超家族中的一员,作为肿瘤治疗的新药,在美国已进入临床Ⅱ期试验阶段[1].但由于在肿瘤治疗研究中,TRAIL一直存在治疗抵抗,因此,本文对原代培养的恶性胶质瘤细胞进行研究,通过观察TRAIL的两种受体——死亡受体(DR)4、DR5在恶性胶质瘤细胞中的表达,探讨在原代培养肿瘤细胞中存在的TRAIL抵抗问题.
关键词： 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 恶性胶质瘤 -
caspase-8在胶质母细胞瘤抵抗TRAIL诱导凋亡中的作用
目的:对人脑胶质母细胞瘤SC189细胞株中单克隆细胞株进行研究,探讨caspase-8在胶质母细胞瘤抵抗肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)诱导凋亡分子机制中的作用.方法:获取SC189单克隆细胞株,应用酸性磷酸酶法检测SC189单克隆细胞株对TRAIL敏感性；Western blotting检测各单克隆细胞株表达FADD、DR5、DR4及caspase-8情况；经TRAIL作用后发生caspase-8、caspase-3、caspase-9、DFF-45凋亡级联裂解反应情况.结果:获得的5株SC189单克隆细胞株,经不同浓度TRAIL作用后细胞死亡率为-5.25%～45.80%,其中4株对TRAIL抵抗,1株对TRAIL相对敏感；Western blotting检测发现FADD、DR5、DR4表达相似,caspase-8表达不同,发生抵抗的细胞株caspase-8表达明显减少,经TRAIL作用后不发生凋亡级联裂解反应；相对敏感的细胞株caspase-8表达增多,经TRAIL作用后可出现明显的凋亡级联裂解反应.结论:SC189单克隆细胞株中caspase-8表达量直接与TRAIL反应敏感性有关联.
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辐射诱导表达载体pshuttle-Egr1-shTRAIL对肝癌SMMC7721细胞生长的抑制作用
目的:研究携带可溶性人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(shTRAIL)基因的辐射诱导表达载体pshuttle-Egr1-shTRAIL在人肝癌细胞株中的表达及其促凋亡作用.方法:体外通过脂质体转染SMMC7721细胞.转染细胞分别接受0(假照组)、2、5和10 Gy X线照射,ELISA法检测sTRAIL的表达；细胞分为正常SMMC7721组,分别接受0(假照组)、2和5GyX线照射的转染空质粒pshuttle-Egr1组及转染重组质粒pshutlle-Eyr1-shTRAIL组,采用AnnexinV-FITC凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡率；分别取SMMC772细胞、转染STRAIL细胞、转染空载体及照射组细胞,采用克隆形成实验检测细胞存活率.结果:不同剂量X射线照射SMMC7721-shTRAIL细胞上清中可溶性TRAIL表达量明显高于假照组(P＜0.001)；与假照组比较,照射转染后SMMC7721细胞的凋亡细胞百分数明显增加(P＜0.05或P＜0.001),细胞存活率明显下降(P＜0.05或P＜0.001).结论:pshuttle-Egr1-shTRAIL载体联合放射治疗能够显著抑制肝癌细胞SMMC7721细胞的生长,并促进其凋亡.
关键词： 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 基因克隆 肝肿瘤 辐射 早期生长反应1 -
恶性胶质瘤细胞死亡诱导信号复合体表达与TRAIL诱导凋亡的关系
目的:通过研究恶性胶质瘤细胞中死亡诱导信号复合体(DISC)与肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)诱导凋亡的关系,初步探讨TRAIL诱导凋亡抵抗的机制.方法:分离恶性胶质瘤组织,获得和培养原代胶质瘤细胞,用100 μg·L-1 TRAIL作用后采用酸性磷酸酶法检测细胞凋亡水平；Western blotting法检测细胞表达死亡诱导信号复合体的水平.结果:获得3株(GC417、GC321、GC125)原代恶性胶质瘤细胞；3株细胞对TRAIL诱导凋亡的敏感程度不同[GC321(0.12±0.01 vs 0.51±0.02)和GC125(0.22±0.01 vs0.36±0.01)],对TRAIL诱导凋亡作用敏感,与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01)；而GC417(0.24±0.01vs 0.23±0.02)对TRAIL诱导凋亡不敏感.Western blotting法检测结果显示,死亡诱导信号复合体表达不同,GC321和GC125表达增高,GC417表达减少.结论:不同来源的原代培养恶性胶质瘤细胞对TRAIL诱导凋亡的反应不同,死亡诱导信号复合体表达也不同,死亡诱导信号复合体表达的减少可能与凋亡抵抗的发生密切相关.
关键词： 胶质瘤 死亡诱导信号复合体 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 细胞凋亡 -
PI3K特异性抑制剂LY294002增强rsTRAIL蛋白对A549细胞的杀伤作用
目的：探讨磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）参与非小细胞肺癌A549细胞株抵抗重组可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（rsTRAIL）蛋白诱导凋亡的机制，寻找增强 rsTRAIL 蛋白杀伤非小细胞肺癌细胞的新方法。方法：选取对数生长期 A549细胞，随机分为 rsTRAIL蛋白组和 PI3K特异性抑制剂 LY294002联合 rsTRAIL蛋白（LY294002＋rsTRAIL蛋白）组。MTT法检测2组 A549细胞生长抑制率，流式细胞技术检测2组 A549细胞周期和细胞凋亡的变化，蛋白质印迹法检测2组 A549细胞中 p-Akt（Ser473）、c-FLIPL、Bcl-2和 Bax蛋白表达水平。结果：与 rsTRAIL蛋白组（5.16％±0.32％）比较，LY294002＋rsTRAIL蛋白组 A549细胞生长抑制率（74.6％±2.63％）明显升高（P＜0.05）。与 rsTRAIL 蛋白组比较，LY294002＋rsTRAIL 蛋白组处理2 h 后G0/G1期A549细胞百分比增加（P＜0.05），S 期细胞百分比降低（P＜0.05）。LY294002＋rsTRAIL 蛋白组A549细胞凋亡率为（61.50±3.02）％，显著高于 rsTRAIL蛋白组（3.21％±0.96％）（P＜0.05）。蛋白质印迹检测，与 rsTRAIL蛋白组比较，LY294002＋rsTRAIL蛋白组 A549细胞中 p-Akt、c-FLIPL和Bcl-2蛋白表达水平降低（P＜0.05），Bax/Bcl-2比值升高（P＜0.05）。结论：LY294002能够抑制 PI3K活性，增强 rsTRAIL蛋白对A549细胞的杀伤作用。
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肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体对非小细胞肺癌细胞凋亡的诱导作用及其机制
目的:探讨肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)诱导人非小细胞肺癌H596细胞发生凋亡,初步阐明非小细胞肺癌细胞经TRAIL诱导凋亡的作用和机制.方法:培养H596细胞,设对照组和不同浓度(0.01、0.03、0.10、0.30、1.00、3.00、10.00、30.00和100.00 μg·L-1)TRAIL组,TRAIL作用H596细胞24 h后,酸性磷酸酶法检测细胞凋亡的百分率；Western blotting法检测TRAIL相关蛋白caspase-8、Bcl-2及Fas相关死亡结构域(FADD)的表达情况.结果:TRAIL浓度为0.01～0.03 μg·L-1时,对H596细胞的生长无明显抑制作用,细胞出现增殖趋势；从0.10 μg·L-1开始,随着TRAIL浓度升高,细胞开始出现凋亡,至10.00 μg·L-1时细胞凋亡水平显著增加,与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05).Western blotting检测,caspase-8、Bcl-2和FADD蛋白表达正常.结论:高浓度的TRAIL可以诱导H596细胞发生凋亡,可能与TRAIL相关蛋白表达正常有关联.
关键词： 癌 非小细胞肺 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 细胞凋亡 -
乏氧/辐射双敏感启动子介导分泌型人TRAIL基因载体的构建及表达
目的:构建乏氧(HRE)/辐射(Egr1)双敏感启动子介导的分泌型人TRAIL(shTRAIL)基因表达载体pcDNA3.1-HRE-Egr1-shTRAIL,观察乏氧和辐射对其表达的影响.方法:利用化学合成HRE上、下链,PCR扩增得到双链HRE;pMD19T-Egr1经Sac Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切得到Egr1;pshuttle-shTRAIL经Kpn Ⅰ和BarnH Ⅰ双酶切得到shTRAIL;利用基因重组技术构建含有HRE/Egrl双敏感启动子介导shTRAIL 的表达载体pcDNA3.1-HRE-Egr1-shTRAIL,经酶切、PCR和测序鉴定正确.肺腺癌A549细胞分为正常组、乏氧组(1%)、照射组(6 Gy)和乏氧加照射组;表达载体转染肺腺癌A549细胞,RT-PCR及ELISA法检测shTRAIL的表达.结果:BamH Ⅰ和Sma Ⅰ酶切,所得片段大小分别为1 284和4 998 bp、2 292和3 990 bp;以Egr1和shTRAIL引物PCR扩增该载体,得到469和820 bp产物;将pcDNA3.1-HRE-Egr1-shTRAIL进行测序,所得结果与设计一致,说明构建正确.转染肺腺癌A549细胞后,乏氧组、辐射组及乏氧加照射组shTRAIL mRNA和蛋白表达增加,与对照组比较差异有显著性(P＜0.05),且乏氧加照射组表达更明显.结论:成功地构建了乏氧/辐射双敏感启动子介导分泌型人TRAIL基因表达的载体pcDNA3.1-HRE-Egr1-shTRAIL;乏氧及照射能够诱导TRAIL表达增加,且二者具有协同作用.
关键词： 乏氧/辐射 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 基因重组 -
t(17;19)-急性淋巴细胞白血病细胞对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的敏感性及其意义
目的:观察t (17; 19)-急性淋巴细胞白血病(ALL)细胞对肿瘤坏死因子(TNF)相关凋亡诱导配体(TRAIL)所介导的细胞毒的敏感性及可能机制,并探讨其临床意义.方法:以t(17; 19)-ALL细胞株4株、1例t (17; 19)-ALL患者骨髓标本为实验组,其他ALL细胞株28株为对照组.流式细胞术测定细胞表面TRAIL受体表达;重组人可溶性TRAIL (rhsTRAIL)作用后,3H-thymidine法测定其对细胞增殖的影响;FITC标记的Annexin-V染色及流式细胞术检测细胞早期凋亡;免疫印迹法观察细胞凋亡通路变化(caspase-8、Bia、caspase-3和PARP的表达).结果:t(17; 19)-ALL细胞表面死亡受体4(DR4)表达水平明显高于其他各组细胞株(P＜0.05),死亡受体5 (DR5)表达水平高于MLL+-ALL细胞株(P＜0.05),诱骗受体1(DcR1)和诱骗受体2 (DcR2)均呈阴性表达;rhsTRAIL浓度为100 μg·L-1时,t (17; 19)-ALL细胞抑制率接近100％,显著高于其他各组细胞株(P＜0.05或P＜0.01),该抑制作用在加入TRAIL中和抗体RIK-2及caspase广谱抑制剂z-VAD-fmk后被阻断;加入rhsTRAIL后,t(17; 19)-ALL细胞发生早期凋亡,其凋亡率明显高于对照组细胞株(P＜0.05); rhsTRAIL作用2h内,caspase-8、Bid、caspase-3和PARP出现活化条带.结论:t (17; 19)-ALL细胞株对TRAIL高度敏感,并终对移植物抗白血病(GVL)效应敏感,t (17; 19)-ALL患者为获得长期存活,应及早进行同种造血干细胞移植(allo-SCT).
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胃癌细胞TRAIL耐药机制以及TRAIL联合化疗应用的研究进展
肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)通过多种分子信号通路触发肿瘤细胞的凋亡,而胃癌细胞却可通过多种机制抵抗这种凋亡.TRAIL与化疗药物联合应用可明显逆转胃癌细胞对TRAIL的耐药现象.本文就TRAIL及其受体的结构和功能、TRAIL诱导凋亡的信号通路、胃癌细胞的TRAIL耐药机制以及其联合化疗药物的疗效进行综述.
关键词： 胃肿瘤 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 抗药性 信号通路 联合治疗 -
肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体与肝癌细胞凋亡
肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体TRAIL是近年来发现的极具潜力的抗肿瘤药物,尽管TRAIL对大多数肿瘤细胞表现出强大的诱导凋亡作用,但几乎所有的肝细胞肝癌(HCC)细胞系均对TRAIL表现出不同的耐药性.c-FLIP的过度表达及Caspase-8低表达可能是HCC细胞系耐受TRAIL的主要机制,NF-êB途径的激活及死亡受体的表达不足也参与了这一耐受过程.化疗药物及其他一些生物制剂联合TRAIL可以改变HCC细胞对TRAIL的敏感性,大大提高了TRAIL应用于肝癌临床治疗的可能性.
关键词： 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 癌 肝细胞 凋亡 -
肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体和顺铂对Hela细胞的诱导凋亡作用
目的 观察不同浓度的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)和顺铂对Hela细胞的诱导凋亡作用.方法 采用不同浓度的TRAIL作用于Hela细胞24 h,TRAIL 100 ng/mL、顺铂10 μmol/L及两者联合作用于细胞24 h,应用ELISA方法检测细胞凋亡率.结果 不同浓度的TRAIL作用于细胞后,细胞凋亡率分别是10.91%、16.84%、22.79%、28.62%、34.85%,TRAIL、顺铂、及联合作用后Hela细胞的凋亡率分别为28.07%、46.13%、75.51%.结论 同浓度的TRAIL对Hela细胞诱导凋亡发生具有明显的量-效关系,与顺铂联合应用可增加细胞对药物的敏感性.
关键词： 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 Hela细胞 凋亡 -
PI3K/AKT信号在增强乳腺癌细胞对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体敏感性中的作用及其机制
目的 分析磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol3 kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)通路是否通过长细胞caspase-8样抑制蛋白(cellular FLICE inhibitory protein,c-FLIP-L)的介导来影响乳腺癌细胞对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF related apoptosis inducing ligand,TRAIL)的敏感性,并探讨其机制.方法 用40 nmol/L wortmannin(AKT活化的特异性抑制剂)、100 ng/ml TRAIL、40 nmol/L wortmannin+100 ng/ ml TRAIL处理人乳腺癌MDA-MB-231细胞,并设空白对照组.MTT法检测药物作用24、48、72 h后的细胞增殖抑制率;流式细胞术检测药物作用48 h后的细胞凋亡率;Westem blot法检测细胞中磷酸化AKT(pAKT)和c-FLIP-L的表达.结果 TRAIL+ wortmannin组24、48和72 h细胞增殖抑制率与其他组比较,均明显升高(P＜0.05);TRAIL+wortmannin组与TRAIL组和wortmannin组比较,可明显促进细胞凋亡(Jp＜0.05);随着wortmannin作用时间的延长,pAKT的表达水平明显降低,同时c-FLIP-L的表达水平也随之下降,而TRAIL对pAKT和c-FLIP-L的表达无明显影响.结论 抑制PI3K/AKT通路可增强乳腺癌细胞对TRAIL的敏感性,这种作用可能是通过c-FLIP-L的介导来实现的.
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重组hTRAIL腺病毒载体的构建及鉴定
目的 构建表达hTRAIL基因的重组腺病毒载体.方法 以重组质粒pThioHisA-TRAIL中提取的TRAIL基因为模板,采用PCR法扩增基因片段.将扩增的基因片段插入穿梭质粒pShuttle-CMV,并转化大肠肝菌DH5α.筛选重组质粒pShuttle-CMV-TRAIL,电转化已转化了pAdEasy-1的BJ5183细胞.筛选重组腺病毒质粒pAdEasy-TRAIL,用Lipofectamine转染293细胞,制备携带人全长TRAIL基因的重组复制缺陷型腺病毒(Ad-TRAIL).氯化铯密度梯度离心法纯化Ad-TRAIL病毒颗粒,并测定病毒滴度.采用RT-PCR法检测TRAIL基因在293细胞中的转录.以Ad-TRAIL转染YTMLC细胞,采用免疫荧光法和流式细胞术检测TRAIL基因的表达.结果 纯化后的Ad-TRAIL病毒颗粒数为2.77×1012VP/ml,感染性滴度为109.5(3.2×109)CCID50/ml.经RT-PCR扩增出约843bp的基因片段,与目的片段大小一致.流式细胞术和免疫荧光法均检测到TRAIL在YTMLC细胞中的表达,表达产物主要存在于细胞质中.结论 已成功构建了表达hTRAIL重组腺病毒载体,为肿瘤的基因治疗提供了依据.
关键词： 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 重组腺病毒 基因治疗 构建 鉴定
